Этот протокол сочетает гибридизацию in situ с иммунофлюоресценцией для идентификации генов обонятельных и вомероназальных рецепторов, экспрессируемых в обонятельных сенсорных нейронах после активации химическими стимулами у мыши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Этот протокол сочетает гибридизацию in situ с иммунофлюоресценцией для идентификации генов обонятельных и вомероназальных рецепторов, экспрессируемых в обонятельных сенсорных нейронах после активации химическими стимулами у мыши.
Животные полагаются на химическую коммуникацию для передачи и восприятия соответствующей информации об окружающей среде, начиная от оценки качества пищи и заканчивая обнаружением доступных партнеров для спаривания или угроз. У мышей эта задача выполняется в первую очередь обонятельной системой и лежащими в ее основе подсистемами, включая основную и вспомогательную обонятельные системы. Оба имеют периферические органы, населенные сенсорными нейронами, экспрессирующими рецепторы, сопряженные с G-белком, способные связывать химические сигналы, которые достигают носовой полости. Несмотря на то, что молекулярные характеристики этих рецепторов хорошо изучены, мало что известно об их родственных специфических лигандах. Описанный здесь метод сочетает обнаружение in situ гибридизации обонятельных или вомероназальных рецепторов с иммунодетекцией фосфорилированного рибосомального белка S6 (pS6) – маркера активации нейронов. Этот протокол был разработан для идентификации нейронов, активированных после одного события воздействия очищенных или сложных химических стимулов, обнаруженных обонятельными органами. Важно отметить, что этот метод позволяет исследовать нейроны, запускаемые в биологически значимых контекстах. В идеале этот метод должен быть использован для исследования молекулярной биологии обонятельной системы и изучения обонятельного поведения.
Хемосигнализация является наиболее распространенной формой коммуникации у животных. У млекопитающих обнаружение химических сигналов опосредовано в основном через обоняние и имеет первостепенное значение для поиска пищи, поиска возможных партнеров для спаривания и избеганияпотенциальных хищников. Обонятельная система мыши далее делится на различные подсистемы, каждая из которых обладает своими анатомическими, физиологическими и молекулярными свойствами4. Среди них основная обонятельная система (МОС) и добавочная обоняте....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Процедуры с животными проводились в соответствии с Протоколом для животных #1883-1, утвержденным Университетом Кампинаса (Комитет по институциональному уходу за животными и их использованию Института биологии - Комитет по этике использования животных в исследованиях), который следует руководящим принципам, установленным федеральным Национальным советом по контролю за экспериментами на животных (CONCEA).
1. Подготовка материала
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Текущий протокол направлен на получение микроскопических изображений, в которых ген экспериментатора, представляющий интерес, и маркер нейронной активности pS6 флуоресцентно помечены. Описанный метод включает в себя усиление тирамидного сигнала, которое дает четкую и четкую маркировку практически без фона. Иммуноокрашивание pS6 проявляется в виде цитоплазматического флуоресцентного сигнала, который обычно заполняет все тело нейронных клеток, в то время как сигнал гибридизации in situ для нейронов обонятельных ре.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Описанный здесь протокол надежно идентифицирует сенсорные нейроны, активируемые химическими сигналами в обонятельной системе посредством комбинации in situ обнаружения рецепторов OR или VR с иммунодетекцией pS6, косвенного маркера нейронной активности. Экспериментатор должен проявлять особую осторожность для поддержания гистологической целостности и выполнять все этапы перед гибридизацией в условиях, свободных от РНКазы. Невыполнение этого требования может привести к деградации .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что у них нет никаких конкурирующих интересов.
Мы благодарим GAG Pereira и JA Yunes за ресурсы, APF Ferreira и WO Bragança за административную и техническую помощь, а также сотрудников Life Sciences Core Facility (LaCTAD-UNICAMP) за помощь в проведении конфокальной микроскопии. Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Сан-Паулу (FAPESP; номера грантов 2009/00473-0 и 2015/50371-0 для F.P.), PRP/UNICAMP (номера грантов 2969/16, 725/15, 348/14 и 315/12 для F.P.), стипендиями FAPESP для V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1) и стипендией Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) для T.S.N.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10x фосфатно-солевой буфер (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | н/д |
| 20x усилитель разбавителя (реакционный буфер из Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit) | Thermo Fisher Scientific | B40923 или B40922 | упоминается как буфер усиления А в рабочих растворах для усиления сигнала тирамид-Alexa 488 или тирамид-Alexa 555 |
| 20x SSC | Merck (Calbiochem) | 8310-OP | n/a |
| 30% бычьего сывороточного альбумина (BSA) | Merck (Sigma-Aldrich) | A9576 | n/a |
| 30% пероксида водорода (H2O2) | Merck (Sigma-Aldrich) | H1009 | n/a |
| Ангидрид уксусной кислоты | Merck (Sigma-Aldrich) | 320102 | н/д |
| Агароза | Merck (Sigma-Aldrich) | A9539 | н/а |
| Разбавитель амплификации (из набора TSA Biotin) | Akoya Biosciences (Perkin Elmer) | SAT700001EA | упоминается как буфер усиления B в рабочем растворе для усиления сигнала тирамид-биотин |
| Anti-pS6 (Ser 244/247) кроличье поликлональное антитело | Thermo Fisher Scientific | Cat# 44-923G, RRID:AB_2533798 | н/д |
| Блокирующий буфер 1x (из набора Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost) | Thermo Fisher Scientific | B40923 или B40922 | упоминается как блокирующий раствор B на стадии развития тирамидного сигнала |
| Блокирующий реагент (из набора TSA Biotin) | Akoya Biosciences (Perkin Elmer) | SAT700001EA | упоминается как блокирующий реагент A в составе для TNB-буфера |
| DAPI ядерное окрашивание | Thermo Fisher Scientific | D1306 | n/a |
| Denhardt's solution (50x) | Merck (Sigma-Aldrich) | D9905 | n/a |
| Деоинизированный формамид | Merck (Sigma-Aldrich) | F9037 | н/д |
| раствор сульфата декстрана (50%) | Merck (Chemicon) | S4030 | н/д |
| Этилен-диамин-тетрауксусная кислота (ЭДТА) | Merck (Sigma-Aldrich) | E9884 | н/д |
| Hoechst 33342 ядерное окрашивание | Thermo Fisher Scientific | H1399 | н/д |
| Соляная кислота (HCl) | Merck ( Sigma-Aldrich) | 320331 | н/д |
| Обонятельные стимулы | n/a | Papes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020) | n/a |
| Параформальдегид | Merck (Sigma-Aldrich) | P6148 | n/a |
| Пероксидаза-конъюгированное антидигоксигениновое антитело (Fab-фрагменты) | Merck (Roche) | 11207733910; RRID:AB_514500 | упоминается как пероксидаза-конъюгированное анти-DIG |
| антитело пероксидаза-конъюгированное вторичное антитело против кролика (полиHRP-конъюгированное козье анти-кроличье реагент из Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit) | Thermo Fisher Scientific | B40922 | н/д |
| пероксидаза-конъюгированный стрептавидин (из набора биотина TSA) | Akoya Biosciences (Perkin Elmer) | SAT700001EA | н/д |
| ProLong Gold антивыцветающий монтант | Thermo Fisher Scientific | P36934 | упоминается как антивыцветающая монтажная среда |
| без РНКазы сверхчистая вода | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | н/д |
| Хлорид натрия (NaCl) | Merck (Sigma-Aldrich) | S9888 | н/а |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 436143 | н/д |
| Гидроксид натрия (NaOH) | Merck (Sigma-Aldrich) | S8045 | н/а |
| Сахароза | Merck (Sigma-Aldrich) | S0389 | н/а |
| Триэтаноламин | Merck (Sigma-Aldrich) | T58300 | н/д |
| Тритон X-100 | Merck (Sigma-Aldrich) | X100 | н/д |
| Тризма гидрохлорид (Tris-Cl) | Merck (Sigma-Aldrich) | T5941 | н/д |
| Tween-20 | Merck (Sigma-Aldrich) | 822184 | н/д |
| конъюгат тирамид-Alexa 488 (из набора Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost) | Thermo Fisher Scientific | B40922 | н/д |
| Конъюгат тирамида-Alexa 555 (из набора Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost) | Thermo Fisher Scientific | B40923 | н/д |
| конъюгат тирамида-биотина (из набора TSA Biotin) | Akoya Biosciences (Perkin Elmer) | SAT700001EA | н/д |
| дрожжевой тРНК | Merck (Roche | )10109495001 | н/д |
| сильный>критический коммерческий анализ и животные | |||
| Alexa Fluor 488 Набор Tyramide SuperBoost | Thermo Fisher Scientific | B40922 | н/д |
| Alexa Fluor 555 Набор Tyramide SuperBoost | Thermo Fisher | Scientific B40923 | н/д |
| Набор для мечения РНК DIG (SP6/T7) | Merck (Roche) | 11175025910 | н/д |
| Высокочувствительные реагенты для анализа РНК ScreenTape (буферные, лестничные и ленточные) | Agilent | 5067-5580, 5067-5581 и 5067-5579 | упоминается как автоматизированная система электрофореза |
| Мышь: C57BL/6J инбредный штамм | Jackson | Laboratories Stock No: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664) | n/a |
| ProbeQuant G-50 Micro Columns | Cytiva Biosciences | 28903408 | как набор для очистки на основе гелевой фильтрации |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28506 | упоминается как мини-набор для очистки гелем на основе колонок |
| RNeasy MinElute набор для очистки | Qiagen | 74204 | как мини-набор для очистки РНК на основе колонок |
| TSA Биотиновый набор | Akoya Biosciences (Perkin Elmer) | SAT700001EA | н/д |
| <стронг>олигонуклеотиды | |||
| 5' – AAACTTCATCCTTACAGAATGG CAG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr692 |
| 5' – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5'- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT TCCC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr124 |
| 5' – TTGACCCAAAAACTCCTTTGTTAG TG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA GAG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr1509 |
| 5' – TAGAAAACCGATACCACCTTC G – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – TACATCCTGACTCAGCTGGA ACG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr1512 |
| 5' – GGGCACATAGTACACA ATAGTC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG G – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr78 |
| 5' – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA G – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC TG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr691 |
| 5' – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT GTC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – AGAAGTAACTAACACCACTCAT GGC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr638 |
| 5' – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG TTC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr569 |
| 5' – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC AAGC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA CTG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r1 |
| 5' – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG AG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT TCTTACAGGACAG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r2 |
| 5' – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT AAGCAAGGAATTCCAC – 3'Integrated | DNA Technologies | n/a | |
| 5' – TAGGAAGCTATTTGCCTTTTC CAC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r13 |
| 5' – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC CAG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG ATCT – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r89 |
| 5' – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC A – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC TTCTGGAG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r118 |
| 5' – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG CCAGATATGTCAC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT CCCAGATGCTTTTGG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r116 |
| 5' – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT AGCTGAGAAATACAAC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – TGGGTGTCTTCTTTCCTCAA GA – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r28 |
| 5' – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA CTGT – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT TCC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r41 |
| 5' – CATTTGTGGATGACATCACAATT TGG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC G – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r46 |
| 5' – AGTGGGTCTTTTTTAGAAAGGAG TG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG GC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r69 |
| 5' – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC C – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC AG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r58 |
| ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA AGCATCG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r90 |
| 5' – CATATTCCACAGAAGAGAAGT TGGAC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT TTAGAC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r107 |
| 5' – CCCTTGTTGCACAAAATGAT GATGTGA – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| 5' – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT CTACTACACCATGATGG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r83 |
| 5' – ATCCTCGAGTCAATCATTAT AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| Recombinant DNA | |||
| pGEM-T-Easy вектор | Promega | A1360 | рекомендован для клонирования ПЦР вектор |
| Other materials | |||
| 1mL шприцы | Fisher Scientific | 14-829-10F | н/д |
| Конические пробирки (15 мл и 50 мл) | Fisher Scientific | 14-432-22, 14-959-49B | н/д |
| Банки для коплина | Fisher Scientific | 12-567-099, 07-200-81 | н/д |
| Криостат | Leica Biosystems | CMS 1850 | н/д |
| Инструменты для препарирования и щипцы | Roboz | RS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111 | н/д |
| Сухая ванна | н/д | /д | |
| Электрофорез оборудование | Fisher Scientific | 09-528-110B | н/д |
| Кисти тонкой точки | Winsor & Newton | 10269097 | н/д |
| Флуоресцентный или конфокальный микроскоп | Leica Microsystems | TCS SP5II | н/д |
| Нагреваемая пластина | Fisher Scientific | HP88850200 | н/д |
| Увлажненная камера (при использовании при более высоких температурах его необходимо будет запечатать в пластиковый контейнер Tupperware) | Thermo Fisher Scientific | 22-045-034 | н/д |
| безворсовая лаборатория Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | относится к безворсовой лабораторной папиросной бумаге |
| Микроцентрифуга | Eppendorf | 5401000013 | н/д |
| Клетки для мышей | InnoVive | M-BTM, MVX1 | н/д |
| ПЦР Термоамплификатор | Thermo Fisher Scientific | 4375786 | н/д |
| Пипетка p1000, p200 и p20 одноразовые наконечники | Fisher Scientific | 02-707-408, 02-707-411, 02-707-438 | н/д |
| Пластиковая гистологическая форма для встраивания | Thermo Fisher Scientific | 22-19 | н/д |
| Кубит 4 Флуориметр | Thermo Fisher Scientific | Q33238 | относится к высокочувствительному флуориметрическому |
| методу Бритвенные лезвия или скальпели | Fisher Scientific | 12-640 | н/д |
| РНК ленточная станция или биоанализатор | Agilent | 4200 TapeStation System или 2100 Прибор для биоанализатора | н/д |
| РНКазы стеклянные или пластиковые градуированные цилиндры и стаканы | Fisher Scientific | 10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25D | н/д |
| Стереомикроскоп | Leica Microsystems | M80 | н/д |
| SuperFrost Plus предметные стекла | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | относятся к положительно заряженным предметным стеклам микроскопа |
| Parafilm | Bemis компании | PM999 | упоминается как термопластичная лабораторная пленка |
| Водяная баня | Thermo Fisher Scientific | TSCIR19 | н/д |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно