Методическая статья

Визуализация кишечника с помощью «CLARITY»

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62143

⸱

11 июня 2021 г.

 , 
1Department of Pathology & Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол пассивного окрашивания кишечника мышей методом CLARITY (PACT) для визуализации субэпителиальных тканей, включая нейроны, глию и энтероэндокринные клетки (ЭЭК) без разрезания тканей. Протокол включает в себя встраивание гидрогеля в ткань, фиксированную формальдегидом, и последующее удаление липидирования с использованием анионного моющего средства для «очистки» ткани.

Аннотация

CLARITY (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) в последнее время стал ценным методом, включающим встраивание акриламида для делипидата ткани (без разреза) и сохранения трехмерной структуры ткани для иммуноокрашивания. Этот метод очень актуален для визуализации динамической среды кишечника, где различные типы клеток взаимодействуют во время гомеостаза и болезненных состояний. Этот метод, оптимизированный для кишечника мыши, описан здесь, который помогает проследить такие типы клеток, как эпителий, энтероэндокринные, нейроны, глия и нейрональные проекции в эпителии или энтероэндокринные клетки, которые опосредуют микробное восприятие или химиочувствительность питательных веществ соответственно. Ткань кишечника (1-1,5 см) фиксируется в 4% параформальдегиде (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS) при 4 °C в течение ночи в 1-й день. На 2-й день ПФА отбрасывают, а салфетку трижды промывают PBS. Ткань залита гидрогелем для сохранения ее целостности путем инкубации в 4% растворе гидрогеля (акриламида) в PBS (разбавленном из 30% ProtoGel) в течение ночи при 4 °C. На 3-й день тканево-гидрогелевый раствор инкубируют при 37 °C в течение 1 ч для обеспечения полимеризации гидрогеля. Затем ткань трижды аккуратно промывают PBS, чтобы удалить излишки гидрогеля. Следующий этап делипидации (очистки) включает инкубацию тканей в додецилсульфате натрия (8% SDS в PBS) при 37 °C в течение 2 дней (дни 4 и 5) в шейкере при комнатной температуре (RT). На 6-й день очищенную ткань тщательно промывают PBS для удаления SDS. Иммуноокрашивание ткани может быть осуществлено путем инкубации в первичных антителах (разбавленных в 0,5% нормальной ослиной сыворотки в PBS, содержащей 0,3% Triton X-100), в течение ночи при 4°C и последующей инкубации в соответствующих вторичных антителах Alexa Fluor в течение 1,5 ч при ЛТ, а также ядерного окрашивания DAPI (1:10000). Ткань переносится на чистое предметное стекло и монтируется с помощью VectaShield для конфокальной визуализации.

Введение

CLARITY (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) в последнее время развился как ценный метод, включающий встраивание акриламида (гидрогеля) и делипидирование тканей для сохранения трехмерной структуры ткани для иммуноокрашивания (без разреза)1,2. Вложенная в гидрогель ткань оптически прозрачна и макромолекулярно-проницаема, при этом белки и нуклеиновые кислоты сохраняются после удаления липидов с помощью детергента. В 2013 году журнал CLARITY был признан одним из десяти заметных прорывов по версии Science3. Несмотря на то, что первоначально этот метод был разработан для визуализации богатых липидами тканей мозга, где липиды влияют на рассеяние света и качество визуализации, в настоящее время этот метод широко используется для визуализации других тканей, таких как кишечник, печень, почки и сердце. Этот метод дает возможность окрашивать и визуализировать ткань, устраняя необходимость в разрезах, что в противном случае могло бы привести к смещенной оценке межклеточных взаимодействий из-за неравномерного распределения типов клеток. Этот метод также дает возможность выполнять конфокальные z-стеки и воссоздавать трехмерное изображение ткани, что может помочь определить плотность, микроархитектуру и межклеточное взаимодействие между различными типами клеток более реалистично, чем по тканевому срезу. Кроме того, метод был модифицирован для обеспечения иммуноокрашивания плотных тканей, таких как кости, а также для проведения исследований гибридизации in situ. Встроенная в гидрогель 3D-ткань предлагает привлекательную платформу для выяснения взаимодействий между эпителиальными, энтероэндокринными, глиальными и нейрональными клетками, которые в последнее время были названы критически важными для понимания патофизиологии таких заболеваний, как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, расстройства аутистического спектра и т.д.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом Университета Эмори по использованию и уходу за животными. Мышам C57BL/6 (можно использовать как самцов, так и самок) в возрасте 8-12 недель разрешался свободный доступ к пище и воде до эвтаназии.

1. Удаление кишечника (день 1)

  1. Усыпить мышь методом удушения углекислым газом со скоростью потока 1,6 мл углекислого газа до прекращения дыхания в течение 2 мин.
  2. Положите мышь лежа на препарирующую доску с прикрепленными конечностями. Простерилизуйте брюшную полость с помощью 70% этанола. С помощью щипцов разрежьте кожу ножницами.
  3. Осторожно поднимите печень и определите живот. Затем, придерживая живот щипцами, отрежьте пищевод чуть выше живота. Удерживая живот щипцами, аккуратно отрежьте брыжейки и отделите кишечник от брюшной полости вплоть до прямой кишки. Отрежьте оторвавшуюся кишку в области прямой кишки.
  4. Переложите отделенную кишку в ледяной раствор PBS в чашке Петри. Теперь аккуратно отрежьте брыжейку между подвздошными сегментами и расправьте кишечник так, чтобы, начиная от желудка были отрезаны все брыжейки, вплоть до толстой кишки.
  5. Разрежьте 1-1,5 см нужной области кишечника для окрашивания CLARITY в новую чашку Петри, содержащую ледяной PBS.
  6. С помощью шприца объемом 5 мл, прикрепленного к тупому концу иглы 20 G, промойте содержимое кала с помощью ледяного PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любая область кишечника может быть использована для окрашивания CLARITY с использованием той же техники. Кишечный сегмент может быть разрезан вдоль брыжейки или использован в неповрежденном виде для последующих этапов.

2. Фиксация тканей кишечника (день 1)

  1. Зафиксировать ткань в 4% растворе параформальдегида (PFA) в PBS.
  2. Перенесите 1-1,5 см исследуемого кишечного сегмента в коническую трубку объемом 15 мл, заполненную 4% PFA при температуре 4 °C, на ночь для фиксации.

3. Заделка гидрогеля (День 2)

  1. Перенесите кишечный сегмент из 4% раствора PFA с помощью щипцов в новую коническую трубку объемом 15 мл с раствором PBS и промойте три раза (по 5 мин каждый, на шейкере со скоростью 150-200 об/мин), чтобы удалить остатки PFA.
  2. Приготовление 4% гидрогеля
    1. Для приготовления гидрогеля используйте 30% раствор геля (ProtoGel). Для приготовления 4% раствора гидрогеля разводят 30% исходный раствор, разведенный в PBS. Для приготовления 12 мл 4% гидрогеля берут 1,6 мл 30% раствора геля и добавляют 10,4 мл PBS.
  3. Перенесите неподвижную ткань из шага 3.1. до 4% раствора гидрогеля в PBS в коническую пробирку объемом 15 мл и инкубируют при 4 °С в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется промывать ткань без PFA с помощью PBS после ночной инкубации. Ткань, хранящаяся дольше в ПФА, не дает хороших результатов при последующих этапах и окрашивании. Неподвижная ткань после промывки PBS может храниться при температуре 4 °C в течение недели.

4. Этап полимеризации гидрогелем и делипидирования (очистки) (День 3)

  1. Выньте коническую трубку, содержащую ткань в растворе гидрогеля, при температуре от 4 °C. Переложите на водяную баню при температуре 37 °C и выдержите в течение 1 часа. На этом этапе происходит полимеризация гидрогелем.
  2. Через 1 ч выньте коническую трубку, содержащую гидрогель, залитую тканью водяной бани, и слейте раствор акриламида. Теперь аккуратно промойте салфетку одной промоушкой PBS при комнатной температуре, чтобы удалить излишки гидрогеля.
  3. Этап делипидации
    1. Делипидат путем инкубации ткани в додецилсульфате натрия (8% SDS) в PBS. Перенесите залитую гидрогелем ткань с шага 4.2 в 8% раствор SDS в коническую пробирку объемом 50 мл. Убедитесь, что ткань полностью погружена в раствор SDS, а трубка закрыта.
    2. Перенесите закрытую пробирку объемом 50 мл, содержащую ткань в SDS, в шейкер с температурой 37 °C (200 об/мин) при комнатной температуре на 2 дня (дни 4 и 5), чтобы обеспечить делипидацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раствор SDS заполнен не менее чем на 20-25 мл в коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы компенсировать любое испарение, которое может произойти при 37 °C в течение 2 дней инкубации.
  4. На 4 и 5 день инкубируйте ткань в SDS при температуре 37 °C (200 об/мин) при комнатной температуре.

5. Смывание моющего средства с очищенной салфетки (День 6)

  1. Возьмите ткань из раствора SDS. Ткань будет казаться «чистой» или прозрачной.
  2. Переложите ткань в новую комическую пробирку объемом 50 мл с раствором PBS и промывайте в течение дня на шейкере (150-200 об/мин) при комнатной температуре с несколькими сменами PBS, чтобы убедиться, что все следы SDS удалены. По крайней мере, 10 замен раствора PBS гарантируют, что салфетка не будет отделена от SDS, и хорошим эмпирическим правилом является проверить, нет ли при окончательной стирке PBS следов пены/пены от SDS. Это критически важный шаг, так как SDS может помешать последующим этапам окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце дня очищенная ткань после нескольких стирок в PBS теперь готова к иммуноокрашиванию или может храниться при температуре 4 °C до 3 недель.
  3. Хранение очищенных тканей кишечника более месяца в растворе PBS повлияет на целостность тканей и качество окрашивания. Используйте очищенную кишечную ткань сразу или в течение 1-2 недель после очищения для достижения наилучших результатов.

6. Иммунофлуоресцентное окрашивание нейронов, глии и энтероэндокринных клеток

  1. Переложите очищенную ткань в пробирку объемом 1,5 или 2 мл и инкубируйте в объеме 500 мкл соответствующих первичных антител, разведенных в 0,5% нормальной ослиной сыворотке в PBS, содержащей 0,3% Triton X-100) в течение ночи при 4 °C. Используемые антитела (Ab): Tuj1 или β-3-тубулин (Pan-нейрональный маркер, 1:1000), глиальный белок фибриллярной кислоты (GFAP, 1:500), хромогранин А (1:250).
  2. После ночной инкубации подвергните ткань 3 промывкам PBS (по 5 мин с использованием 1-1,5 мл PBS) для удаления несвязанного первичного Ab.
  3. Перенесите ткань в новую пробирку, а затем инкубируйте с 500 мкл соответствующего вторичного Alexa Fluor Ab (AF) в течение 1,5 ч при комнатной температуре в темноте. Вторичными Ab являются AF 488 для Tuj1 (1: 1000), AF-555 для GFAP (1: 500) и AF 555 (1 :250) для хромогранина A.
  4. После инкубации трижды промойте ткань PBS, как показано в Шаге 6.2.
  5. Для окрашивания ядер инкубируют ткань в DAPI (разведение 1: 10000 или 0,2 мкл в 2 мл PBS) в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. Наконец, перенесите окрашенную ткань на чистое предметное стекло, добавьте покровное стекло поверх салфетки и закрепите с помощью 100 мкл VectaShield для конфокальной визуализации.
  7. Поместите предметные стекла в темноте при комнатной температуре в держатель для слайдов на 30 минут для сушки, после чего их можно фотографировать или хранить при температуре -20 °C. Стенка кишки мыши довольно тонкая и после раскрытия вдоль брыжейки может быть установлена на стеклянные предметные стекла непосредственно с помощью покровного стекла. При работе с более крупными тканями, такими как селезенка, почки, камерные (полостные) стекла или спейсеры. Для более крупных тканей, например, для монтажа можно использовать предметное стекло.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что если кишечный сегмент не был разрезан на начальном этапе (см. примечание в шаге 1), рекомендуется разрезать кишечную трубку микроножницами, которые облегчат шаги, связанные с монтажом.

7. Конфокальная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенная, окрашенная и смонтированная ткань может быть немедленно визуализирована или храниться в предметных коробках при температуре -20°C.

  1. Изображение с помощью конфокального микроскопа (например, Olympus FV1000).
  2. Возьмите z-стеки на ткани кишечника толщиной 50 мкм, чтобы визуализировать области от просвета кишечника к серозальному слою.
  3. Сохраняйте изображения стека z в виде файлов изображений, .avi файлы фильмов или преобразуйте в 3D-изображение с помощью программного обеспечения5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Изображения из очищенной от CLARITY кишечной ткани мыши представлены на рисунке 1. Успешное завершение протокола дает высококачественные, четкие изображения, на которых можно четко визуализировать все детали сотовой связи. Окрашивание ядер DAPI является очень хорошим показателем для оценки качества протокола CLARITY и последующего иммуноокрашивания, поскольку оно может изобразить целостность тканей. Кроме того, форма клетки также дает ключ к пониманию того, насколько успешным был протокол, о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод CLARITY очень полезен для окрашивания кишечника мыши, чтобы визуализировать различные типы клеток, включая эпителии, нейроны и глиальные клетки в 3D, особенно сеть нейрональных проекций, которые простираются через стенку кишечника до просвета5 , и их иннервацию в глиальные клетки и клетки ЭЭК. Представленный здесь метод был модифицирован в соответствии с оригинальным исследованием Yang et al. 20141.

Важнейш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают признательность за поддержку со стороны Американской гастроэнтерологической ассоциации (AGA) AGA-Rome Functional GI Motility Motility Disorders Pilot Research Award (to BC), AI64462 гранта Национальных институтов здравоохранения США (ASN) и Интегрированного ядра клеточной визуализации Университета Эмори.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% параформальдегид (PFA)   в PBSThermoFischer ScientificJ19943Используется для фиксации тканей
4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI)ThermoFischer ScientificD13061/10,000 разведение
Alexa Fluor-488ThermoFischer ScientificA-110341/1000 разведение
Alexa Fluor-555ThermoFischer ScientificA-214281/500 разведение
Анти-GFAP (белок глиальной фибриллярной кислоты)Abcamab72601/500 разведение
Анти-бета III тубулин (или Tuj1)Abcamab182071/1000 разведение
хромогранин АAbcamab151601/250 разведение
ProtoGel  30%National DiagnosticsEC-890Токсичный, опасный, обращайтесь с осторожностью. сделать 4% раствор в PBS для использования
Додецилсульфат натрияThermoFischer Scientific283648% в
PBS Vectashield монтажная средаVector LaboratoriesH-1000

Ссылки

  1. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  3. 2013 Runners-Up. CLARITY makes it perfectly clear. Science. 342, 1434-1435 (2013).
  4. Fung, T. C. The microbiota-immune axis as a central mediator of gut-brain communication. Neurobiology of Disease. 136, 104714(2020).
  5. Chandrasekharan, B., et al. Interactions Between Commensal Bacteria and Enteric Neurons, via FPR1 Induction of ROS, Increase Gastrointestinal Motility in Mice. Gastroenterology. , (2019).
  6. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, 792-804 (2016).
  7. Muntifering, M., et al. Clearing for Deep Tissue Imaging. Current Protocols in Cytometry. 86, 38(2018).
  8. Cronan, M. R., et al. CLARITY and PACT-based imaging of adult zebrafish and mouse for whole-animal analysis of infections. Disease Models & Mechanisms. 8, 1643-1650 (2015).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355(2019).
  11. Milgroom, A., Ralston, E. Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging. Cell Biology International. 40, 478-483 (2016).
  12. Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J. W., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  13. Chen, Y., et al. Three-dimensional imaging and quantitative analysis in CLARITY processed breast cancer tissues. Scientific Reports. 9, 5624(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CLARITY
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи