Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Крысиная модель инфекции мозга EcoHIV

3.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62137

⸱

21 января 2021 г.

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для создания новой крысиной модели активной ВИЧ-инфекции с использованием химерного ВИЧ (EcoHIV), которая имеет решающее значение для улучшения нашего понимания вирусных резервуаров ВИЧ-1 в мозге и предлагает систему для изучения ВИЧ-ассоциированных нейрокогнитивных расстройств и связанных с ними сопутствующих заболеваний (то есть злоупотребления наркотиками).

Аннотация

Было хорошо изучено, что модель мыши, инфицированная EcoHIV, имеет значительную полезность при исследовании неврологических осложнений, связанных с ВИЧ. Создание модели ecoHIV инфицированных крыс для изучения злоупотребления наркотиками и нейрокогнитивных расстройств было бы полезным при изучении нейроHIV и ВИЧ-1-ассоциированных нейрокогнитивных расстройств (HAND). В настоящем исследовании мы демонстрируем успешное создание крысиной модели активной ВИЧ-инфекции с использованием химерного ВИЧ (EcoHIV). Во-первых, лентивирусная конструкция EcoHIV была упакована в культивирование 293 FT-клеток в течение 48 часов. Затем условная среда была сконцентрирована и титрована. Затем мы выполнили двусторонние стереотаксические инъекции EcoHIV-EGFP в ткань мозга крысы F344/N. Через неделю после заражения в инфицированной ткани мозга были обнаружены флуоресцентные сигналы EGFP, что указывает на то, что EcoHIV успешно индуцирует активную ВИЧ-инфекцию у крыс. Кроме того, было проведено иммуноокрашивание маркера микроглиальных клеток Iba1. Результаты показали, что микроглия была преобладающим типом клеток, скрывающих EcoHIV. Кроме того, крысы EcoHIV демонстрировали изменения во временной обработке, потенциальном нейроповеденческих механизмах HAND, а также синаптическую дисфункцию через восемь недель после заражения. В совокупности настоящее исследование распространяет модель EcoHIV инфекции ВИЧ-1 на крыс, предлагающих ценную биологическую систему для изучения вирусных резервуаров ВИЧ-1 в мозге, а также HAND и связанных с ней сопутствующих заболеваний, таких как злоупотребление наркотиками.

Введение

Биологические системы улучшили наше понимание нейрокогнитивных расстройств, связанных с ВИЧ-1 (HAND), и лежащих в их основе нейронных механизмов2. Определение того, какая биологическая система наиболее подходит для любого данного исследования, часто зависит от интересующего вопроса2. Ограничение диапазона моделей животных-хозяев ставит под вопросы исследования развития болезни ВИЧ-1. Для исследования репликации и патогенеза вируса ВИЧ-1 Potash et al.3 создали мышиную модель активной инфекции ВИЧ-1, заменив кодировку области гликопротеина поверхностной оболочки ВИЧ, gp120, экотропным MLV gp80, что привело к успешной репликации вируса у мышей4. После инъекций в хвостовую вену у химерных мышей с ВИЧ (EcoHIV) наблюдалось много характеристик, напоминающих характеристики серопозитивных людей ВИЧ-1 (например, инфицированные лимфоциты и макрофаги, нацеленные на противовирусные иммунные реакции, и воспаление3,5,6).

Хотя мыши и крысы являются членами Muridae, фундаментальные видовые различия могут влиять на их пригодность для конкретных экспериментальных вопросов7. Таким образом, распространение модели инфекции EcoHIV на крыс (обычно используемой в исследованиях злоупотребления наркотиками и нейрокогнитивных расстройств) было бы выгодным при изучении neuroHIV. Например, их больший размер делает имплантацию яремного катетера для процедур самостоятельного введения лекарств более практичной8. Методы самостоятельного введения лекарств у крыс были использованы для оценки мотивации при ВИЧ-19. Кроме того, многие нейрокогнитивные / поведенческие задачи были первоначально разработаны для крыс10. Здесь мы сообщаем об использовании стереотаксических инъекций EcoHIV у крыс для расширения модели инфекции EcoHIV и предоставления ключевой возможности для решения новых вопросов, связанных с neuroHIV и HAND.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Южной Каролины (федеральный номер гарантии: D16-00028). Шесть взрослых самцов крыс F344/N были размещены в контролируемой среде при свете 12/12: темный цикл с доступом ad libitum к пище и воде. Обо всех животных заботились в целях использования руководящих принципов, установленных Национальными институтами здравоохранения в Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию.

1. Упаковка вируса в 293 FT клетки

  1. Культивируем 293 FT клетки (5×105/мл) в желатиновые покрытые 75см2 колбы с DMEM плюс 10% FBS11. Выращивайте клетки при 37 °C, чтобы они были 50% конфюентными при трансфекции.
  2. Разбавляют 22,5 мкл трансфекционного реагента (например, Lipofectamine 3000) в 750 мкл среды (например, Opti-MEM) в микроцентрифужной трубке 1,5 мл и вихре в течение 3 с.
  3. Развести 20 мкг плазмидной ДНК EcoHIV в 750 мкл среды в микроцентрифужной трубке 1,5 мл и хорошо перемешать.
  4. Добавьте разбавленный ДНК в пробирку разбавленного трансфекционного реагента и аккуратно перемешайте. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
  5. Добавьте смесь в 10 мл предварительной смременной среды DMEM в колбу 75см2. Инкубировать клетки в течение 2 дней при 37 °C.
  6. Собирают и убирают 24 мл условной среды из двух колбы, в состав которого входит упакованный лентивирус.
  7. Центрифуга все 24 мл условной среды при 500 х г в течение 10 минут при 4 °C. Переложите осветленное супернатант в стерильную трубку 50 мл.
  8. Смешайте 8 мл концентратора Lenti-x с 24 мл осветленного супернатанта (соотношение 1:3). Перемешать путем мягкой инверсии. Инкубировать смесь при 4 °С в течение двух дней.
  9. Центрифужная смесь при 1 500 х г в течение 45 минут при 4 °C. Осторожно удалите супернатант.
  10. Осторожно повторно суспендируйте гранулы со 100 мкл 100 мМ PBS.
  11. Концентрация вируса титра с набором p24 ELISA.

2. Стереотаксические операции на вирусе EcoHIV-EGFP

  1. Обезболивать крыс, используя 3% севофлурана. Переходите к шагу 2.2, когда крысы не реагируют на ядные раздражители и рефлексы отсутствуют.
  2. Сбрите волоски из области мозга и стерилизуйте кожу дважды с 70% этанолом и скрабом на основе хлоргексидина. Закрепите крысу в положении лежа в стереотаксическом аппарате.
  3. Сделайте разрез (5-6 см) через кожу вдоль средней линии волосистой части головы.
  4. Отметьте два положения сверления на 0,8 мм боковой, 1,2 мм ростральной до брегмы. Просверлите отверстие (диаметр 0,4 мм) в каждом положении черепа.
  5. Заполните титрованный раствор лентивируса EcoHIV (1,04 × 106 TU/мл) в шприц для инъекций 10 мкл. Закрепите шприц к стереотаксическому аппарату.
  6. Сдвиньтесь вниз по игле вплотную к поверхности сверления отверстия. Измеряйте и перемещайте 2,5 мм в глубину.
  7. Наполнить 1 мкл раствора вируса со скоростью 0,2 мкл/мин. Держите иглу внутри области инъекции в течение 5 мин. Медленно перемещайте иглу вверх, пока она не появится за пределами черепа крысы.
  8. Зашиваем кожу шелковой нитью 4-0.
  9. Стерилизуйте разрез 70% этанолом однократно. Подкожно вводят буторфенол (Доролекс, 0,1 мг/кг массы тела).
  10. Перенесите крысу в камеру восстановления с грелкой, пока она не проснется.

3. Визуализация участков мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите от одной до восьми недель после вирусной инфузии EcoHIV.

  1. Обезболивают крыс 5% севофлураном. Продолжайте двигаться к шагу 3.2, когда крысы не реагируют на пазубные раздражители и рефлексы отсутствуют.
  2. Зафиксируйте крысу в положении лежа на спине внутри вытяжного капюшона.
  3. Разрезать кожу вдоль грудной средней линии. Разрезать диафрагму и открыть грудную полость.
  4. Вставьте 20 г × 25 мм иглы в левый желудочек.
  5. Сразу же открыть ножницами правое предсердие.
  6. Перфьюсировать 50 мл предварительно охлажденного 100 мМ PBS со скоростью 5 мл/мин.
  7. Перфьюировать 100 мл холодного 4% параформальдегида со скоростью 5 мл/мин.
  8. Обезглавить крысу, открыть кожу головы и удалить мозг.
  9. Постфикс на ночь с 4% параформальдегидом.
  10. Переведите мозг на 40 мл 30% сахарозы в 100 мМ PBS в трубке 50 мл до тех пор, пока мозг не всплывет на дно (около 3 дней).
  11. Заморозьте мозг в метилбутаноле в течение 2 мин при - 80 °C.
  12. Закрепите ткани мозга на металлической платформе внутри криостата -20 °C.
  13. Вырежьте корональные срезы толщиной 50 мкм с помощью криостата.
  14. Переложите кусочки мозга на стеклянные слайды тонкой кистью.
  15. Монтаж секций в 0,3 мл противотеклоплавого средства и покрытие с 22 мм 50 мм обтекательными прорезями.
  16. Держите стеклянные горки в темноте при комнатной температуре до высыхания.
  17. Визуализируйте целевые нейроны с помощью конфокального микроскопа с помощью Z-стека на основе границ областей мозга и морфологических характеристик нейронов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались настройки конфокального микроскопа: увеличение 60 X (A/1,4, масло) и интервал Z-плоскости 0,15 мкм (размер точечного отверстия 30 мкм; обратно проецируемый радиус точечного отверстия 167 нм) с использованием длины волны 488 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Кондиционированная среда была собрана из лентивируса инфицированных EcoHIV-EGFP 293FT клеток. Затем его концентрировали и титровывали, а затем стереотаксически вводили в мозг (кортикальная область) крыс F344/N. Через семь дней после инъекции крыс приносили в жертву и делали изображения с коронарных срезов мозга в диапазоне от брегмы 5,64 мм до брегмы -4,68 мм. На рисунке 1Aприсутствуют значительные сигналы EcoHIV-EGFP по всему мозгу, особенно в коре головного мозга и извилине гиппокампа. Кро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы установили модель ВИЧ-инфекции, индуцированную EcoHIV, у крыс. В частности, мы описали двустороннюю стереотаксическую инъекцию EcoHIV в кору, которая успешно индуцировала активную ВИЧ-инфекцию в мозге крыс через 7 дней после инъекции. Кроме того, мы демонстрируем, что инфекция EcoHIV у крыс может быть хорошей биологической системой для изучения ключевых аспектов HAND. Через восемь недель после заражения EcoHIV у крыс демонстрировались значительные нейрокогнитивные нарушения, которые включали изменения...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни у одного из авторов нет конфликта интересов, о чем можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа финансировалась грантами NIH HD043680, MH106392, DA013137 и NS100624.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
293FT клеткиThermoFisher ScientificR70007
Антибиотик-антимикотический растворCellgro30004CI100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Прямоугольная колба для культивирования клеток с наклонной шейкой и вентилируемым колпачкомLife Technologies354488
Corning DMEM с L-глутамином, 4,5 г/л глюкозы и пирувата натрияLife Technologies10013CV
Защитное стеклоVWR637-137
сверло
Dumont #5 ЩипцыWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 ЩипцыWorld Precision Instruments14097
Eppendorf Snap-Cap Микроцентрифуга Biopur Safe-Lock TubesLife Technologies22600028
Ethicon Vicryl Plus антибактериальный, 4-0 Полиглактин 910 Шовный материал, 27 дюймов. FS-2Med Vet InternationalVCP422H
Шприц HamiltonHamilton1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Реагент для трансфекцииLife TechnologiesL3000015
Щипцы для ирисаWorld Precision Instruments15914
Ножницы с диафрагмойWorld Precision Instruments500216
Лентивирус-ассоциированный p24 ИФА KitCell Biolabs, inc.VPK-107-5
Концентратор Lenti-XTakaraPT4421-2
Opti-MEM I Уменьшенная сыворотка MediumLife Technologies11058021
параформальдегидSigma-Aldrich158127-500G
ПараформальдегидSigmaP6148
ProLong GoldFisher ScientificP36930
СевофлуранMerritt Veterinary Supply347075
стереотаксический аппаратKopf InstrumentsModel 900
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154%
Vannas ScissorsWorld Precision Instruments500086

Ссылки

  1. Illenberger, J. M., et al. HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).
  2. Joseph, S. B., Swanstrom, R. The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells. Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).
  3. Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).
  4. Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection. Cell. 57, 659-666 (1989).
  5. Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).
  6. Gu, C. J., et al. EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment. PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).
  7. Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: is it a rat race. Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).
  8. Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).
  9. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).
  10. McGaughy, J., Sarter, M. Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands. Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).
  11. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).
  12. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).
  13. McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).
  14. Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).
  15. Ko, A., et al. Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).
  16. Sopper, S., et al. The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey. Virology. 220 (2), 320-329 (1996).
  17. Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency. Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Крысиная модель EcoHIVинфекция головного мозга ВИЧстереотаксическая инъекциянейрокогнитивные расстройстваинфекция микроглиивременная обработка информацииморфология дендритных шипиковконфокальная микроскопиялентивирусный пакетингвирусные резервуары ВИЧ
Крысиная модель инфекции мозга EcoHIV
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.