Method Article

Анализ перевода в развивающемся мозге мыши с использованием полисомного профилирования

DOI:

10.3791/62088

⸱

May 22nd, 2021

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие мозга млекопитающих требует надлежащего контроля экспрессии генов на уровне перевода. Здесь мы описываем систему поликомного профилирования с помощью простой в сборке градиентной градиентной и фракционной платформы для оценки трансляционного состояния мРНК в развивающемся мозге.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Правильное развитие мозга млекопитающих опирается на тонкий баланс пролиферации нервных стволовых клеток и дифференциации на различные типы нервных клеток. Этот баланс жестко контролируется экспрессией генов, которая достроена на нескольких уровнях, включая транскрипцию, посткриптацию и перевод. В этой связи растущее количество фактических данных подчеркивает важную роль трансляционной регуляции в координации решений о судьбе нервных стволовых клеток. Полисомная фракционирование является мощным инструментом для оценки трансвеститного статуса мРНК как на глобальном, так и на индивидуальном уровне генов. Здесь мы представляем внутриутверенные полисомные профилирования трубопровода для оценки трансляционной эффективности в клетках из развивающейся коры головного мозга мыши. Мы описываем протоколы для подготовки градиента сахарозы, лиза тканей, ультрацентрифугации и дробного анализа переводного статуса мРНК.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время развития мозга млекопитающих, нервные стволовые клетки размножаются и дифференцируются для генерации нейронов иглии 1,2. Возмущение этого процесса может привести к изменениям в структуре и функции мозга, как видно из многих расстройств нейроразвития3,4. Правильное поведение нервных стволовых клеток требует организованного выражения конкретных генов5. В то время как эпигенетический и транскрипционные контроль этих генов был интенсивно изучен, последние результаты показывают, что регуляции генов на других уровнях также сп....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все виды использования животных контролировались Комитетом по уходу за животными в Университете Калгари. Мыши CD1, используемые для эксперимента, были приобретены у коммерческого поставщика.

1. Подготовка решений

ПРИМЕЧАНИЕ Для предотвращения деградации РНК, спрей рабочая скамья и все оборудование с RNase обеззараживание раствора. Для эксперимента используются советы без RNase. Все решения готовятся в воде без RNase.

  1. Подготовка циклохэксимида фондовый раствор (100 мг/мл) в DMSO и хранить при -20 градусов по Цельсию.
  2. Приготовьте раствор для запаса сахарозы 2,2 М, добавив 75,3 г сахарозы в воду ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В качестве демонстрации корковой лизат, содержащий РНК 75 мкг (с объединением из 8 эмбрионов), был разделен градиентом сахарозы на 12 фракций. Пики поглощения УФ-излучения на 254 нм определили фракции, содержащие 40S подразделение, 60S подразделение, 80S моносомы и полисомы(рисунок 4A). Анализ фракций западной помаркой для большого рибосомного подразделения, Rpl10 показал свое присутствие в 60S субъединицы (фракция 3), моносомы (фракция 4) и поликомы (фракции 5-12) (Рису.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поликом-профилирование является широко используемым и мощным методом оценки трансляционного статуса как на одном гене, так и на уровнегенома 14. В этом отчете мы представляем протокол полисомного профилирования с помощью домашней платформы и ее применения для анализа развивающейся коры мыши. Эта экономически эффективная платформа проста в сборке и генерации надежных, воспроизводимых градиентов сахарозы и полисомного профилирования с высокой чувствительностью.

Стоит отме.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась грантом NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018). Г.Я. является канадским научным кафедрой. S.K. финансировалась стипендией Mitacs Globalink Graduate Fellowship и стипендией аспиранта ACHRI.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 мл микропробирок без РНКAxygenMCT-150-C
10 см чашкаGreiner-Bio664160
1M MgCl2InvitrogenAM9530G
игла 21-23G иглаBD305193
2M KClInvitrogenAM8640G
шприц 30 млBD302832
тупой конец иглаVWR20068-781
Макетная платаThorlabsMB2530/M Бромофенол
синийSigma115-39-9
CD1 мышьCharles River Laboratory Щипцы
изогнутым наконечником Sigma#Z168785
циклогексимидSigma66-81-9
Программное обеспечение для сбора данных TracerDAQMeasurement Computing Цифровой
преобразовательMeasurement ComputingUSB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kitZymoR2070
Dithiothreitol (DTT)Bio-basic12-03-3483
DMSOBioshop67-68-5
Dumont No.5 щипцыSigma#F6521
Коллектор фракцийBio-RadМодель 2110
HBSSWisent311-513-CL
Линейный привод ступениRattmmotorCBX1605-100A
Люцифераза контроль РНКPromegaL4561
Maxima набор для синтеза кДНК первой нити ThemoFisherM1681
Миниатюрный V-образный зажимThorlabsVH1/M
Макетная плата мини-серииThorlabsMSB7515/M
Мини-серия Оптический столбThorlabsMS2R/M
Мини-серия Пьедестал держатель основанияThorlabsMBA1
NaClBio-basic7647-14-5
Нейробазальная средаGibco21103-049
Ø 12,7 мм алюминиевый столбThorlabsTRA150/M
ПарапленкаBemisPM992
PerfeCTa SYBR зеленый фастмиксQuanta BioCA101414-274
Фосфатный буферный раствор (PBS)Wisent311-010-CL
PuromycinBioshop58-58-2
Прямоугольный зажимThorlabsRA90/M
Прямоугольный & Oslash; 1/2" до & Oslash; Зажим для столба 6 ммThorlabsRA90TR/M Rnase
AWAYMolecular BioProducts7002
РНКазные наконечникиFrogga BioFT10, FT200, FT1000
РНКазы без водыWisent809-115-CL
РНазинPromegaN2111
Тонкий прямоугольный кронштейнThorlabsAB90B/M
Малый V-образный зажимThorlabsVC1/M
Дезоксихолат натрияSigma302-95-4
Драйвер шагового двигателяSongHeTB6600
SucroseBioshop57501
SW 41 Ti роторBeckman Coulter331362
Шприцевой насосHarvard Apparatus70-4500
Шприцевой насосHarvard Apparatus70-4500
Triton-X-100Bio-basic9002-93-1
TrizolThermofisher Scientific15596018
Прокалыватель пробирокBrandelBR-184
УльтрацентрифугаBeckman CoulterL8-70M
Ультрацентрифуга ПробиркиBeckman Coulter331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7,5Invitrogen15567-027
UNO project super starter kitElegooEL-KIT-003
UV мониторBio-RadEM-1 Econo
Вертикальный кронштейнThorlabsVB01A/M
с

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingTranslational RegulationMouse Brain DevelopmentSucrose GradientNeural Stem CellsmRNA TranslationUltracentrifugationFraction CollectionRibosomal SubunitsWestern Blot

Related Articles