Методическая статья

Оптимизированное включение аналогов алкиниловых жирных кислот для обнаружения жирных ацилированных белков с помощью Click Chemistry

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62107

⸱

9 апреля 2021 г.

 ,  , 
1Department of Biology, University of Waterloo

В этой статье

Краткое содержание

Изучение жирового ацилирования имеет важное значение для клеточных белковых взаимодействий и заболеваний. Здесь представлен модифицированный протокол для улучшения химического обнаружения жировых ацилированных белков, который может применяться в различных типах клеток и сочетаться с другими анализами, включая импульсную погоню и масс-спектрометрию.

Аннотация

Жировое ацилирование, ковалентное добавление насыщенных жирных кислот к белковым субстратам, важно для регулирования множества клеточных функций в дополнение к его последствиям при раке и нейродегенеративных заболеваниях. Последние разработки в области методов обнаружения жирового ацилирования позволили эффективно и неопасно обнаруживать жирные ацилированные белки, в частности, за счет использования химии щелчков с биоортогональной маркировкой. Тем не менее, обнаружение химии щелчка может быть ограничено плохой растворимостью и потенциальными токсическими эффектами добавления длинноцепочечных жирных кислот в клеточную культуру. Здесь описан подход к маркировке с оптимизированной доставкой с использованием омыленных жирных кислот в сочетании с BSA, не содержащим жирных кислот, а также делипидированных сред, которые могут улучшить обнаружение трудно обнаруживаемых жирных ацилированных белков. Этот эффект был наиболее выражен с аналогом алкинил-стеарата, 17-ODYA, который был наиболее часто используемым аналогом жирных кислот в химическом обнаружении ацилированных белков. Эта модификация улучшит клеточную инкорпорацию и повысит чувствительность к обнаружению ацилированного белка. Кроме того, этот подход может применяться в различных типах клеток и сочетаться с другими анализами, такими как анализ погони за импульсами, маркировка стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре и масс-спектрометрия для количественного профилирования жирных ацилированных белков.

Введение

Жировое ацилирование включает в себя ковалентное добавление жирных кислот к белкам и хорошо известно своей важностью в стимулировании белково-мембранных взаимодействий, но также было показано, что оно способствует белково-белковым взаимодействиям, конформационным изменениям и регулирует каталитические участки ферментов1,2,3,4,5,6,7 . Жировая ацилляция стала потенциальной мишенью для лекарств при множестве заболеваний, включая инфекцию, рак, воспаление и нейродегенерацию, где были задокументированы нарушения пальмитоилирования8,9,10,11,12,13. Это было в первую очередь стимулировано разработкой новых методов химического обнаружения, которые позволили крупномасштабно идентифицировать S-ацилированные белковые мишени.

Жировое ацилирование может включать в себя различные модификации, включающие ковалентное добавление насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, но обычно относится к N-миристоилированию и S-ацилированию. N-миристоилирование относится к добавлению миристиновой кислоты к N-концевым глицинам либо котрансляционно на зарождающихся полипептидах, либо посттрансляционно на вновь подвергшихся воздействию N-концевых глицинов после протеолитического расщепления2,14. N-миристоилирование происходит через необратимую амидную связь. С другой стороны, S-ацилирование обычно относится к обратимому добавлению длинноцепочечных жирных кислот к остаткам цистеина через тиофирную связь. Наиболее распространенная форма этой модификации включает включение пальмитата и, следовательно, обычно упоминается как S-пальмитоилирование, или просто пальмитоилирование11,15. Во многом S-пальмитоилирование похоже на фосфорилирование. Он динамичен, ферментативно регулируется и оказывается очень податливым.

Вплоть до последнего десятилетия изучение жирового ацилирования затруднялось ограниченными методами обнаружения, которые требовали радиоактивно меченых жирных кислот. Это имело несколько недостатков, включая стоимость, проблемы безопасности и очень длительное время обнаружения. Как правило, для обнаружения S-ацилирования16 использовали либо тритиированный, либо йодированный пальмитат. Тритиированный пальмитат требует длительных периодов обнаружения с ауторадиографической пленкой, которые могут занять от нескольких недель до месяцев. В то время как [125I] аналоги йодо-жирных кислот сокращали время обнаружения, они представляли гораздо более высокий риск безопасности и требовали тщательного мониторинга щитовидной железы экспериментаторов. Кроме того, эти методы были неколичественными, поэтому ограничивали возможность измерения динамического пальмитоилирования, а также трудоемкие для настройки и очистки из-за дополнительных средств индивидуальной защиты и радиоактивного мониторинга. Наконец, радиоактивные метки не очень хорошо подходили для протеомных исследований и обычно ограничивались обнаружением специфических белков, представляющих интерес, с низкой пропускной способностью. По мере того, как было обнаружено больше субстратов и неизбежно были идентифицированы ферменты, опосредующие каждую модификацию, стало ясно, что требуются новые методы обнаружения17,18,19,20,21. Практически одновременно возникло несколько новых методов обнаружения жировых ацилированных белков. Первый использует обратимость и реакционную способность тиоэфирной связи S-ацилирования. Анализ ацил-биотинового обмена (ABE) химически заменяет пальмитат биотином для последующего вытягивания S-ацилированных белков с использованием шариков авидина агарозы и прямого обнаружения западным блотом22,23,24. Затем была разработана биоортогональная маркировка жирных кислот и хемоселективное добавление к меткам или ручкам, которые включали использование лигирования Штаудингера и химии щелчков25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Наконец, подобно ABE, захват с помощью ацил-смолы (RAC) по существу заменяет S-ацилированные участки тиол-реактивными шариками для захвата и обнаружения S-ацилированных белков34,35. В совокупности анализы обмена и щелковой химии обеспечили более эффективные и чувствительные методы обнаружения ацилирования и аффинной очистки для последующего анализа и впоследствии привели к открытию тысяч S-ацилированных белков8,36.

Термин щелкающая химия охватывает группу химических реакций, но чаще всего относится к Cu(I)-катализируемому азидо-алкину [3+2] механизму реакции циклоприсоединения между алкиниловой группой и азидогруппой27,28,37. В частности, в случае жирового ацилирования химия щелчка включает обнаружение S-пальмитоилирования или N-миристилирования путем включения биоортогонального 16-углеродного алкинил-пальмитата (15-гексадециновая кислота; 15-HDYA) или 14-углеродного алкинил-миристата (13-тетрадециновая кислота; 13-TDYA), соответственно, в клетки для маркировки эндогенно ацилированных белков28 . После лизиса клеток и иммунопреципитации интересующего белка проводится химическая реакция щелчка (ковалентная связь между алкином и азидом) для связывания аффинного зонда, обычно биотина, для обнаружения западным блотом28,37. Альтернативно, щелкающая химия может быть выполнена на общем клеточном лизате, а жирные ацилированные белки могут быть аффинно очищены для идентификации с помощью масс-спектрометрии. Начальная щелчок химической реакции с азидо-биотином повысила селективность и чувствительность обнаружения более чем в миллион раз по сравнению с радиоактивностью2. Еще одним преимуществом щелковой химии является то, что ее можно комбинировать с другими классическими методами маркировки, такими как импульсный анализ оборота белка с использованием азидо-гомоаланина для количественного анализа38. Кроме того, флуоресцентные зонды могут использоваться вместо биотина или других биохимических зондов, таких как метки FLAG или Myc, для изучения локализации белка16,28,39.

Несмотря на относительную простоту использования щелкающей химии, обнаружение может быть ограничено низкой растворимостью и потенциальной токсичностью использования длинноцепочечных свободных жирных кислот в клеточной культуре40. В частности, несмотря на предпочтение пальмитата во время S-ацилирования для большинства белков, во многих исследованиях использовался 18-углеродный стеарат (17-октадециновая кислота - 17-ODYA), а не пальмитат (15-HDYA) для обнаружения S-ацилированных белков из-за его коммерческой доступности и относительно низкой стоимости. Тем не менее, 17-ODYA очень нерастворим и требует особого внимания при использовании. Кроме того, щелкающая химия может потребовать некоторой тонкой подготовки и хранения химических веществ. В настоящем документе описывается подход к маркировке, который оптимизирует доставку с использованием омыления жирных кислот, доставки с BSA без жирных кислот и делипидированной фетальной бычьей сывороткой (FBS) для повышения растворимости и обхода потенциальных токсических эффектов добавления свободных жирных кислот в клетки28. Этот метод работает в различных типах клеток и даже использовался у живых животных28.

Протокол

1. Клеточная культура

  1. Чтобы дополнить DMEM (модифицированная орлиная среда Dulbecco) для клеточной культуры, добавьте 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1x пенициллин-стрептомицин, 2 мМ L-глутамина и 100 мМ пирувата натрия (1% об/об).
  2. Нанесите приблизительно 5 x 105 клеток HEK293T / лунку 6-луночной чашки для культивирования тканей и выращивайте в течение 18 ч в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO2 для достижения 75%-80% сливания.
  3. Депривация сыворотки жирных кислот
    1. Для подготовки этикетировочных сред приготовьте DMEM, как указано выше (шаг 1.1) без 10% FBS. Замените FBS на FBS с 5% декстран-угольным покрытием FBS (DCC-FBS). Предварительно прогрейте до 37 °C перед использованием.
    2. Аккуратно промыть ячейки 1x фосфатным буферизованным физиологическим раствором (PBS) при комнатной температуре и заменить их маркировочными средами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HEK293T легко отделяются от тканевых культуральных пластин. Будьте осторожны при мытье ячеек и замене среды. Максимально минимизируйте перемешивание во время переноса в инкубатор и из него.
    3. Верните клетки в инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO2 и инкубируйте примерно 45 мин (минимум 15 мин эффективно), до 60 мин, прежде чем приступить к метаболической маркировке жирными кислотами.

2. Получение и омыление аналогов жирных кислот

  1. Заранее готовят исходные растворы алкиниловых жирных кислот путем солюбилизации в ДМСО до достижения следующих концентраций и хранят при -20 °C. Размораживать при комнатной температуре по мере необходимости. Храните препараты для их наилучшей производительности под N2 или Ar.
    Алкинилмиристат (13-тетрадециновая кислота, 13-TDYA): 25 мМ
    Алкинилпальмитат (15-гексадециновая кислота; 15-HDYA): 100 мМ
    Алкинилстеарат (17-октадециновая кислота; 17-ODYA): 100 мМ
  2. Чтобы приготовить 20% BSA без жирных кислот (FAFBSA), взвесьте 2 г FAFBSA в одноразовой трубке объемом 50 мл.
    1. Довести до 10 мл с предварительно нагретым (37 °C) DMEM.
    2. Перемешайте путем сквозного вращения или путем вихря и поместите на водяную баню при температуре 37 °C, чтобы полностью растворить FAFBSA.
    3. Используйте фильтр 0,2 мкм для фильтрации стерилизации среды.
    4. Аликвота примерно в объеме 1 мл и хранить при -20 °C. Разморозьте по мере необходимости и нагрейте до 37 °C на водяной бане перед использованием.
  3. Для повышения растворимости жирных кислот и аналогов жирных кислот омыляют путем инкубации с 20% молярным избытком гидроксида калия (KOH) в 3 мл стеклянных конических реакционных флаконов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти флаконы позволяют соли оставаться растворимой, гарантируя, что FAFBSA не застынет от высокой температуры. Использование стекла также предотвращает прилипание жирных кислот к пластику.
    1. Пипетка выводит по меньшей мере 2 мкл аналога алкиниловой жирной кислоты непосредственно на дно 3 мл конического реакционного флакона. Приготовьте 2 мкл липида на лунку используемой 6-луночной пластины (см. Таблицу 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за гидрофобности жирных кислот лучше всего покрыть кончик пипетки, вытягивая нужный объем несколько раз, прежде чем дозировать его в реакционный флакон.
    2. Развести 1 М КОН до концентраций, равных 20% молярному избытку метки алкиниловых жирных кислот (30 мМ для 13-ТДЯ и 120 мМ для 15-HDYA и 17-ODYA).
    3. Пипетка выводит равное количество разбавленного KOH (1 мкл : 1 мкл жирной кислоты: KOH) близко к дну реакционного флакона на краю стакана, так что дозированный объем KOH смешивается с жирной кислотой.
    4. Закройте крышку флакона и осторожно постучите, чтобы перемешать растворы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь может быстро затвердевать, особенно при увеличении длин углеводородной цепи жирной кислоты. Будьте осторожны, чтобы не пипетировать твердое вещество (т.е. не смешивать путем пипетки).
    5. Нагревайте реакционный флакон при 65 °C в течение приблизительно 5 мин или как только жирная кислота будет включена (раствор станет прозрачным).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жирные кислоты с большим количеством атомов углерода и пониженной растворимостью, такие как стеарат (17-ODYA), могут потребовать более длительного времени инкубации, чтобы быть полностью включенными в KOH при 65 °C. При необходимости поднимите температуру до 70 °C. Лучше всего водяная баня. Следите за тем, чтобы жидкость не испарялась слишком сильно.
    6. После того, как жирные кислоты растворились и не осталось видимых твердых веществ, пипетка предварительно расплавила 20% FAFBSA таким образом, что объемное соотношение жирных кислот: KOH: FAFBSA составляет 1: 1: 50 для достижения конечной концентрации 20x BSA-связанных алкиниловых жирных кислот.
    7. Перемешайте путем пипетки вверх и вниз. Раствор обычно выглядит прозрачным без видимых твердых тел.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, любые мелкие твердые вещества попадают в раствор после инкубации при 37 °C.
    8. Инкубировать жирные кислоты и FAFBSA в течение 15 мин при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Омыленная этикетка в этот момент стабильна более 15 минут.

       
Общий объем носителя (мл)Объем жирной кислоты или аналог жирных кислот (мкл)Объем KOH (мкл)Объем 20% FAFBSA (мкл)Общий объем BSA-конъюгированной омыленной метки (мкл)
444200208
222100104

Таблица 1: Коэффициенты маркировки омыленных жирных кислот. Экспериментальные объемы жирных кислот, KOH и FAFBSA для омыления маркировки жирных кислот в соответствии с объемом используемых сред.

  1. В качестве элемента управления повторите шаг 2.3. с жирными кислотами без алкиновой метки.
  2. Метят клетки с 1/20 объемом 20-кратного конъюгата жирных кислот-BSA непосредственно на среду голодания (обычно 100 мкл в среде/клетках 2 мл) для достижения конечной концентрации 1% BSA и 25 мкМ для алкинил-миристата или 100 мкМ для алкинилпальмитата и алкинил-стеарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму количество физических нарушений прикрепленных клеток, сформируйте каплю на кончике пипетки близко к поверхности среды вместо пипетки непосредственно в среду. При использовании ингибиторов ацилирования добавляют не менее чем за 15 мин до меченых жирных кислот. Время может варьироваться в зависимости от используемых клеток или ингибитора. Было рекомендовано использовать омыление и для этого этапа28.
    1. Для сравнения, добавляйте неомыленные липиды путем пипетирования 2 мкл (или эквивалент объема омыленного) немаркированной жирной кислоты непосредственно в среду голодания.
    2. Поместите клетки обратно в инкубатор и инкубируйте в течение 3-6 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время маркировки может потребоваться определить для каждого типа клеток или экспериментального состояния. Более длительное время инкубации может потенциально привести к распаду жирных кислот путем β окисления и/или включения в другие липидные группы, такие как фосфолипиды28.
  3. Аккуратно вымойте ячейки с 1x PBS при комнатной температуре.
  4. Собирают и лизируют клетки с помощью 500 мкл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) без модифицированного буфера радиоиммунопреципитации (RIPA) (0,1% SDS, 50 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-этанесульфоновой кислоты (HEPES) pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1% неденатурирующего детергента, 0,5% дезоксихолата натрия, 2 мМ MgCl2 со свежеприсоединившимся 1 мМ фенилметилсульфульфонилфторидом (PMSF) и 10 мкг/мкл Пепстатина А (или полного ингибитора протеазы без ЭДТА)) путем раскачивания лизатов в течение 15 мин при 4 °C.
    1. Центрифугировать лизаты при 16 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    2. Соберите супернатант в микроцентрифужные трубки объемом 1,7 мл и храните при -20 °C до готовности к переходу к реакции щелчка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Лизаты стабильны при -20 °C в течение 1 месяца. Тем не менее, рекомендуется своевременно приступать к реакции клика.
  5. Количественно оценить концентрации белка с помощью соответствующего анализа в соответствии с протоколом производителя, такого как анализ, совместимый с моющими средствами (DC).

3. Нажмите реакцию на лизаты клеток

  1. Подготовьте реагенты для щелчка химии.
    1. Растворяют трис-(бензилтриазолилметил)амин (ТБТА) в ДМСО до 2 мМ. Хранить в небольших аликвотах с осушителем при -20 °C до 2-3 месяцев. Лучше всего хранить под N2 или Ar.
    2. Растворите CuSO4 в воде ddH2O до 50 мМ. Хранить при комнатной температуре до 2 месяцев.
    3. Растворяют трис-карбоксиэтилфосфин (TCEP) в воде ddH2O до 250 мМ. Хранить во тьме при температуре 4 °C и делать свежие 50 мМ разведения непосредственно перед реакцией щелчка.
    4. Приготовьте 2 мМ азида в ДМСО. Хранить в небольших аликвотах с осушителем при -20 °C до 6 месяцев. Лучше всего хранить под N2 или Ar.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было отмечено, что продукты с тремя или более группами полиэтиленгликолей лучше всего работают с биотином.
  2. Доведите 50-100 мкг белковых лизатов в микроцентрифужных пробирках объемом 1,7 мл в тот же объем, используя тот же буфер лизиса, что и выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите реакционный объем как можно меньше (20-100 мкл).
    1. Добавьте додецилсульфат натрия (SDS) в каждый образец для достижения окончательной концентрации 1%.
    2. Подготовьте мастер-смесь щелковых реагентов таким образом, чтобы конечные концентрации после добавления к лизатам составляли: 100 мкМ TBTA (запас 2 мМ), 1 мМ CuSO4 (запас 50 мМ) 1 мМ TCEP (запас 50 мМ) и 100 мкМ азидного зонда (запас 2 мММ). Соответствующим образом комбинируйте складские решения (см. таблицу 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заказ важен. Полностью перемешать после добавления каждого компонента.
    3. Добавьте соответствующие объемы мастер-микса в лизаты. Перемешайте путем пипетки вверх и вниз.
    4. Инкубировать в течение 30 мин в темноте на водяной бане при температуре 37 °C. Время от времени перемешивать/перемешивать.
Общий объем реакции (мкл)Объем белка (мкл)Объем TBTA (2 мМ) (мкл)Объем CuSO4 (50 мМ) (мкл)Объем TCEP (50 мМ) (мкл)Объемный зонд азидо (2 мМ) (мкл)
50432.5112.5
100865225

Таблица 2: Щелкните соотношение реагента и объема белка. Экспериментальные объемы щелковых химических реагентов и соответствующих концентраций запаса, в дополнение к объемам белковых образцов.

4. Реакция щелчка на иммунопреципитированных белках

  1. В качестве альтернативы можно выполнить реакцию щелчка на иммунопреципитированных (IP) белках на бусинах или вне их .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, выполнение щелчка по бусинам приводит к наименьшему фону и лучше всего при тестировании новых белков, представляющих интерес.
    1. Трансфектируйте клетки для белка, представляющего интерес, в данном случае миристоилированный С-концевой гентингтин дикого типа (HTT), слитый с GFP (myr-ctHTT-GFP) и ctHTT-GFP с замещением G2A, используя копреципитацию ДНК фосфата кальция, как описано ранее41.
      1. Пластина 2,5 х 105 клеток / лунка в 6-луночных тканевых культуральных пластинах и расти за ночь до ~ 70-80% слива.
      2. Подготовьте смесь ДНК, добавив 2,5 мкг ДНК в 10 мкл с молекулярным классом H2O 99,75 мкл в микроцентрифужную трубку объемом 1,7 мл. Затем добавьте 15,25 мкл CaCl2 по каплям в смесь ДНК.
      3. Добавьте смесь ДНК/CaCl2 в отдельную пробирку, содержащую 125 мкл 2x HEPES буферизованного физиологического раствора (HBS, pH 7.0) по каплям путем смешивания.
      4. Медленно добавляйте смесь ДНК / CaCl2 / HBS в клетки. Через 2-4 ч заменить среду и инкубировать в течение ночи. Перейдите к маркировке, начиная с шагов 1.3-2.8.
    2. Готовят равные объемы 500 мкг белка в буфере лизиса.
    3. Выполняйте IP путем инкубации с анти-GFP кролика для ctHTT-GFP, вращающегося в течение ночи при 4 °C.
    4. Добавьте в каждую трубку 15-20 мкл белковых шариков G, предварительно уравновешенных буфером лизиса, и дайте ему вступить в реакцию при 4 °C в течение 3 ч.
    5. Шарики промыть лизисным буфером и повторно суспендировать в буфере HEPES 45 мкл 1% SDS 50 мМ.
    6. Нагревайте шарики при 80 °C в течение 15 мин и переворачивайте трубки или перемешивайте примерно каждые 5 минут. Ненадолго раскрутите трубки и вернитесь к температуре 80 °C.
    7. Соберите супернатант, содержащий белки, пока образцы еще теплые.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен, и иммунопреципитированные образцы могут храниться при -20 ° C или -80 ° C, если они не используются для химии щелчка сразу.
    8. Позвольте 43 мкл супернатанта вступить в реакцию с 7 мкл основной смесью щелковых реагентов.
    9. Действуйте в соответствии с этапом 3.2.3.

5. SDS-PAGE и вестерн-блоттинг

  1. Остановите реакцию и денатуру, добавив 1-кратный буфер загрузки образца, содержащий 25 мМ дитиотрейтол (DTT) и нагревающий при 95 °C в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать DTT до 100 мМ28. Не используйте β-меркаптоэтанол с S-ацилированными белками, так как он может гидролизовать тиофирные связи и удалить аналог щелкнутой жирной кислоты.
  2. Кратко раскрутите образцы.
  3. Разделите белки с помощью SDS-PAGE на полиакриламидном геле, в дубликатах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для щелочной обработки KOH требуются два геля для подтверждения наличия тиофирных связей. При использовании флуоресцентного азидного зонда ацилирование может быть обнаружено в геле или после переноса с использованием указанного канала возбуждения.
  4. Перенос на поливинилиденфторидные (PVDF) мембраны (активированные в метаноле и промытые в ddH2O - по 5 мин) с помощью полусухого передаточного аппарата при 25 В, 1,0 А (постоянная) в течение 30 мин.
  5. После кратковременного промывания мембран ddH2O замочите одну реплицированную мембрану в 0,1 М КОН в метаноле/воде (9:1 в/об), а другую в 0,1 М Tris-HCl pH 7,0 в метаноле/воде (9:1 в/об) в качестве нещелочного контроля в течение 60 мин при комнатной температуре с мягким раскачиванием.
  6. Ненадолго промойте мембраны в воде ddH2O с последующим 6-кратным 5-минутным смывом в PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно вымойте.
  7. Блокируйте мембраны на ночь в 5% буфере блокировки обезжиренного молока (1x PBS, 0,1% Tween20).

6. Выполните вестерн-блот

  1. Там, где это указано, зонд с флуоресцентно помеченным Стрептавидином (1:5000) и контролем нагрузки, анти-GAPDH родамином (1:5000) в 5% блокирующем буфере BSA (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) при комнатной температуре в течение 45-60 мин с мягким раскачиванием, в темноте.
    1. Исследуйте иммунопреципитированное белковое пятно сначала первичным антителом против GFP в 5% буфере блокировки обезжиренного молока, затем соответствующими вторичными антителами в 5% BSA, как на этапе 6.1.
  2. Промывайте мембраны в течение 5 мин в PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) в общей сложности четыре повтора и промывайте водой ddH2O перед визуализацией.

Результаты

Разница в эффективности маркировки между омыленными и неагломеренными (без сока) алкиниловыми жирными кислотами для обнаружения химии щелчков может быть визуализирована и сравнена по интенсивности сигнала жирных ацилированных белков через вестерн-блот (рисунок 1). Заметный эффект наблюдался при увеличении длины ацильных цепей. В клетках, меченных алкинил-стеаратом (alk-stear), омыление жирных кислот и доставка BSA для метаболической маркировки резко увеличили обнаружение сигнала S-ацилированного белка через химию щелчков и обнаружение флуоресцентным зондом азидо (рисунок 1, справа), что свидетельствует об общем увеличении клеточного включения метки алкиниловых жирных кислот. И наоборот, не наблюдалось заметной разницы в клетках, обработанных самой короткой и наиболее растворимой жирной кислотой, алкинилмиристатом (алк-мир; 13-тетрадециновая кислота или 13-ТДЯ). Клетки, меченные алкинилпальмитатом (рисунок 1, середина), показали промежуточное увеличение метки по сравнению с алкинил-миристатом (13-TDYA), но меньше, чем алкинил-стеарат.

Важно отметить, что обработка PVDF-мембран с 0,1 М КОН в значительной степени удаляла метки жирных кислот из клеток, инкубированных алкинилпальмитатом и алкинилстеаратом, подтверждая, что большая часть сигнала проходила через эфирную или тиофирную связь (рисунок 1, средняя и правая, нижние панели). Как и ожидалось, включение алкинил-миристата было в основном щелочестойким (рисунок 1, слева, нижние панели), из-за прикрепления миристата к белкам через амидную связь.

Рисунок 2 демонстрирует универсальность и чувствительность химии щелчков для обнаружения жирового ацилирования иммунопреципитированных белков. Клетки HEK293T трансфектировали миристоилированным С-концевым гентингтином (HTT), слитым с GFP (myr-ctHTT-GFP) и помеченным алкинил-миристатом, как описано ранее18. После иммунопреципитации ctHTT-GFP высвобождался из шариков и подвергался щелчковой химии вместе с лизатами. Миристоилирование дикого типа (WT) myr-ctHTT-GFP не только было обнаружено в иммунопреципитатах, но и было сильно обнаружено в лизатах, тогда как мутация G2A полностью блокировала миристоилирование ctHTT-GFP (рисунок 2).

figure-results-1
Рисунок 1: Обнаружение жирных ацилированных белков с помощью щелчковой химии. Клетки HEK293T инкубировали с указанными жирными кислотами непосредственно (без сока) или после омыления (сока) и инкубации с белком-носителем BSA, как описано в протоколе 2.1-2.7. Алкиниловые жирные кислоты связывали с флуоресцентным азидом путем подвергания 100 мкг белковых лизатов щелкающей химии, разделенной SDS-PAGE и перенесенной на мембраны PVDF. После обработки 0,1 М Трис рН 7,0 или 0,1 М КОН, чтобы обратить вспять тиоэфирные связи, жирное ацилирование было обнаружено с использованием флуоресцентного азида. В качестве регулятора нагрузки использовался GAPDH; анти-GAPDH родамин (1:5,000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Обнаружение N-миристоилированного ctHTT-GFP с помощью щелковой химии. Клетки HEK293T трансфектировали С-терминально усеченной (ct) и миритоилатируемой формой HTT (myr-ctHTT-GFP) и маркировали алкинил-миристатом. Была включена немиристоилатируемая форма с существенным глицином, замененным аланином (G2A). После сбора урожая и лизиса ctHTT-GFP был иммунопреципитирован с использованием козьего анти-GFP. Лизаты подвергали химической реакции щелчка (слева), а также иммунопреципитатам после высвобождения из шариков. Миристоилирование было обнаружено с помощью Стрептавидина Alexa 680 (SA680). GFP был обнаружен с использованием анти-GFP кролика в сочетании с анти-rabbit Alexa 488. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Схема рабочего процесса экспериментального протокола. Описание рабочего процесса основных экспериментальных шагов в протоколе. Отмечено несколько моментов, где протокол может быть приостановлен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Прямое добавление жирных кислот к клеткам в культуре может привести к нерастворимости, осаждению липидов и липотоксичности40. Следовательно, добавление жирных кислот непосредственно в клетки может привести не только к плохому поглощению клеток и низкой доступности метки жирных кислот, но и к уменьшению количества жизнеспособных клеток для последующего анализа, а также к активации нецелевых путей. Тем не менее, многие протоколы метаболической маркировки для обнаружения химии щелчков включают прямое добавление жирных кислот и большое количество исследований пальмитоил-протеома с использованием обнаружения химии щелчков на сегодняшний день редко омыляют этикетки жирных кислот или инкубируют их с помощью BSA8,36. Важно учитывать тот факт, что эффективность и чувствительность химического обнаружения жирно-ацилированных белков зависят от достаточного клеточного поглощения аналогов жирных кислот. Поэтому разумно предположить, что многие S-ацилированные белки, возможно, избежали обнаружения в протеомных исследованиях из-за низкой доступности меток жирных кислот из-за плохого включения в клетки, особенно когда использовалась жирная кислота с более длинной цепью 17-ODYA. 17-ODYA, или алкинил-стеарат, был широко используемой этикеткой выбора для нескольких исследований из-за его коммерческой доступности и его раннего использования8,36. Однако результаты этого протокола показывают, что омыление 17-ODYA приводит к наибольшему увеличению обнаружения S-ацилированных белков по сравнению с жирными кислотами с более короткой цепью, такими как пальмитат или миристат. Поэтому повторение этих экспериментов с омыленными метками может дать дополнительные субстраты S-ацилирования, которые, возможно, ранее были упущены из виду. Кроме того, в то время как большинство пальмитоилацилтрансфераз предпочитают пальмитат для S-ацилирования, некоторые из них имеют предпочтения для других длин жирных кислот, таких как стеарат15,38,44. Кроме того, некоторые белки или даже определенные участки в белках предпочитают одну жирную кислоту другой15,45. Таким образом, исследования с использованием 17-ODYA могут иметь уклон в сторону белков S-ацилированных стеаратом, а не пальмитатом, а также недостаточно представлять эти белки из-за более низкого обнаружения.

Улучшенная эффективность метаболической маркировки для химии щелчков зависит от омыления липидов и инкубации с помощью этапов FAFBSA, а также делипидированного FBS. Все жирные кислоты должны быть полностью омылены в KOH без видимых твердых веществ, прежде чем приступать к инкубации с FAFBSA. Это может быть трудным шагом, и время имеет решающее значение. После того, как омыленные жирные кислоты вошли в раствор при 65 °C, немедленно добавьте теплый BSA, так как дальнейший нагрев вызовет испарение DMSO из жирных кислот. Кроме того, омыленная этикетка начнет повторно затвердевать, как только начнет остывать. Поэтому FAFBSA должна быть теплой и быстро добавляться после того, как соль стала растворимой. Стеклянные реакционные флаконы и их форма важны для этого этапа. Они позволяют омыленному липиду быть достаточно теплым, чтобы оставаться растворимым, в то время как достаточно холодным, чтобы гарантировать, что FAFBSA не застынет. Достаточное перемешивание путем пипетки также важно на этом этапе для обеспечения однородного раствора для маркировки.

Реагенты для химии щелчка должны быть надлежащим образом сохранены, как правило, с осушителями или под N2 или Ar газом при температуре от -20 °C до -80 °C. Отсутствие сигнала ацилирования или слабый сигнал может быть вызвано нестабильными реагентами, особенно старыми растворами TBTA и азидов. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность с флуоресцентными растворами азида, которые должны быть максимально защищены от света. Кроме того, такие переменные, как метод липидной депривации и время маркировки, возможно, потребуется протестировать для определения оптимальных условий в зависимости от типа используемой клетки. Например, нейрональным клеткам может потребоваться более длительное время маркировки, потому что изменения среды и липидная депривация затруднены (не опубликованы).

Польза этого протокола наиболее драматична при использовании для длинноцепочечных жирных кислот. Для более коротких цепей увеличение интенсивности сигнала становится менее драматичным, но по-прежнему, вероятно, защищает клетки. В то время как предлагаемые модификации улучшат обнаружение ацилирования белка в целом, химия щелчков по-прежнему считается липидоцентричным методом1, который ограничен обнаружением динамически, а не стабильно S-ацилированных белков1. Другие ограничения, которые следует учитывать, включают требование депривации жирных кислот для стимулирования маркировки и ее относительно ограниченный диапазон совместимых типов клеток по сравнению с обнаружением ацил-биотинового обмена (ABE) S-ацилирования16. Несмотря на эти ограничения, обнаружение химии щелчков происходит быстрее, чем большинство ацилообменных анализов, и лучше подходит для обнаружения белков, которые не переносят повторные этапы осаждения белка, необходимые для ацилообменных анализов. Кроме того, этот подход можно комбинировать с одновременной маркировкой с использованием других анализов щелчков, таких как анализ погони за импульсами38.

Использование этой модификации для метаболической маркировки химии щелчков увеличило общее обнаружение ацилированных белков, особенно S-ацилированных, с различными протеомными методами, которые используются в сочетании с химией щелчков. Как показано, фторогенное обнаружение может быть использовано в качестве альтернативы биотину (рисунок 1)28. Это особенно полезно, потому что в лизатах клеток нет эндогенно флуоресцентных белков. Кроме того, можно использовать флуорофоры, которые активируются только после щелчка химии46. Омыленная и связанная с FAFBSA жирная кислота для маркировки химии щелчка может помочь с трудностями обнаружения белков, представляющих интерес из-за общего увеличения количества этикетки, доступной в клетке, и путем ограничения токсических эффектов добавления жирных кислот непосредственно в среду. Он также может быть использован в сочетании с масс-спектрометрией27 для улучшения обнаружения белков с низким содержанием, особенно в сочетании с недавним прогрессом с использованием алгоритмов машинного обучения, предотвращающих избыточные измерения для повышения чувствительности к белкам с низким содержанием, в отличие от существующего зависимого от данных сбора, который способствует обнаружению наиболее распространенных белков47. . Кроме того, химия щелчков может быть объединена со стабильной изотопной маркировкой аминокислотами в клеточной культуре (SILAC) и методами погони за импульсами для получения количественных данных о динамическом S-ацилировании белка27. Наконец, группа Ханнуша объединила химию щелчков с анализом бесконтактного лигирования (PLA), чтобы обеспечить визуализацию и исследование одноклеточной визуализации и исследования субклеточного распределения пальмитоилированных белков43,48.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальным советом по научным и инженерным исследованиям (NSERC; РГПИН-2019-04617). Лючия Ляо финансировалась Мемориальной стипендией Рама и Лекхи Тумкур через кафедру биологии в Университете Ватерлоо и Мемориальной стипендией Люси Моррисон через IODE Онтарио, в дополнение к финансированию исследований выпускников из Университета Ватерлоо, включая аспирантуру (50503-11072), премию для выпускников науки и ассистента преподавателя для выпускников. Авторы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Мартина за их поддержку в подготовке этой рукописи, в частности Стефани Райалл, Харлин Гилл и Садию Хан, которые помогли первоначально создать лабораторию Мартина в подготовке к этим исследованиям. Авторы также хотели бы поблагодарить доктора Люка Бертиома за добрый подарок конструкций ctHTT-GFP и доктора Шона Сандерса за критический вклад в подготовку рукописи. Рисунок 3 был создан с помощью BioRender.com.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
13-тетрадециновая кислота (алкинилмиристиновая кислота) (25mM)Click Chemistry Tools1164
15-гексадециновая кислота (алкинилпальмитиновая кислота) (100mM)Click Chemistry Tools1165
17-октадециновая кислота (алкинилстеариновая кислота) (100 mM)Cayman Chemical Company90270
30% раствор акриламида/биса 29:1Biorad1610156
96-луночный планшетный ридерBioradN/A
AFDye 647 azide plusClick Chemistry Tools1482
Персульфат аммония (APS)Biorad1610700
Anti-GAPDH hFAB RhodamineBiorad12004167
Anti-rabbit Alexa 488InvitrogenA11034
Anti-Tubulin hFAB RhodamineBiorad
Биотин АзидКлик Химия Инструменты1265
Бис-трис, сверхчистыйVWR715
Хлорид кальцияJ.T. Baker1332-1
Центрифуга 16,000xg, 4° CThermo ScientificН/А
Древесный уголь STRP FBS One Shot (DCC-FBS)Life TechnologiesA3382101
ChemiDoc ImagerBioradН/А
Сульфат меди (1 мМ)VWRBDH9312
Дезоксихолевая кислота Моногидрат солинатрия MP Biomedicals102906
Совместимый с моющими средствами (DC) анализBioradН/А
Диметилсульфоксид (ДМСО)VWR0231-500 мл ДМЭМ
, 1xWisent Inc319015CL
Этанол, безводныйН/Д Н/Д
БСА без жирных кислотBSA MP Biomedicals219989950
Fast Blot Turbo Semi-dry transferBioradN/A
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher Scientific12483-020
FluoroTrans W PVDF (поливинилиденфторид) передаточная мембранаPall Life SciencesBSP0161
HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]-этанесульфоновая) кислотаVWR5011
Увлажненный инкубатор при 37° C и 5% CO2VWRN/A
Igepal CA-630Alfa AesarJ61055
Image Lab SoftwareBioradN/A
L-глютаминовая добавкараствор Wisent Inc609-065-EL
Хлорид магнияFisher ScientificBP214-500
МетанолVWRBDH1135
Миристиновая кислота (25 мМ)VWRM0476-25G
Пальмитиновая кислота (100 мМ)VWRP0002-25G
Пенициллин-стрептомицин, 10xWisent Inc450201EL
Пепстатин А (синтетический)Enzo Life SciencesALX-260-085-M005
ФенилметилсульфонилфторидEnzo Life SciencesALX-270-184-G005
Фосфатно-солевой буфер, 10x, pH 7,4VWR75801-000
Поликлональное козье антитело к GFP (Affinity Purified)EuseraEU4
FluoroTrans W PVDF (поливинилиденфторид) транспортная мембранаPall Life SciencesBSP0161
Гидроксид калияWard's Science470302-100
Кроличье поликлональное антитело к GFPEuseraEU1
Sodium ChlorideVWR0241-1KG
Додецилсульфат натрия (SDS)Fisher ScientificBP166-500
Пируват натрияWisent Inc600-110-EL
стрептавидин Alexa Fluor 680 конъюгатThermo Fisher ScientificS21378
Трис-(бензилтриазолилметил)амин (TBTA) (100 мкМ)Нажмите Инструменты для химии1061
Трис-(2-карбоксиэтил)фосфин HCl (TCEP) (1mM)Soltec VenturesM115
Tris BaseFisher ScientificBP152-5
Trypsin/EDTAWisent Inc325-043-CL
Tween 20 Реагент класса 1лVWR97062-332
WHEATON NextGen V флаконы 3 млVWR89085-424
12004166

Ссылки

  1. Zaballa, M. E., vander Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 1-31 (2018).
  2. Martin, D. D. O., Beauchamp, E., Berthiaume, L. G. Post-translational myristoylation: Fat matters in cellular life and death. Biochimie. 93 (1), 18-31 (2011).
  3. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
  4. O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. The Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
  5. Liang, X., et al. Heterogeneous fatty acylation of Src family kinases with polyunsaturated fatty acids regulates raft localization and signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 276 (33), 30987-30994 (2001).
  6. Thinon, E., Percher, A., Hang, H. C. Bioorthogonal chemical reporters for monitoring unsaturated fatty-acylated proteins. ChemBioChem. 17 (19), 1800-1803 (2016).
  7. Veit, M., Reverey, H., Schmidt, M. F. G. Cytoplasmic tail length influences fatty acid selection for acylation of viral glycoproteins. Biochemical Journal. 318 (1), 163-172 (1996).
  8. Sanders, S. S., et al. Curation of the mammalian palmitoylome indicates a pivotal role for palmitoylation in diseases and disorders of the nervous system and cancers. PLOS Computational Biology. 11 (8), 1004405(2015).
  9. Hannoush, R. N. Synthetic protein lipidation. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 39-46 (2015).
  10. Martin, D. D. O., Hayden, M. R. Post-translational myristoylation at the cross roads of cell death, autophagy and neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 43 (2), 229-234 (2015).
  11. Young, F. B., Butland, S. L., Sanders, S. S., Sutton, L. M., Hayden, M. R. Putting proteins in their place: Palmitoylation in Huntington disease and other neuropsychiatric diseases. Progress in Neurobiology. 97 (2), 220-238 (2012).
  12. Hansen, A. L., Mukai, K., Schopfer, F. J., Taguchi, T., Holm, C. K. Sting palmitoylation as a therapeutic target. Cellular & Molecular Immunology. 16 (3), 236-241 (2019).
  13. Veit, M. Palmitoylation of virus proteins. Biology of the Cell. 104 (9), 493-515 (2012).
  14. Jiang, H., et al. Protein lipidation: Occurrence, mechanisms, biological functions, and enabling technologies. Chemical Reviews. 118 (3), 919-988 (2018).
  15. Greaves, J., et al. Molecular basis of fatty acid selectivity in the zDHHC family of S-acyltransferases revealed by click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (8), 1365-1374 (2017).
  16. Gao, X., Hannoush, R. N. A decade of click chemistry in protein palmitoylation: Impact on discovery and new biology. Cell Chemical Biology. 25 (3), 236-246 (2018).
  17. Tsutsumi, R., Fukata, Y., Fukata, M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 456 (6), 1199-1206 (2008).
  18. Roth, A. F., Feng, Y., Chen, L., Davis, N. G. The yeast DHHC cysteine-rich domain protein Akr1p is a palmitoyl transferase. The Journal of Cell Biology. 159 (1), 23-28 (2002).
  19. Lobo, S., Greentree, W. K., Linder, M. E., Deschenes, R. J. Identification of a Ras Palmitoyltransferase in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41268-41273 (2002).
  20. Ohno, Y., Kihara, A., Sano, T., Igarashi, Y. Intracellular localization and tissue-specific distribution of human and yeast DHHC cysteine-rich domain-containing proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1761 (4), 474-483 (2006).
  21. Huang, K., et al. Huntingtin-interacting protein HIP14 Is a palmitoyl transferase involved in palmitoylation and trafficking of multiple neuronal proteins. Neuron. 44 (6), 977-986 (2004).
  22. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. BioTechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
  23. Roth, A. F., Wan, J., Green, W. N., Yates, J. R., Davis, N. G. Proteomic identification of palmitoylated proteins. Methods. 40 (2), 135-142 (2006).
  24. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2 (7), 1573-1584 (2007).
  25. Martin, D. D. O., et al. Rapid detection, discovery, and identification of post-translationally myristoylated proteins during apoptosis using a bio-orthogonal azidomyristate analog. The FASEB Journal. 22 (3), 797-806 (2007).
  26. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. The FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
  27. Martin, B. R., Wang, C., Adibekian, A., Tully, S. E., Cravatt, B. F. Global profiling of dynamic protein palmitoylation. Nature Methods. 9 (1), 84-89 (2012).
  28. Yap, M. C., et al. Rapid and selective detection of fatty acylated proteins using ω-alkynyl-fatty acids and click chemistry. Journal of Lipid Research. 51 (6), 1566-1580 (2010).
  29. Hang, H. C., Wilson, J. P., Charron, G. Bioorthogonal chemical reporters for analyzing protein lipidation and lipid trafficking. Accounts of Chemical Research. 44 (9), 699-708 (2011).
  30. Thinon, E., et al. Global profiling of co- and post-translationally N-myristoylated proteomes in human cells. Nature Communications. 5 (1), 4919(2014).
  31. Charron, G., Wilson, J., Hang, H. C. Chemical tools for understanding protein lipidation in eukaryotes. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (4), 382-391 (2009).
  32. Hang, H. C., et al. Chemical probes for the rapid detection of fatty-acylated proteins in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 129 (10), 2744-2745 (2007).
  33. Heal, W. P., et al. Site-specific N-terminal labelling of proteins in vitro and in vivo using N-myristoyl transferase and bioorthogonal ligation chemistry. Chemical Communications. 0 (4), 480-482 (2007).
  34. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  35. Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (ABE). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e50031(2013).
  36. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein palmitoylation database. F1000Research. 4, 261(2015).
  37. Heal, W. P., Wickramasinghe, S. R., Leatherbarrow, R. J., Tate, E. W. N -Myristoyl transferase-mediated protein labelling in vivo. Organic & Biomolecular Chemistry. 6 (13), 2308-2315 (2008).
  38. Lin, D. T. S., Conibear, E. ABHD17 proteins are novel protein depalmitoylases that regulate N-Ras palmitate turnover and subcellular localization. eLife. 4, 11306(2015).
  39. Charron, G., et al. Robust fluorescent detection of protein fatty-acylation with chemical reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
  40. Alsabeeh, N., Chausse, B., Kakimoto, P. A., Kowaltowski, A. J., Shirihai, O. Cell culture models of fatty acid overload: Problems and solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (2), 143-151 (2018).
  41. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
  42. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6 (2), 135-138 (2009).
  43. Gao, X., Hannoush, R. N. Single-cell in situ imaging of palmitoylation in fatty-acylated proteins. Nature Protocols. 9 (11), 2607-2623 (2014).
  44. Muszbek, L., Haramura, G., Cluette-Brown, J. E., Cott, E. M. V., Laposata, M. The pool of fatty acids covalently bound to platelet proteins by thioester linkages can be altered by exogenously supplied fatty acids. Lipids. 34, 331-337 (1999).
  45. Brett, K., et al. Site-specific S-Acylation of influenza virus hemagglutinin. The location of the acylation site relative to the membrane border is the decisive factor for attachment of stearate. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34978-34989 (2014).
  46. Shieh, P., et al. CalFluors: A universal motif for fluorogenic azide probes across the visible spectrum. Journal of the American Chemical Society. 137 (22), 7145-7151 (2015).
  47. Pelletier, A. R., et al. MealTime-MS: A machine learning-guided real-time mass spectrometry analysis for protein identification and efficient dynamic exclusion. bioRxiv. , 110726(2020).
  48. Gao, X., Hannoush, R. N. Method for cellular imaging of palmitoylated proteins with clickable probes and proximity ligation applied to Hedgehog, tubulin, and Ras. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4544-4550 (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

BSA
Оптимизированное включение аналогов алкиниловых жирных кислот для обнаружения жирных ацилированных белков с помощью Click Chemistry
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.