Методическая статья

Эффективная и масштабируемая генерация вентральных астроцитов среднего мозга человека из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/62095

⸱

2 октября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем метод воспроизводимой генерации вентральных астроцитов среднего мозга из ИПСК и протоколы их характеризации для оценки фенотипа и функции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При болезни Паркинсона прогрессирующая дисфункция и дегенерация дофаминовых нейронов в вентральном среднем мозге вызывают симптомы, изменяющие жизнь. Дегенерация нейронов при болезни Паркинсона имеет различные причины, в том числе неклеточные автономные механизмы, опосредованные астроцитами. По всей ЦНС астроциты необходимы для выживания и функционирования нейронов, поскольку они поддерживают метаболический гомеостаз в нервной среде. Астроциты взаимодействуют с иммунными клетками ЦНС, микроглией, модулируя нейровоспаление, которое наблюдается с самых ранних стадий болезни Паркинсона, и оказывает непосредственное влияние на прогрессирование ее патологии. При заболеваниях с хроническим нейровоспалительным элементом, в том числе при болезни Паркинсона, астроциты приобретают нейротоксический фенотип, и тем самым усиливают нейродегенерацию. Следовательно, астроциты являются потенциальной терапевтической мишенью для замедления или остановки заболевания, но для этого потребуется более глубокое понимание их свойств и роли при болезни Паркинсона. Поэтому срочно требуются точные модели вентральных астроцитов среднего мозга человека для исследования in vitro.

Мы разработали протокол для получения культур высокой чистоты вентральных среднемозговых специфических астроцитов (vmAstros) из ИПСК и которые могут быть использованы для исследования болезни Паркинсона. vmAstros может быть рутинно получен из нескольких линий hiPSC и экспрессировать специфические астроцитарные и вентральные маркеры среднего мозга. Этот протокол является масштабируемым и, таким образом, подходит для приложений с высокой пропускной способностью, в том числе для скрининга лекарственных средств. Важно отметить, что vmAstros, производные от hiPSC, демонстрируют иммуномодулирующие характеристики, типичные для их аналогов in vivo, что позволяет изучать механистическую передачу нейровоспалительной сигнализации при болезни Паркинсона.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Болезнь Паркинсона поражает 2-3% людей старше 65 лет, что делает ее наиболее распространенным нейродегенеративным двигательным расстройством1. Он вызван дегенерацией вентральных дофаминовых нейронов среднего мозга в пределах черной субстанции, что приводит к изнурительным двигательным симптомам, а также к частым когнитивным и психиатрическим проблемам2. Патология болезни Паркинсона характеризуется агрегатами белка α-синуклеина, которые токсичны для нейронов и приводят к их дисфункции и гибели 1,2,3. Поскольку дофаминергические нейроны являются дегенеративной популяцией при болезни Паркинсона, они исторически были в центре внимания исследований. Тем не менее, очевидно, что другой тип клеток в мозге, астроциты, также демонстрируют аномалии при болезни Паркинсона и, как полагают, способствуют дегенерации в моделях болезни Паркинсона 4,5,6,7.

Астроциты представляют собой гетерогенную клеточную популяцию, которая может трансформироваться как физически, так и функционально по мере необходимости. Они поддерживают функцию и здоровье нейронов с помощью множества механизмов, включая модуляцию нейронной сигнализации, формирование синаптической архитектуры и трофическую поддержку нейронных популяций посредством секреции специфических факторов 6,8,9,10. Тем не менее, астроциты также играют существенную иммуномодулирующую роль, являясь неотъемлемой частью развития и распространения нейровоспаления 10,11. Нейровоспаление наблюдается в мозге пациентов с болезнью Паркинсона, и недавно было показано, что оно значительно предвосхищает появление симптомов болезни Паркинсона 12,13,14,15, тем самым занимая центральное место в исследованиях болезни Паркинсона.

На клеточном уровне считается, что астроциты становятся реактивными в ответ на травму, инфекцию или болезнь в попытке облегчить нейропротекцию 9,6,10,16. Реактивность описывает сдвиг в фенотипе астроцитов, характеризующийся изменениями в экспрессии генов, секретоме, морфологии и механизмах выведения клеточного мусора и токсичных побочных продуктов 9,10,11,17. Этот реактивный сдвиг происходит в ответ на индуктивные сигналы от микроглии, которая является иммунными клетками ЦНС и первыми реагирует на травмы и болезни9. Как астроциты, так и микроглия реагируют на воспалительные сигналы, замедляя свою собственную функцию, и могут трансдуцировать воспалительные сигналы и, таким образом, напрямую влиять на нейровоспаление 9,10. Тем не менее, хронический характер болезни Паркинсона приводит к переходу, когда реактивные астроциты становятся токсичными для нейронов и сами способствуют дегенерации и патологии заболеваний 6,9,10,18,19. Важно отметить, что недавно было продемонстрировано, что блокирование трансформации астроцитов в реактивный нейротоксический фенотип предотвращает прогрессирование болезни Паркинсона в животных моделях11. Таким образом, реактивность астроцитов в парадигме нейровоспаления стала основным направлением исследований болезни Паркинсона и также связана с широким спектром заболеваний ЦНС. Вместе эти результаты создают картину значительного участия астроцитов в этиологии болезни Паркинсона, подчеркивая необходимость точных исследовательских моделей, которые повторяют фенотип популяций астроцитов человека, вовлеченных в болезнь Паркинсона.

В эмбриональном мозге нейроны появляются первыми, а астроглиальная линия, а именно астроциты и олигодендроциты, появляются на более позднихэтапах развития. Исследования in vivo и in vitro выявили ряд сигнальных путей, которые, по-видимому, контролируют активность нейронных клеток-предшественников от нейрональных до астроглиальных производных. В частности, сигнализация JAK/STAT, EGF и BMP играют роль в пролиферации, дифференцировке и созревании астроглии20,21. Эти пути были в центре внимания протоколов in vitro для получения астроцитов из плюрипотентных клеток, включая hiPSC 6,22,23. Существует множество успешных примеров получения астроцитов из ИПСК 6,24,25. Тем не менее, очевидно, что in vivo астроциты в ЦНС обладают специфическими регионарными идентичностями, которые непосредственно связаны с их функцией, в соответствии со специфическими потребностями этих астроцитов по отношению к их специализированным нейронным соседям 17,24,25,26. Например, в отношении конкретно вентрального среднего мозга было продемонстрировано, что астроциты в этой области экспрессируют специфические наборы белков, включая рецепторы дофамина, обеспечивающие связь с местной популяцией дофаминовых нейронов среднего мозга26. Кроме того, вентральные астроциты среднего мозга демонстрируют уникальные сигнальные свойства26. Поэтому для изучения роли вентральных астроцитов среднего мозга при болезни Паркинсона нам требуется модель in vitro, отражающая их уникальный набор характеристик.

Чтобы решить эту проблему, мы разработали протокол генерации вентральных астроцитов среднего мозга (vmAstros) из ИПСК. Полученные в результате vmAstros демонстрируют характеристики своих вентральных аналогов среднего мозга in vivo, такие как экспрессия специфических белков, а также иммуномодулирующие функции. Представленные результаты получены в результате дифференциации линий NAS2 и AST23 hiPSC, которые были получены и подарены нам доктором Тило Кунатом27. NAS2 был получен от здорового контрольного субъекта, в то время как AST23 получен от пациента с болезнью Паркинсона, несущего трипликацию в локусе, кодирующем α-синуклеин (SNCA). Эти линии hiPSC были ранее охарактеризованы и использованы в ряде опубликованных научных работ, в том числе для генерации различных типов нервных клеток 27,28,29,30,31.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Размораживание, поддержание и криоконсервация линии гиПСК человека

  1. Для нанесения покрытия на планшеты для культивирования hiPSC разбавьте витронектин до 5 мкг/мл (1:100) в PBS со скоростью 1 мл на 10 см2 площади поверхности планшета для культивирования клеток. Оставить на 1 час при комнатной температуре.
  2. Удалите витронектин и немедленно приступайте к добавлению ИПСК / среды в культуральный планшет.
    ПРИМЕЧАНИЕ При удалении витронектина из планшета крайне важно, чтобы поверхность культуры не высыхала.
  3. Чтобы разморозить иПСК, удалите криовалиалы, содержащие ИПСК из жидкого азота и поместите на водяную баню при температуре 37 °C до полного оттаивания содержимого.
  4. Приготовьте 9 мл предварительно подогретой среды для клеточных культур (например, E8 или E8 Flex), содержащей 1x клеточную добавку (например, Revitacell). Добавьте по 1 мл по каплям к содержимому криовиала. Поместите оставшиеся 8 мл среды в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте к этому разбавленное содержимое криовиала.
    ВНИМАНИЕ: Не растирайте содержимое.
  5. Центрифуга при 150 х г в течение 3 мин. Аспирируйте жидкость, не нарушая клеточную гранулу, и ресуспендируйте в соответствующем объеме среды для культивирования клеток (например, E8 или E8 Flex), содержащей 1x клеточную добавку (например, Revitacell). Например, 2 мл на лунку 6-луночного планшета.
  6. Добавьте ресуспендированные ИПСК в посуду, покрытую витронектином, и поместите в инкубатор с температурой 37 °C/5%CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК следует начинать прикреплять к пластиковой посуде с покрытием из витронектина через 30 мин-2 ч после размораживания.
  7. Поддерживайте уровень ИПСК в среде для культивирования клеток (например, E8 или E8 Flex). Ежедневно подавайте клетки путем обмена средами. Перед кормлением питательную среду всегда прогревайте за 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ При использовании E8 Flex гиПСК не требует смены среды каждые 24 часа, а при необходимости время подачи может быть увеличено до 48 часов. Из сред E8 Flex или E8 можно получить культуры hiPSC одинаково высокого качества. HiPSCs следует культивировать в течение как минимум 14 дней после размораживания и до начала этапов дифференцировки. Периоды культивирования менее 14 дней, по-видимому, негативно влияют на выживаемость ИПСК в течение начального периода дифференцировки. Пассаж иПСК примерно на 80% слияние (Рисунок 1A: 3-4-дневный интервал пассажа).
  8. За 1 ч до начала добавьте 1x клеточную добавку (например, Revitacell) в культуру hiPSC.
  9. Промойте ИПСК один раз PBS (без кальция или магния) и добавьте 0,5 мМ ЭДТА (разбавленного из поголовья в PBS без кальция или магния).
  10. Инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре или до тех пор, пока иПСК не начнут отделяться друг от друга и приобретать более округлый вид, при этом границы каждого ИПСК будут казаться ярче под светлым микроскопом.
  11. Добавьте 200 мкл ЭДТА в сфокусированную область гиПСК с помощью пипетки. Если они легко отделяются, оставляя свободное пространство в клеточном слое, то они готовы к сбору. Если они не сразу отделяются, оставьте в ЭДТА и повторите через 1 минуту.
  12. Когда все будет готово, аккуратно удалите ЭДТА и с помощью пипетки дважды осторожно промойте ИПСК клеточной питательной средой (например, E8 или E8 Flex).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы добиться этого без отсоединения иПСК, наклоните пластину и добавьте среду по каплям вниз по боковой стороне питательной пластины.
  13. Для сбора ИПСК используйте 1 мл клеточной питательной среды (например, E8 или E8 Flex), содержащей 1x клеточную добавку (например, Revitacell). Выпустите среду непосредственно на слой hiPSC, и ячейки должны отсоединиться. При необходимости повторите то же самое с другим 1 мл среды.
  14. Просмотрите иПСК под микроскопом. В идеале ИПСК должны проявляться в относительно однородных кластерах, как показано на рисунке 1B. Если кластеры hiPSC намного больше или очень изменчивы по размеру, используйте пипетку, чтобы разбить более крупные кластеры hiPSC (рис. 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не перетирайте ИПСК чрезмерно. Несмотря на то, что добавка увеличивает общую выживаемость клеток, чрезмерное растирание негативно влияет на выживаемость культуры ИПСК. Рекомендуется 1-4 прохода пипеткой.
  15. С помощью серологической пипетки перенесите суспензию гиПСК на пластину, покрытую витронектином, как это было приготовлено на шаге 1.1. Верните культуру гиПСК в инкубатор с температурой 37 °C/5%CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервируйте ИПСК при конфлюенции примерно 80%.
  16. За 1 ч до начала добавьте 1x клеточную добавку (например, Revitacell) в культуру hiPSC.
  17. Отделите гиПСК от культуральных планшетов с помощью 0,5 мМ ЭДТА, как описано в шаге 1.4, собирая клетки в среде для культивирования клеток (например, E8 или E8 Flex), содержащей 1x клеточную добавку (например, Revitacell). Центрифуга при 150 х г в течение 3 мин.
  18. Ресуспендируйте гранулированные ИПСК в средах для замораживания клеток (см. Таблицу материалов). Используйте 700 мкл на 10 см2 площади культивирования, что эквивалентно 1 криовиалу клеток на лунку 6-луночного планшета.
  19. Переложите криовиалы в соответствующий сосуд для заморозки клеток (подробнее см. Таблицу материалов).
  20. Переведите морозильную камеру в морозильную камеру с температурой -80 °C на 24 часа. Через 24 ч криовики можно переводить на жидкий азот (-196 °C) для длительного хранения.

2. Протокол дифференциации vmAstro

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое описание протокола дифференцировки vmAstros показано на рисунке 1A. Подробный перечень необходимых для протокола реагентов и их приготовления приведен в таблице 1.

  1. Индукция vmNPC
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован для начала с минимальной конфлюенции 1x лунки из 6-луночного планшета (10 см2) hiPSCs 70%-80%, что составляет примерно 4-5 x 104 клеток/см2 (Рисунок 1B)30. Количество и плотность исходных клеток должны быть оптимизированы для каждой линии hiPSC, поскольку это значительно влияет на выживаемость и эффективность дифференцировки.
    1. Удалите питательную среду для клеточных клеток из ИПСК и промойте 3 раза в DMEM/F12 + глутамакс. Замените носитель на индукционный носитель vmNPC объемом 2 мл (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH(C24ii) + LDN193189. Подробнее о подготовительных средах и реагентах см. в таблице 1 .
    2. Кормите через день с половинной сменой среды через 24 часа и полной сменой среды через 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через 3-4 дня культуре vmNPC потребуется пассирование. Рекомендуется использовать стандартное соотношение пассажа 1:3 или 1:4 - его необходимо оптимизировать для каждой используемой линии hiPSC.
    3. За 1 час до пассажа добавьте 1x клеточную добавку (например, Revitacell) к vmNPC и приготовьте 1x пластик для культуры тканей, покрытый матрицей базальной мембраны (например, Geltrex) (раздел 2.2 Подготовка матрицы базальной мембраны и нанесение покрытия на пластик культуры).
    4. Извлеките носитель из vmNPC и промойте 2 раза с помощью D-PBS. Добавьте 1 мл предварительно подогретого раствора для отслойки клеток (например, Аккутазы) на 10 см2 площади культуры (1 мл на лунку 6-луночного планшета).
    5. Поместите при температуре 37 °C на 1 минуту, а затем исследуйте vmNPC с помощью фазово-контрастного микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: vmNPC начнут округляться, их отростки снова втягиваются, а в клеточном слое появляются пробелы. Это может занять от 1 до 3 минут в зависимости от плотности клеток.
    6. Когда vmNPC приобретают такой вид, добавьте 100 μL раствора для отслоения клеток (например, Accutase) в слой vmNPC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если vmNPC готовы к отделению, в клеточном слое появится отверстие. Если этого не происходит, то vmNPC требуется дальнейшая инкубация с раствором для отслойки клеток.
    7. Если vmNPC легко отделяются, аккуратно удалите раствор для отсоединения клеток и промойте vmNPC 2x с помощью носителя N2B27. Аккуратно добавьте фильтрующий материал N2B27 на стенку лунки или емкости для культуры и аккуратно покрутите для промывки, следя за тем, чтобы vmNPC не отсоединились.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен быстро, чтобы гарантировать, что vmNPC не прикрепятся к поверхности клетки. Если vmNPC начинают отделяться на этапах промывки, соберите их с помощью центрифугирования при 150 x g в течение 3 мин. vmNPC не центрифугируются как обычно при прохождении, так как это может снизить их выживаемость.
    8. Наконец, удалите vmNPC с помощью пипетки, энергично выбрасывая индукционную среду vmNPC, содержащую 1x клеточную добавку (например, Revitacell), непосредственно на клеточный слой. Это должно привести к удалению vmNPC, которые затем могут быть перенесены непосредственно в новые культуральные сосуды, покрытые матричным покрытием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте повторно среды, уже содержащие ресуспендированные vmNPC, для удаления других клеток, так как это приведет к их чрезмерной тритурации, что снижает их выживаемость.
    9. Замените в инкубаторе при температуре 37 °C/5%CO2 . vmNPC должны начать прикрепляться к поверхности с матричным покрытием через 20-30 минут. Замените половину среды свежими индукционными средами vmNPC (без добавки клеток) через 24 ч и продолжайте график кормления, как и раньше.
    10. Продолжайте режим кормления и пассажа в течение 10 дней.
  2. Подготовка матрицы базальной мембраны и покрытие культуры тканей пластиком
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обслуживания vmNPC используется матрица базальной мембраны 1x (например, Geltrex) для покрытия пластиковых изделий. Для обслуживания vmAPC или vmAstros можно использовать матрицу базальной мембраны 0,25x.
    1. Выньте матрицу с базальной мембраной из морозильной камеры при температуре -80 °C и поместите в холодильник с температурой 4 °C на ночь для оттаивания.
    2. Разбавьте 1:10 ледяным DMEM/F12 + глутамакс, аликвотой и храните при -80 °C в 10-кратном запасе.
    3. При нанесении покрытия на пластиковую посуду разбавьте этот 10-кратный сток до 1x (для vmNPC) или 0,25x (для vmAPC или vmAstros) ледяным DMEM/F12 + глутамакс.
    4. Немедленно добавьте в тканевые культуры пластику из расчета 1 мл на 10 см2 , например, 1 мл на лунку 6-луночного планшета.
    5. Хранить при температуре 37 °C в течение 1 часа. Матричный раствор базальной мембраны не следует удалять с пластиковой посуды до тех пор, пока он не будет готов к добавлению среды/ячеек, чтобы пластиковая посуда с покрытием не высыхала. Пластины с матричным покрытием не требуют промывки перед добавлением ячеек.
  3. Расширение vmNPC
    1. На 10-й день протокола замените индукционную среду на среду расширения vmNPC (N2B27 + GDNF + BDNF + аскорбиновая кислота. Подробнее о подготовительных средах и реагентах см. в таблице 1 .
      Примечание: vmNPC не требуют добавления митогенов, чтобы индуцировать пролиферацию. BDNF, GDNF и аскорбиновая кислота поддерживают выживание и поддержание vmNPCs30.
    2. Кормите через день с половинной сменой среды через 24 часа и полной сменой среды через 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через 3-4 дня культуре vmNPC потребуется пассирование. Для пропускания рекомендуется использовать стандартное соотношение пропускания 1:3 или 1:4 (его необходимо оптимизировать для каждой используемой линии hiPSC). Определите соотношение, которое обеспечивает наилучшую выживаемость, пролиферацию и генерацию vmNPC).
    3. За 1 час до пассирования добавьте 1x клеточную добавку (например, Revitacell) к vmNPC и заранее подготовьте 1x матричные покрытые пластины/колбы (раздел 2.2 Подготовка матрицы базальной мембраны и покрытие из пластика для выпускаемой культуры). Предварительно подогрейте раствор для отслоения клеток (например, Аккутазу) до 37 °C. Предварительно подогрейте свежую расширяющую среду vmNPC, содержащую 1x клеточную добавку (например, Revitacell).
    4. Извлеките носитель из vmNPC и промойте 2 раза с помощью D-PBS. Добавьте 1 мл раствора для отсоединения клеток (например, Аккутазы) на 10 см2 площади культивирования (1 мл на лунку 6-луночного планшета). Поместите при температуре 37 °C на 1 минуту, а затем исследуйте vmNPC с помощью фазово-контрастного микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: vmNPC начнут округляться, их отростки снова втягиваются, а в клеточном слое появляются пробелы. Это может занять от 1 до 3 минут в зависимости от плотности клеток.
    5. Когда vmNPC приобретут округлый вид, добавьте 100 μL раствора для отслойки клеток (например, Accutase) на слой vmNPC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если vmNPC готовы к отделению, в клеточном слое появится отверстие. Если этого не происходит, то vmNPC требуется дальнейшая инкубация с раствором для отслойки клеток.
    6. Если vmNPC легко отделяются, аккуратно удалите раствор для отсоединения клеток и промойте vmNPC 2x с помощью носителя N2B27. Аккуратно добавьте фильтрующий материал N2B27 на стенку лунки или емкости для культуры и аккуратно покрутите для промывки, следя за тем, чтобы vmNPC не отсоединились.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если vmNPC начинают отделяться в больших количествах на этапах промывки, соберите с помощью центрифугирования при 150 x g в течение 3 мин. vmNPC не центрифугируются в стандартной комплектации при прохождении, так как это может снизить их выживаемость. Этот шаг должен быть выполнен быстро, чтобы гарантировать, что vmNPC не прикрепятся к поверхности клетки.
    7. Удалите vmNPC с помощью пипетки и энергично выбросьте расширяющую среду vmNPC, содержащую 1x клеточную добавку (например, Revitacell), непосредственно на клеточный слой. При этом vmNPC должны быть удалены, которые затем могут быть перенесены непосредственно в предварительно подготовленные пластины/колбы с матричным покрытием (см. раздел 2.2 «Подготовка матрицы базальной мембраны и покрытие пластика тканевой культуры»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте повторно среды, уже содержащие ресуспендированные vmNPC, для удаления других клеток, так как это приведет к их чрезмерной тритурации, что снижает их выживаемость.
    8. Замените в инкубаторе при температуре 37 °C/5%CO2 . vmNPC должны начать прикрепляться к поверхности с матричным покрытием через 20-30 минут. Через 24 ч замените половину питательных сред свежими расширяющими средами vmNPC (без клеточной добавки) и продолжайте прежний график кормления.
    9. Продолжайте такой режим кормления и пассажа в течение 10 дней. vmNPC могут быть расширены до 50-го дня.
  4. Дифференциация и расширение vmAPC
    ПРИМЕЧАНИЕ: vmNPC могут быть успешно использованы для генерации vmAPCs/vmAstros в любом месте от 30 до 50 дней с начальной стадии hiPSC (Рисунок 1A).
    1. Возьмите конфлюентную культуру vmNPC и промойте vmNPC 3 раза в усовершенствованном DMEM/F12, чтобы удалить следы компонентов среды расширения vmNPC. Замените носитель на носитель расширения vmAPC (носитель ASTRO + EGF + LIF. Подробнее о подготовительных средах и реагентах см. в таблице 1 .
    2. После 72-часового пассажа культура vmNPC находится в высоком соотношении (1:7,5). Например, предполагая, что vmNPC содержались в одной лунке 6-луночного планшета, теперь их следует пропускать в колбу 1x с покрытием из матрицы 75 см2 (с покрытием, как описано в разделе 2.2 «Подготовка матрицы базальной мембраны и покрытие пластикой культуры тканей»). Прохождение с использованием раствора для отделения клеток, как описано для vmNPC в разделе 2.3 «Экспансия vmNPC».
    3. Ресуспендируйте vmNPC в соответствующем объеме среды vmAPC Expansion (7,5-15 мл среды на 75 см2 колбы). Выполняйте смену носителей каждые 3 дня или по мере необходимости ячеек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента vmNPC называются vmAPC и должны передаваться как отдельные клетки, а не кластеры клеток. vmAPC следует пропускать каждые 3-7 дней или по мере их слияния, чтобы избежать чрезмерного слияния. Начиная с этого момента, для нанесения покрытия на пластиковые изделия следует использовать уменьшенную концентрацию матрицы 0,25x (как описано в разделе 2.2 «Подготовка матрицы базальной мембраны и покрытие пластика культуры тканей»).
    4. Расширяйте vmAPC до тех пор, пока они не достигнут 90-го дня (со стадии hiPSC), криоконсервируя vmAPC на различных этапах их расширения.
  5. Генерация зрелых vmAstro из vmAPC
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе vmAPC можно выращивать в колбах для культуры тканей размером 175 см2 . Эта возможность может быть расширена для генерации большого количества зрелых vmAstro.
    1. Когда vmAPC достигнет 80% конфлюенции, промойте 3 раза фильтрующим материалом ASTRO и замените его на фильтрующий материал vmAstros (фильтрующий материал ASTRO + BMP4 + LIF. Подробнее о подготовительных средах и реагентах см. в таблице 1 .
    2. Проводите полную смену среды каждые 3 дня или в зависимости от требований клеток в течение 10 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: a) На этом этапе определение характеристик указывает на то, что vmAstros являются зрелыми, что подтверждается иммуноцитохимией (рисунок 2G - I) и анализом экспрессии генов (рукопись в стадии подготовки). б) vmAstros, используемый сразу после созревания, должен быть повторно нанесен на вновь подготовленную поверхность с матричным покрытием. Хранение vmAPC или vmAstros на одной и той же поверхности культуры в течение более 14 дней может привести к неоптимальным культурам, когда клетки начинают уменьшаться в размерах и даже отделяться. в) При исследовании нейровоспалительной модуляции BMP и LIF удаляют за 72 ч до нейровоспалительной стимуляции. Это необходимо для того, чтобы избежать любого потенциального взаимодействия между передачей сигналов BMP/LIF и индуцированной нейровоспалительной сигнализацией.
    3. Теперь vmAstros можно повторно покрывать для экспериментальных анализов, например, на покровных стеклах для иммуноцитохимии или криоконсервировать для будущих применений (разделы 3, 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе протокола не должно быть необходимости в прохождении, поскольку распространение должно происходить только с очень низкой скоростью. Слишком плотно покрытые vmAPC на этой стадии поддерживают более высокие уровни пролиферации. Если это так, пассаж и разделение ячеек для достижения плотности, как показано на рисунке 1F.

3. Криоконсервация vmNPC, vmAPC и vmAstros

ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервация vmNPCs/vmAPCs/vmAstros при полном слиянии.

  1. За 1 час до начала добавьте в культуру 1x клеточную добавку (например, Revitacell). Наполните сосуд для криохранения (см. Таблицу материалов) изопропанолом при комнатной температуре.
  2. Отделите клетки от культуральных планшетов с помощью раствора для отслойки клеток, как описано выше, собирая клетки в соответствующих средах (N2B27 или ASTRO), содержащих 1x клеточную добавку (например, Revitacell). Центрифуга при 150 х г в течение 3 мин.
  3. Ресуспендируйте гранулированные vmNPCs/vmAPCs/vmAstros в средах для замораживания клеток (см. Таблицу материалов) следующим образом (шаги 3.3.1. - 3.3.3.):
    1. Для vmNPC: используйте 700 μл на 10 см2 площади культивирования, на 1 криовиальную область.
    2. Для vmAPC: используйте 700 μл на 60 см2 площади культивирования на 1 криовиальную (примерно 1/3 колбы для культур T175).
    3. Для vmAstros: повторно суспензируйте в 2 мл среды и посчитайте количество vmAstros. Повторно центрифугируйте и ресуспендируйте в средах для замораживания клеток (см. Таблицу материалов) в количестве на криовиал, подходящем для будущих применений. Предполагая, что приблизительная потеря клеток составляет 15% из-за замораживания-размораживания, только что размороженные vmAstro подсчитываются и покрываются 15% избыточным числом клеток, чтобы компенсировать гибель клеток в процессе замораживания-размораживания. Таким образом, это эквивалентно 74 750 vmAstros насм2. Размороженные vmAstro выдерживаются в течение 72 ч в среде ASTRO перед анализом.
  4. Переложите криовиалы в контейнер для заморозки клеток (подробнее см. Таблицу материалов) и переведите контейнер для заморозки в морозильную камеру при температуре -80 °C на 24 часа. Через 24 ч криовики можно переводить на жидкий азот (-196 °C) для длительного хранения.

4. Характеристика фенотипа vmAstro

  1. Иммуноцитохимия
    1. Поместите 100-200 стеклянных покровных стекол 13 мм в стеклянные чашки Петри на слой фильтровальной бумаги и простерилизуйте их в сухом автоклаве.
    2. Перенесите покровные стекла в лунки 4- или 24-луночных планшетов с помощью стерильных щипцов. Добавьте 1x матричный раствор (например, Geltrex) на покровные стекла в виде капель объемом 50 мкл и инкубируйте при 37 °C в течение 1 часа.
    3. Пропустите или разморозьте vmAstros, повторно суспендируйте в среде ASTRO и проведите подсчет. Планшет vmAstros по 25-100 000 клеток на покровное стекло в капле объемом 50 мкл.
    4. Снимите матрицу с покровного стекла и сразу же добавьте vmAstros в каплю носителя. Поместите при температуре 37 °C на 30 минут, а затем затопите лунки дополнительным 250 μл фильтрующего материала ASTRO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении иммуноцитохимии для простой проверки экспрессии астроцитов и маркеров среднего мозга, vmAstros можно зафиксировать через 24 часа после нанесения.
    5. Приготовьте 4% раствор формальдегида, разбавив 36% раствор формальдегида 1:9 в D-PBS.
    6. Промойте vmAstros 1x с D-PBS. Сразу же добавьте в лунки 4% формальдегид и оставьте при комнатной температуре на 10 минут.
    7. Удалите формальдегид и замените его на D-PBS. Либо хранить при температуре 4 °C, либо приступать к иммуноцитохимии.
    8. Постирайте покровные стекла в лунках 3 раза с D-PBS. Пермеабилизируйте и заблокируйте в 10% козьей сыворотке, 1% BSA в 0,1% PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) на 1 ч при комнатной температуре.
    9. Добавьте первичные антитела (Таблица материалов) в 1% козью сыворотку, 0,1% BSA в 0,1% PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C на коромысле.
    10. На следующий день удалите первичные антитела и промойте покровные стекла 3 раза с D-PBS.
    11. Добавьте соответствующие вторичные антитела (Таблица материалов) в 1% козью сыворотку, 0,1% BSA в 0,1% PBTx и инкубируйте в течение 1-2 часов при комнатной температуре и защищайте от света на качалке. Стирайте покровные стекла 3 раза с D-PBS.
    12. Добавьте раствор DAPI (0,1 мкг/мл DAPI в D-PBS) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Стирайте покровные стекла 3 раза с D-PBS.
    13. Чтобы установить покровное стекло, добавьте каплю 5 мкл монтажного материала Mowiol/DABCO [12% Mowiol (w/v), 12% глицерина (w/v), растворенного в течение ночного перемешивания в 0,2 M Tris (pH 8,5) с 25 мг/мл 1,4-диазабицила[2.2.2]октанового числа (DABCO)] на предметное стекло микроскопа. С помощью щипцов осторожно снять покровный стекло с колодца; Промокните край покровного стекла на салфетке, чтобы удалить лишнюю жидкость, и поместите vmAstros стороной вниз на каплю Mowiol/DABCO.
    14. Повторите для каждого покровного стекла и дайте высохнуть в течение 8 часов перед микроскопическим исследованием.
  2. Измерение с помощью иммуноферментного анализа секреции vmAstros IL-6 в ответ на лечение цитокинами
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 10-дневного созревания с BMP4 и LIF, vmAstros следует пропустить, подсчитать и нанести на пластиковую посуду с тканевым покрытием 0,25x (как подробно описано в Раздел 2.2Подготовка матрицы базальной мембраны и покрытие культуры тканей пластиком), при плотности 65 000 вмАстро на см2 в ASTRO media. BMP4 и LIF должны быть удалены из vmAstros за 72 ч до лечения цитокинами, так как активная передача сигналов от этих факторов может повлиять на эффективность лечения цитокинами. В качестве альтернативы можно разморозить криоконсервированный vmAstros и использовать его для анализа.
    1. В день проведения анализа аккуратно промойте vmAstros 3x в неокислительно-восстановительных средах (DMEM/F-12 + глутамакс + N2).
    2. Для сравнения используйте необработанный контроль и хорошо обработанный цитокинами. Добавьте выбранный цитокин в оптимизированной концентрации. Данные на рисунке 2J - L были получены с использованием IL-1α в концентрации 3 нг/мл9 в неокислительно-восстановительных средах из расчета 1 мл на 10 см2 площади клеточной культуры.
    3. Замените vmAstros в инкубаторе с температурой 37 °C/5%CO2 на 24 часа. Через 24 ч соберите питательные среды в стерильные микрофуговые пробирки.
    4. Если ИФА не будет проведен немедленно, заморозьте образцы среды, погрузив микрофужеру в жидкий азот и храня при температуре -80 °C для последующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол оптимизирован специально для использования с набором ИЛ-6 ИФА, подробно описанным в Таблице материалов. Антитела и стандарты, поставляемые в виде лиофилизированного порошка в новом наборе для ИФА, должны быть восстановлены перед первым использованием и аликвотированы для использования в будущем. В техническом паспорте, прилагаемом к набору, подробно описаны реагенты и объемы, необходимые для восстановления. Антитело захвата должно быть восстановлено в PBS (без белка-носителя).
    5. Проведите ИФА в формате 96-луночных планшетов и рассчитайте объемы реагентов в соответствии с используемыми скважинами. В день ИФА приготовьте антитела захвата, разбавив бульон в соотношении 1:120 в PBS. Покройте планшет, загрузив 50 мкл антитела захвата в лунку. Накройте тарелку клейкой лентой и выдерживайте при комнатной температуре в течение ночи.
    6. На следующий день вымойте пластину 3 раза с D-PBS-Tween (D-PBS с 0,05% Tween-20), 100 μл на лунку. Промокните насухо.
    7. Заблокируйте планшет, загрузив 150 μL D-PBS/1% BSA на лунку. Инкубировать при комнатной температуре не менее 1 ч. Умойте тарелку, как описано.
    8. Разморозьте образцы на льду (на это может уйти 1-2 ч). Разбавьте образцы в соотношении 1:5, загрузив образец в 10 мкл и 40 мкл d-PBS/1% BSA. Сделайте вихревую обработку каждого образца перед загрузкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении ИФА ИЛ-6 необходимо разбавлять пробы, разведения следует оптимизировать.
    9. Приготовьте верхний стандарт (1 000 г/мл), разбавив исходное вещество 1:180 в D-PBS/1% BSA. Подготовьте 7 стандартов, проведя серийное разбавление верхнего стандарта. Вихрь между каждым разведением.
    10. Добавьте в лунки 50 мкл стандартов/образцов. Используйте D-PBS/1% BSA в качестве заготовки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч на орбитальном шейкере, чтобы правильно перемешать разведенные образцы. Умойте тарелку, как описано.
    11. Приготовьте антитела для обнаружения путем разбавления бульона в соотношении 1:60 в D-PBS/1% BSA. Загрузите 50 мкл антител для обнаружения на лунку. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте при RT в течение 2 ч. Умойте тарелку, как описано.
    12. Стрептавидин получают конъюгированную с пероксидазой хрена (Strep-HRP) путем разведения бульона 1:40 в D-PBS/1% BSA. Загрузите 50 мкл Strep-HRP в лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте. Умойте тарелку, как описано.
    13. Инициируйте цветовую реакцию, загрузив 50 μл раствора субстрата TMB в лунку. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин (или до тех пор, пока стандарты и образцы не приобретут синий цвет).
      ПРИМЕЧАНИЕ: TMB хранится при температуре 4 °C, но его следует использовать при комнатной температуре.
    14. Остановите реакцию, добавив 25 мкл стоп-раствора (1 М Н2SO4) в лунку и обратите внимание на изменение цвета с синего на желтый.
    15. Считывание показаний с пластины при поглощении 450 нм с помощью микропланшетного ридера. Установите коррекцию длины волны на поглощение 540 нм для максимальной точности. Рассчитайте концентрации белка в образцах по полученной стандартной кривой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методология дифференцировки и прогрессия
Здесь мы подробно описываем как методы, использованные для генерации vmAstros, так и протоколы, используемые для их последующей фенотипической характеристики. Метод получения vmAstros состоит из нескольких различных стадий дифференцировки, которые можно контролировать с помощью микроскопии и выявлять различные морфологические характеристики (рис. 1A-F). Культура гиПСК без фидеров (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод получения vmAstros из hiPSCs является высокоэффективным, он позволяет получать чистые культуры vmAstros и может быть воспроизведен для получения vmAstros из различных линий hiPSC. Этот протокол был разработан на основе повторения событий развития, необходимых в эмбрионе для правильного моделирования развивающегося среднего мозга и генерации астроцитов, и включает в себя три определенных этапа: 1) нейронная вентральная индукция среднего мозга для генерации vmNPC, 2) генерация и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована за счет гранта на проект Паркинсона в Великобритании (G-1402) и стипендии. Авторы выражают благодарность Wolfson Bioimaging Facility за поддержку и помощь в этой работе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>реагенты
0,2M Tris-Cl (pH 8,5)/a/аСостоит из основания Tris и плюс HCl
0,5M EDTA, PH 8ThermoFisher  15575-0201:1000 в D-PBS до 0,5 мМ окончательный 
1,4-диазабицил[2.2.2]октан (DABCO)SigmaD27802-  25 мг/мл в монтажном растворе Mowiol
13 мм покровные стеклаVWR631-0149
2-меркаптоэтанол (50 мМ)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010Имеет 1x NEAA, но мы добавляем до конечной концентрации 2x (0,2 мМ)
Аскорбиновую кислотуSigmaA5960200 мМ стоковый, 1:1000 до 200 &микро; M final
B27 SupplementThermoFisher17504-04450x сток
BSASigma5470
Клеточная среда для заморозкиSigmaC2874Cryostor CS10
Клеточный морозильный бакNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860,8 мМ стока, 1:1000 разведение до 0,8 &м; M финальные
криовиалы  SigmaCLS430487
DAPI SigmaD95421 мг/мл, от 1:10 000 до 100 нг/мл конечный (в PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS без Mg или Ca)ThermoFisher14190144<>pH 7,2
E8 Flex средний набор ThermoFisherA2858501
формальдегидом (36% раствор)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 или 1:400 в ледяном DMEM/F12
GlutamaxThermoFisher350500382 мМ (1:200 в N2B27, 1:100 в среде ASTRO до 20 и микро; M final) 
ГлицеринSigmaG5516
BDNF для человека BDNF  Пепротех450-0220 & микро; г/мл исходный, от 1:1000 до 20 нг/мл конечный
продукт Human BMP4Peprotech120-0520 &m; г/мл стоковый, от 1:1000 до 20 нг/мл конечный
EGF человекаPeprotechAF-100-1520 &m; г/мл стоковый, от 1:1000 до 20 нг/мл конечный
продукт Human GDNFPeprotech450-1020 &m; г/мл бульон, от 1:1000 до 20 нг/мл конечный
раствор человеческого инсулинаSigma I927810 мг/мл стоковый, 1:2000 до 5&м; г/мл конечный
Human LIFPeprotech300-0520 &m; г/мл стоковый, от 1:1000 до 20 нг/мл конечный
ИЛ-6 ИФА наборBiotechneDY206
ИзопропанолСигма  I9516-4LДля наполнения криохранилища Mr Frosty
LDN193189SigmaSML0559100 &; M стоковый, 1:10,000 разведение до 10 нМ конечный
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 ДобавкаThermoFisher17502048100x сток
NEAAThermoFisher1114003510 мМ стоек, 1:100 до 0,1 мМ конечный 
Нейробазальная средаThermoFisher21103049
Нормальная козья сывороткаVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x стока, 1:100 до 1x конечная
SB431542Tocris161410 мМ стока, 1:1000 разведение до 10 &; M final
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 &m; г/мл исходных данных, от 1:1000 до 200 нг/мл конечного
Tris-HClSigma PHG0002 
Тритон-ХСигмаХ100
Твин-20Сигма P7949
ВитронектинThermoFisherA147001:50 в D-PBS
сильно>Антитела для иммуноцитохимии  CompanyКаталожный номер>Host species
Антитело против S100bSigmaSAB4200671мыши; 1:200
Антитело против FOXA2SCBTNB600501мыши; 1:50
Антитело против LMX1AProSci7087Rabbit; 1:300
Антитело против LMX1AMilliporeAB10533Rabbit; 1:2000
Антитело против LMX1BProteintech18278-1-APRabbit; 1:300
Антитело против GLASTProteintech20785-1-APRabbit; 1:300
Антитело против GFAPDakoZ0334Rabbit; 1:400
Антитело против CD49fProteintech27189-1-APRabbit; 1:100
Антитело против MSI1Abcamab52865Rabbit; 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit ThermoFisherA32731Коза; 1:500
Alexa Fluor 488 Коза Анти-МышьThermoFisherA32723Коза; 1:500
Alexa Fluor 568 Коза Анти-КроликThermoFisherA11036Коза; 1:500
Alexa Fluor 488 Козья антимышьThermoFisherA11031Коза; 1:500
n нstrong<

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  2. Lees, A. J., Hardy, J., Revesz, T. Parkingson's disease. Lancet. 373, 2055-2066 (2009).
  3. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
  4. Booth, H. D. E., Hirst, W. D., Wade-Martins, R. The role of astrocyte dysfunction in Parkinson's disease pathogenesis. Trends in Neurosciences. 40, 358-370 (2017).
  5. Lindstrom, V., et al. Extensive uptake of alpha-synuclein oligomers in astrocytes results in sustained intracellular deposits and mitochondrial damage. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 143-156 (2017).
  6. Crompton, L. A., Cordero-Llana, O., Caldwell, M. A. Astrocytes in a dish: Using pluripotent stem cells to model neurodegenerative and neurodevelopmental disorders. Brain Pathology. 27, 530-544 (2017).
  7. di Domenico, A., et al. Patient-specific iPSC-derived astrocytes contribute to non-cell-autonomous neurodegeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 12, 213-229 (2019).
  8. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Current Opinions in Neurobiology. 20, 588-594 (2010).
  9. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
  10. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: production, function, and therapeutic Potential. Immunity. 46, 957-967 (2017).
  11. Yun, S. P., et al. Block of A1 astrocyte conversion by microglia is neuroprotective in models of Parkinson's disease. Nature Medicine. 24, 931-938 (2018).
  12. Stokholm, M. G., et al. Assessment of neuroinflammation in patients with idiopathic rapid-eye-movement sleep behaviour disorder: a case-control study. The Lancet Neurology. 16, 789-796 (2017).
  13. Williams-Gray, C. H., et al. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson's disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 31, 995-1003 (2016).
  14. Gelders, G., Baekelandt, V., Vander Perren, A. Linking neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. Journal of Immunology Research. 2018, 4784268(2018).
  15. Hall, S., et al. Cerebrospinal fluid concentrations of inflammatory markers in Parkinson's disease and atypical parkinsonian disorders. Scientific Reports. 8, 13276(2018).
  16. Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32, 6391-6410 (2012).
  17. Clarke, B. E., et al. Human stem cell-derived astrocytes exhibit region-specific heterogeneity in their secretory profiles. Brain. 143 (10), 85(2020).
  18. Sevenich, L. Brain-resident microglia and blood-borne macrophages orchestrate central nervous system inflammation in neurodegenerative disorders and brain cancer. Frontiers in Immunology. 9, 697(2018).
  19. Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22, 832-847 (2018).
  20. Viti, J., Feathers, A., Phillips, J., Lillien, L. Epidermal growth factor receptors control competence to interpret leukemia inhibitory factor as an astrocyte inducer in developing cortex. Journal of Neuroscience. 23, 3385-3393 (2003).
  21. Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H., Taga, T. Astrocyte differentiation mediated by LIF in cooperation with BMP2. FEBS Letters. 457, 43-46 (1999).
  22. Serio, A., et al. Astrocyte pathology and the absence of non-cell autonomy in an induced pluripotent stem cell model of TDP-43 proteinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 4697-4702 (2013).
  23. Gupta, K., et al. Human embryonic stem cell derived astrocytes mediate non-cell-autonomous neuroprotection through endogenous and drug-induced mechanisms. Cell Death and Differentiation. 19, 779-787 (2012).
  24. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 25(2013).
  25. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 528-534 (2011).
  26. Xin, W., et al. Ventral midbrain astrocytes display unique physiological features and sensitivity to dopamine D2 receptor signaling. Neuropsychopharmacology. 44, 344-355 (2019).
  27. Devine, M. J., et al. Parkinson's disease induced pluripotent stem cells with triplication of the alpha-synuclein locus. Nature Communications. 2, 440(2011).
  28. Chen, Y., et al. Engineering synucleinopathy-resistant human dopaminergic neurons by CRISPR-mediated deletion of the SNCA gene. European Journal of Neuroscience. 49, 510-524 (2019).
  29. Crompton, L. A., et al. non-adherent differentiation of human pluripotent stem cells to generate basal forebrain cholinergic neurons via hedgehog signaling. Stem Cell Research. 11, 1206-1221 (2013).
  30. Stathakos, P., et al. A monolayer hiPSC culture system for autophagy/mitophagy studies in human dopaminergic neurons. Autophagy. , 1-17 (2020).
  31. Stathakos, P., et al. Imaging autophagy in hiPSC-derived midbrain dopaminergic neuronal cultures for Parkinson's disease research. Methods in Molecular Biology. 1880, 257-280 (2019).
  32. Bilican, B., et al. Mutant induced pluripotent stem cell lines recapitulate aspects of TDP-43 proteinopathies and reveal cell-specific vulnerability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 5803-5808 (2012).
  33. Cordero-Llana, O., et al. Clusterin secreted by astrocytes enhances neuronal differentiation from human neural precursor cells. Cell Death and Differentiation. 18, 907-913 (2011).
  34. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128, 3585-3594 (2001).
  35. Namihira, M., et al. Committed neuronal precursors confer astrocytic potential on residual neural precursor cells. Developmental Cell. 16, 245-255 (2009).
  36. Ochiai, W., Yanagisawa, M., Takizawa, T., Nakashima, K., Taga, T. Astrocyte differentiation of fetal neuroepithelial cells involving cardiotrophin-1-induced activation of STAT3. Cytokine. 14, 264-271 (2001).
  37. Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H. Synergistic signaling in fetal brain by STAT3-Smad1 complex bridged by p300. Science. 284 (5413), 479-482 (1999).
  38. Nakashima, K., et al. Developmental requirement of gp130 signaling in neuronal survival and astrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 19, 5429-5434 (1999).
  39. Barbar, L., et al. CD49f is a novel marker of functional and reactive human iPSC-derived astrocytes. Neuron. 107, 436-453 (2020).
  40. Barbar, L., Rusielewicz, T., Zimmer, M., Kalpana, K., Fossati, V. Isolation of human CD49f(+) astrocytes and in vitro iPSC-based neurotoxicity assays. STAR Protocols. 1, 100-172 (2020).
  41. Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and alpha-synuclein dysfunction potentiate each other, driving chronic progression of neurodegeneration in a mouse model of Parkinson's disease. Environmental Health Perspectives. 119, 807-814 (2011).
  42. Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and oxidation/nitration of alpha-synuclein linked to dopaminergic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 28, 7687-7698 (2008).
  43. Horvath, I., et al. Co-aggregation of pro-inflammatory S100A9 with alpha-synuclein in Parkinson's disease: ex vivo and in vitro studies. Journal of Neuroinflammation. 15, 172(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Ventral Midbrain AstrocytesHuman Astrocyte GenerationInduced Pluripotent Stem CellsParkinson s Disease ModelsAstrocyte NeuroinflammationAstrocyte NeurotoxicityAstrocyte Drug ScreeningAstrocyte ImmunomodulationAstrocyte Marker ExpressionHigh Throughput Protocol
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи