Методическая статья

Два анализа инфекции для изучения фенотипов нелетальной вирулентности у C. albicans с использованием C. elegans

DOI:

10.3791/62170

⸱

17 мая 2021 г.

 ,  , 
1Graduate Program in Genetics & Molecular Biology, Emory University, 2Department of Biology, Emory University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Грибковые условно-патогенные микроорганизмы могут вызывать как опасные для жизни, так и незначительные инфекции, но нелетальные фенотипы часто игнорируются при изучении вирулентности. Поэтому мы разработали модель нематоды, которая отслеживает как выживаемость, так и репродуктивные аспекты хозяина, чтобы исследовать вирулентность грибов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В то время как патогены могут быть смертельно опасными для человека, многие из них вызывают ряд типов инфекций с нелетальными фенотипами. Candida albicans, условно-патогенный грибковый патоген человека, является четвертой по распространенности причиной внутрибольничных инфекций, которые приводят к ~40% смертности. Тем не менее, другие инфекции C. albicans менее тяжелы и редко приводят к летальному исходу и включают вульвовагинальный кандидоз, поражающий ~75% женщин, а также кандидоз ротоглотки, преимущественно поражающий младенцев, пациентов со СПИДом и онкологических больных. В то время как мышиные модели чаще всего используются для изучения патогенеза C. albicans, эти модели в основном оценивают выживаемость хозяина и являются дорогостоящими, трудоемкими и ограниченными в репликации. Поэтому для изучения C. albicans было разработано несколько мини-модельных систем, в том числе Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella и Caenorhabditis elegans. Эти мини-модели хорошо подходят для скрининга мутантных библиотек или разнообразного генетического фона C. albicans. Здесь мы описываем два подхода к изучению инфекции C. albicans с использованием C. elegans. Первый — это анализ плодовитости, который измеряет размножение хозяев и отслеживает выживание отдельных хозяев. Второй — это анализ расширения линии, который измеряет, как инфекция C. albicans влияет на рост популяции хозяина в течение нескольких поколений. Вместе эти анализы обеспечивают простой и экономически эффективный способ быстрой оценки вирулентности C. albicans.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans является условно-патогенным грибом человека, обитающим в различных нишах, включая ротовую полость, желудочно-кишечный тракт и мочеполовой тракт1. Несмотря на то, что C. albicans обычно комменсальный, он вызывает инфекции слизистых оболочек и кровотока, последние из которых могут быть смертельными. Тяжесть инфекции C. albicans зависит от иммунной функции хозяина, при этом люди с ослабленным иммунитетом более восприимчивы к инфекции, чем здоровые люди1. В дополнение к факторам, связанным с хозяином, C. albicans обладает несколькими признаками вирулентности, которые включают гифы, образование биопленки и продукцию секреторных аспартилпротеиназ (SAP), которые способствуют адгезии и инвазии C. albicans в эпителиальные клетки хозяина2, а также кандидализин, цитолитический пептидный токсин 3,4. В совокупности это говорит о том, что вирулентность C. albicans является сложным фенотипом, возникающим в результате взаимодействия между патогеном и окружающей средой его хозяина. Таким образом, изучение вирулентности лучше всего изучать с использованием модельных организмов, которые служат средой обитания хозяина, в отличие от подходов in vitro.

Для изучения инфекции C. albicans было разработано несколько моделей хозяев, включая позвоночные и беспозвоночные организмы. Мышиная модель, считающаяся золотым стандартом, часто используется из-за ее адаптивной и врожденной иммунной системы, а также способности отслеживать прогрессирование заболевания как системно, так и вконкретных органах. Тем не менее, у этой модели хоста есть существенные ограничения, включая затраты на обслуживание, небольшое количество потомков, а также снижение мощности и воспроизводимости, связанные с небольшими размерамивыборки5. Поэтому были разработаны другие, более простые модельные организмы, такие как данио рерио (Danio rerio), плодовая муха (Drosophila melanogaster), восковая моль (Galleria mellonella) и нематода (Caenorhabditis elegans). Эти модельные организмы, не относящиеся к млекопитающим, имеют меньшие размеры, требуют меньшего лабораторного обслуживания, а большие размеры образцов обеспечивают большую мощность и воспроизводимость по сравнению с мышиными моделями. Каждая из этих моделей имеет определенные преимущества и недостатки, которые необходимо учитывать при выборе модели заражения. G. mellonella предлагает наиболее физиологически схожую среду с человеком, так как может выращиваться при 37 °C и имеет различные фагоцитарные клетки7. Кроме того, эта модель позволяет осуществлять прямой впрыск специфического инокулюма7. Тем не менее, не существует полностью секвенированного генома и устоявшегося метода создания мутантных штаммов. Подобно G. mellonella, модель D. rerio позволяет напрямую вводить специфический инокулюм 5,7. Он также обладает как адаптивной, так и врожденной иммунной системой, которая уникальна для этой модели, не относящейся к млекопитающим, но требует аквариумов для водного разведения. D. melanogaster и C. elegans имеют схожие преимущества и недостатки, которые включают в себя полностью секвенированные геномы, которыми легко манипулировать и которые генерируют мутантныештаммы7, но не имеют адаптивного иммунитета или цитокинов7. Из всех этих моделей, не относящихся к млекопитающим, C. elegans имеет самый быстрый жизненный цикл, самооплодотворяется для получения большого количества генетически идентичного потомства и наиболее поддается крупномасштабномускринингу. C. elegans оказался чрезвычайно эффективным для высокопроизводительного скрининга противогрибковых препаратов 9,10, характеризующего факторы вирулентности7 и идентифицирующего специфические для C. albicans защитные сети хозяина11. Врожденная иммунная система C. elegans состоит из нескольких компонентов, которые высоко сохраняются у человека12. Врожденные защитные силы хозяина включают продукцию антимикробных пептидов13 (АМП) и активных форм кислорода 14,15,16.

Тяжесть инфекции C. albicans в основном измеряется выживаемостью хозяина, но не может охватить фенотипы нелетальной вирулентности. Часто упускаемым из виду аспектом приспособленности хозяина является размножение, но несколько исследований показывают, что C. albicans влияет на размножение, снижая жизнеспособность сперматозоидов17,18, предполагая, что это может быть важным аспектом приспособленности хозяина для изучения. Таким образом, влияние инфекции C. albicans на плодовитость хозяина является полезным способом изучения фенотипов нелетальной вирулентности. Мы разработали два теста на инфекцию с использованием C. elegans для изучения фенотипов как выживаемости, так и репродукции у здоровых хозяев19,20. Здесь мы описываем как анализы плодовитости, так и экспансии линии. Плодовитость измеряет как произведенное потомство, так и выживаемость отдельных хозяев, а экспансия линии оценивает последствия инфекции в течение трех поколений хозяев. Мы демонстрируем, как эти анализы могут быть использованы для скрининга делеционных мутантов C. albicans, чтобы выявить как драматические, так и тонкие различия в фенотипах летальной и нелетальной вирулентности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовительные этапы к экспериментам

  1. Подготовка культур C. albicans и Escherichia coli
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице 1.
    1. Поддерживайте штаммы C. albicans и E. coli в качестве запасов глицерина при температуре −80 °C.
    2. Используя стерильную зубочистку, процедите желаемый C. albicans на твердый пептон декстрозу дрожжей (YPD) (1% экстракт дрожжей, 2% бактопептон, 2% глюкоза, 1,5% агар, 0,004% аденин, 0,008% уридин) и вырастите их в течение ночи при 30 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если штамм C. albicans является ауксотрофным, дополните среду необходимыми аминокислотами.
    3. С помощью стерильной петли или зубочистки введите одну колонию C. albicans в 2 мл жидкого YPD. Выдерживать при температуре 30 °C с встряхиванием в течение 24 часов.
    4. С помощью стерильной зубочистки нанесите E. coli (OP50) на агаровые пластины бульона Luria (LB; 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 15 г/л агара). Выдерживать в течение ночи при 30 °C.
    5. Инокулируйте одну колонию OP50 в 50 мл LB. Инкубируйте при 30 °C с встряхиванием в течение ночи.
  2. Приготовление питательной среды для нематод
    1. В колбу объемом 2 л добавьте 29 г порошка питательной среды для нематоды (NGM; 17,5 г/л агара, 3,0 г/л хлорида натрия, 2,5 г/л пептона, 0,005 г/л холестерина) в 1 л воды и перемешайте с помощью мешалки.
    2. Чтобы подавить чрезмерный рост E. coli и позволить C. albicans пролиферировать, добавьте NGM 0,2 г/л стрептомицина сульфата после автоклавирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании NGM для поддержания нематоды стрептомицин не требуется.
  3. Поддержание популяций нематод
    1. Распределите 300 мкл ночной культуры E. coli на подготовленные агаровые пластины NGM с помощью металлического разбрасывателя. Этот прием будет называться посевом.
    2. Дайте пластинам высохнуть при комнатной температуре (RT). Выращивайте пластины в течение ночи при температуре 30 °C.
    3. Поддерживайте популяцию нематод, высаживая каждые 3-4 дня на только что посеянную пластину NGM с E. coli. Хранить при температуре 20 °C. Фрагментация — это метод, используемый для быстрого переноса случайной популяции нематод на только что засеянную пластину, что позволяет популяциям размножаться. Для этого с помощью стерильного шпателя вырежьте небольшой квадрат (1 х 1 дюйм) из агаровой пластины NGM. Осторожно перенесите квадрат на новую засеянную пластину NGM стороной с нематодами вниз на новый агар8.
      Примечание: C. elegans при температуре 20 °C произведет потомство на ~48 ч позже, что полезно учитывать при синхронизации популяции нематод. C. elegans при температуре 25 °C будет развиваться и размножаться быстрее, а популяции, поддерживаемые при 15 °C, будут расти медленнее.
  4. Синхронизация популяции нематод
    1. Начнем с существующей популяции нематод, поддерживаемой на NGM/OP50.
    2. Пипетка ~3 мл буфера M9 на планшет NGM, содержащий нематоды. Смойте яйца нематод с тарелки и аккуратно кончиком пипетки соскребите яйца с агара (они имеют свойство прилипать). С помощью пипетки P1000 переложите жидкость, содержащую яйца и червей, в коническую пробирку объемом 15 мл. Чтобы оценить количество яиц, оставшихся на тарелке, используйте препарирующий микроскоп, чтобы посмотреть на агар.
    3. Центрифуга коническая в течение 2 мин при 279 x g и RT.
    4. Удалите надосадочную жидкость, стараясь не потревожить гранулу нематоды.
    5. Добавьте 3 мл 25% раствора отбеливателя («ОСТОРОЖНО» при обращении).
    6. Переверните трубку на 2 минуты. Проверьте с помощью препарирующего микроскопа, что нематоды мертвы – они будут прямолинейными и неподвижными.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это убьет только существующих нематод. Целостность яиц не пострадает.
    7. Центрифугируйте в течение 2 минут при 279 x g и RT.
    8. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл М9.
    9. Центрифугируйте в течение 2 минут при 279 x g и RT.
    10. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 300 мкл M9.
    11. С помощью препарирующего микроскопа проверьте концентрацию яиц, пипетируя 5 мкл яиц на небольшую чашку Петри. Идеальная концентрация должна составлять от 20 до 100 яиц. Если культура слишком разбавлена, сконцентрируйте раствор путем центрифугирования и удаления лишней жидкости. Если культура слишком концентрирована, добавляйте больше М9 до тех пор, пока не будет достигнута желаемая концентрация.
  5. Подготовьте культуры C. albicans и E. coli к заражению нематодами (посев).
    1. Приготовьте пустой раствор. В кювете смешайте 900 мкл ddH2O и 100 мкл жидкости YPD.
    2. Вставьте кювету в спектрофотометр. Установите длину волны на 600 нанометров с помощью стрелки вверх. Нажмите на кнопку "0 ABS 100% T" для установки пустого раствора.
    3. В новой кювете смешайте 900 мкл ddH2O и 100 мкл ночной культуры дрожжей. Выньте пустой раствор из спектрофотометра и добавьте кювету, содержащую дрожжевой раствор. Запишите оптическую плотность, отображаемую на экране (не нажимайте ни одной кнопки). Умножьте показания на 10 (измеренный дрожжевой раствор был разбавлен 1 к 10).
    4. Нормализуйте культуру до 3,0 OD600/мл с ddH2O в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. 1 наружный диаметр600 составляет примерно 3 x 10-7 КОЕ/мл21.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если показания наружного диаметра600 составляют 6,7, 3 OD/6,7 OD= 0,447 мл, добавьте 447 мкл культуры C. albicans в микроцентрифужную пробирку. Центрифуга на максимальной скорости (16, 873 x g) в течение 30 с. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 1 мл ddH2O.
    5. Перенесите культуру кишечной палочки на ночь в коническую пробирку объемом 50 мл.
    6. Центрифугируйте культуру при 279 x g в течение 2 мин при RT.
    7. Аспирируйте большую часть надосадочной жидкости, оставляя ~1 мл.
    8. Повторно суспендируйте гранулу в оставшейся надосадочной жидкости и переложите в предварительно взвешенную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    9. Вращайте микроцентрифужную пробирку на максимальной скорости в течение 30 с.
    10. С помощью пипетки p1000 удалите надосадочную жидкость и взвесьте окончательную гранулу.
    11. Разведите кишечную палочку до 200 мг/мл в ddH2O.
    12. Используйте расчеты мастер-микса (Таблица 2) и выполните соответствующее масштабирование.

2. Анализ плодовитости

ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные данные показаны в дополнительной таблице 1 , а схема показана на рисунке 1A.

  1. Получить или приготовить следующее: 35 мм x 10 мм пластины Петри, NGM с добавлением 0,2 г/л стрептомицина сульфата, культуру E. coli OP50, LB, культуру C. albicans , YPD, Wire Pick, M9 буфер (3,0 г/л KH2PO4, 6,0 г/л Na2HPO4, 0,5 г/л NaCl, 1,0 г/л NH4Cl), Конические пробирки объемом 15 мл.
    За два дня до эксперимента
  2. Инокулируйте штаммы C. albicans в 2 мл YPD и E. coli (OP50) в 50 мл LB и выращивайте в течение ночи при 30 °C.
  3. Приготовьте чашки Петри размером 35 мм x 10 мм с NGM с добавлением 0,2 г/л стрептомицина сульфата. Количества подготовленных тарелок должно хватить на весь эксперимент. Рекомендуемое количество повторений составляет 10 на одну процедуру. Для 10 тиражей будет использовано 70 пластин. Из 1 литра NGM получится ~250 тарелок.
    За день до эксперимента
  4. Семена 35 мм х 10 мм NGM агаровыми пластинами с добавлением стрептомицина на День 0, День 2 и День 3 в соответствии с описанным выше протоколом посева с концентрацией мастермикса (Таблица 2). Нанесите пипеткой соответствующее количество мастермикса на центр пластины. Распространение культуры не является необходимым, потому что одного пятна роста микробов достаточно для питания хозяина и позволяет нам легко идентифицировать хозяев вне семени. Инкубируйте планшеты в течение ночи при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мастермикс Day 0 содержит 50 μL «семени» на репликацию для каждой экспериментальной обработки. Дни 2-7 включают 10 мкл «семени» на повтор для каждой экспериментальной обработки. Пластины Дня 1 не существует, потому что нематоды достигают стадии L4 через 48 часов после синхронизации на пластине Дня 0. Как только они достигнут L4, отдельные нематоды будут перенесены на пластины второго дня.
Для 1 репликацииУсловия борьбы с E. coli (OP50)Условия лечения C. albicans и E. coli (OP50)
ОП50H2OИтогОП50С. albicansH2OИтог
День 06.25 мкл43.75 мкл50 мкл6.25 мкл1.25 мкл42.5 мкл50 мкл
Дни 2-71.25 мкл8.75 мкл10 мкл1.25 мкл.25 ul8,5 мкл10 мкл

Таблица 2: Мастермикс объемов культур E. coli и C. albicans, необходимых для заражения нематод для анализа плодовитости.

День эксперимента (День 0)

  1. Синхронизируйте нематод и планшеты с ~50 яйцами на каждой реплике в день 0 контрольных планшетов (только OP50) и планшетов для лечения (C. albicans + OP50). Выдерживать при температуре 20 °C в течение 48 часов.
    День 2
  2. Перенесите одну нематоду L4, выбрав8 из пластин Дня 0, на каждую из повторяющихся пластин Дня 2. Хозяева L4 могут быть идентифицированы по небольшому карману в середине спинной стороны их тела22. Перенесите нематод, вылупившихся и созревших из того же типа засеянных пластин (т.е. нематоды L4 из контрольных пластин D0 должны быть перенесены на контрольные пластины 2-го дня).
  3. Инокулировать культуры C. albicans необходимо в количестве 2 мл YPD и E. coli (штамм OP50) в 50 мл LB.
    День 3
  4. Перенесите нематод с пластин 2-го дня на засеянные пластины 3-го дня, отслеживая каждую репликацию (т.е. реплику А из 2-го дня необходимо переместить на пластину с репликацией А 3-го дня).
  5. Инкубируйте День 2 (содержащий только яйца) и День 3 (содержащий одну взрослую особь) при температуре 20 °C в течение 24 часов.
  6. Семена 35 мм x 10 мм NGM добавляют стрептомициновыми планшетами на 4 и 5 дни с использованием 10 мл мастермикса на планшет (табл. 2) и инкубируют в столовых стаканах при РТ в течение 24 ч.
    День 4
  7. Перенесите нематод с пластин 3-го дня на засеянные пластины 4-го дня.
  8. Инкубируйте планшеты 3-го и 4-го дней при температуре 20 °C в течение 24 ч.
  9. Используя препарирующий эндоскоп, подсчитайте жизнеспособное потомство для каждой пластины 2-го дня. Обратите внимание на все реплики, которые умерли или больше не находятся на табличке (цензура). После того, как количество потомства будет зарегистрировано, выбросьте пластины второго дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Censored относится к нематодам, которые исчезают на тарелке. Это может произойти, когда нематоды сползают с тарелки. Хотя это случается реже в течение 24-часового окна, трупы мертвых нематод распадаются на агар, что также приводит к цензуре. Цензурированные данные не включаются в окончательный анализ данных о потомстве и выживаемости.
  10. Инокулировать новые культуры штаммов C. albicans в 2 мл YPD и E. coli (OP50) в 50 мл LB.
    День 5
  11. Перенесите нематод с пластин 4-го дня на засеянные пластины 5-го дня.
  12. Инкубируйте планшеты на 4-й и 5-й день при температуре 20 °C в течение 24 часов.
  13. Подсчитайте жизнеспособное потомство для каждой пластины 3-го дня. Обратите внимание на все реплики, которые умерли или больше не находятся на табличке (цензура). После того, как количество потомства будет зарегистрировано, выбросьте пластины 3-го дня.
  14. Семена 35 мм x 10 мм NGM добавляют стрептомициновые планшеты в течение 6 и 7 дней с использованием 10 мл мастермикса на планшет (табл. 2) и инкубируют планшеты при комнатной температуре в течение 24 ч.
    День 6
  15. Перенесите нематод с планшетов 5-го дня на засеянные пластины 6-го дня.
  16. Инкубируйте планшеты 5-го и 6-го дней при температуре 20 °C в течение 24 часов.
  17. Подсчитайте жизнеспособное потомство для каждой пластины Дня 4. Обратите внимание на все реплики, которые умерли или больше не находятся на табличке (цензура). После того, как количество потомства будет зарегистрировано, выбросьте пластины 4-го дня.
    День 7
  18. Перенесите нематод с планшетов 6-го дня на засеянные пластины 7-го дня.
  19. Инкубируйте планшеты на 6-й и 7-й дни при температуре 20 °C в течение 24 часов.
  20. Подсчитайте жизнеспособное потомство для каждой тарелки 5-го дня. Обратите внимание на все реплики, которые умерли или больше не находятся на табличке (цензура). После того, как количество потомства будет зарегистрировано, выбросьте пластины 5-го дня.
    День 8
  21. Подсчитайте жизнеспособное потомство для каждой пластины Дня 6. Обратите внимание на все реплики, которые умерли или больше не находятся на табличке (цензура). После того, как количество потомства будет зарегистрировано, выбросьте пластины 6-го дня.
    День 9
  22. Подсчитайте жизнеспособное потомство для каждой пластины 7-го дня. Не стоит считать самую крупную нематоду (родительскую). Обратите внимание на все реплики, которые умерли или больше не находятся на табличке (цензура). После того, как количество потомства будет зарегистрировано, выбросьте пластины 7-го дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ также может быть использован для оценки выживаемости. Запишите, когда умерла каждая нематода. В конце эксперимента процент нематод, выживших в течение семидневного эксперимента, может быть сравнен для каждого лечения. Нематоды иногда уползают от источника пищи/патогена и пытаются взобраться на горки плиты Петри. Прежде чем двигаться дальше, проверьте все участки пластины. Мертвые нематоды обычно оставляют после себя тушу. Подвергайте цензуре любую нематоду, которую невозможно найти, и не считайте ее мертвой. Не включайте цензурированные данные в окончательный анализ потомства и выживаемости.
  23. Анализируйте данные о размере выводка и позднем размножении с помощью одностороннего метода ANOVA или метода Краскела-Уоллиса, в зависимости от нормальности наборов данных, а также многократного тестирования Тьюки/Данна для выявления существенных различий между группами обработки с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Выявляйте различия между кривыми выживаемости с помощью логарифмического рангового теста Вилкоксона.

3. Анализ расширения линии

ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные данные показаны в дополнительной таблице 2 , а схема показана на рисунке 2A.

  1. Получить или приготовить: 100 мм x 15 мм пластины Петри, содержащие NGM агар с добавлением 0,2 г/л стрептомицина сульфата, культуры E. coli OP50, культуры LB, C. albicans , YPD, M9 buffer, Wire Pick, конические пробирки 15 мл.
    День -2
  2. Инокулируйте штаммы C. albicans в 2 мл YPD и E. coli (OP50) в 50 мл LB и выращивайте в течение ночи при 30 °C.
    День -1
  3. Семена 100 мм x 15 мм NGM агаровые пластины с добавлением стрептомицина с 300 мкл мастермикса на пластину (табл. 3). Разложите мастермикс на тарелке с помощью стерильного металлического разбрасывателя. Инкубируйте планшеты в течение ночи при 30 °C. Рекомендуется шесть повторений на одну процедуру. Таким образом, приготовьте семь пластин (одну пластину для синхронизированных нематод, шесть пластин для каждой взрослой нематоды) на одну обработку.
Условия борьбы с E. coli (OP50)C. albicans и E. coli (OP50). Состояние лечения
Для 1 репликацииОП50H2OИтогОП50С. albicansH2OИтог
1.25 мкл8.75 мкл10 мкл37.5 мкл7,5 мкл255 мкл300 мкл

Таблица 3: Мастермикс объемов культур E. coli и C. albicans, необходимых для заражения нематод для анализа расширения линии.

Рост популяции нематод: день 0

  1. Синхронизируйте нематод и поместите 10-25 яиц в одну тарелку для каждого контроля (только OP50) и лечения (C. albicans + OP50) и инкубируйте при 20 °C в течение 48 часов.
    День 2:
  2. Перенесите по одному червю L4 с каждой контрольной и лечебной пластины 0-го дня на засеянные пластины той же обработки. Хозяева L4 могут быть идентифицированы по небольшому карману в середине спинной стороны их тела22.
  3. Инкубировать при температуре 20 °C в течение 5 дней (в общей сложности через неделю после синхронизации).
    День 7:
  4. С помощью пипетки p1000 смойте всю популяцию нематод с каждой пластины, используя 5 мл буфера M9, и переложите в коническую пробирку объемом 15 мл.
  5. Хранить при температуре 4 °C в течение 1 часа, чтобы нематоды успокоились для облегчения подсчета.
  6. Разбавьте каждую коническую форму до конечного объема 10 мл с помощью буфера M9.
  7. Для каждой биологической реплики подсчитайте количество нематод в аликвоте объемом 20 мкл. Повторите это, чтобы получить 6 технических репликатов для каждой биологической репликации. Обратный расчет для определения общего размера популяции. Если образцы слишком разбавлены (т.е. менее 10 нематод на образец), сконцентрируйте популяцию в меньшем объеме буфера M9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование живых нематод не нанесет вреда нематодам.
    Пример расчета:
    70 узлов сети = X (Общее количество узлов сети)
    20 μL (аликвота) 10 000μL (общий объем)
  8. Анализируйте данные для расширения линии с помощью одностороннего ANOVA или метода Краскела-Уоллиса, в зависимости от нормальности наборов данных, а также многократного тестирования Тьюки/Данна для выявления существенных различий между группами лечения с помощью программного обеспечения GraphPad Prism.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем два анализа, которые измеряют вирулентность C. albicans как нелетальный фенотип с использованием C. elegans в качестве модели инфекции. Первый анализ, плодовитость, отслеживает, как инфекция C. albicans влияет на производство и выживание потомства. Второй анализ, расширение линии, измеряет, как инфекция C. albicans влияет на рост популяции в течение нескольких поколений.

Анализ плодовитости имее...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем два простых теста, которые измеряют вирулентность грибков. Оба анализа используют C. elegans в качестве системы хозяина, которая включает мониторинг как летального, так и нелетального фенотипа хозяина. Например, анализы плодовитости исследуют репродуктивный успех отдельных инфицированных хозяев, а также измеряют индивидуальную выживаемость. Ежедневный мониторинг позволяет получить информацию не только об общем размере выводка, но и о сроках воспроизводства,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующих интересов для раскрытия информации.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Дориана Файстеля, Рему Эльмостафу и Маккенну Пенли за их помощь в разработке наших анализов и сборе данных. Это исследование проводится при поддержке NSF DEB-1943415 (MAH).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл микропробирки eppendorf 3810XMillipore SigmaZ606340
100 мм x 15 мм пластины ПетриSigma-AldrichP5856-500EA
15 мл Falcon ConicalsFisher Scientific14-959-70C
50 мл Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
АденинMillipore SigmaA8626
Агар (гранулированный, бактериологического класса)Apex BioResearch производит20-248
(95% pt, 32 калибр)Genesee Scientific59-1M32P
Хлорид аммонияМиллипоры Sigma254134
Распространитель бактериальных клетокSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
Одноразовые пробирки для культивирования (20 x 150 мм)FIsherBrand14-961-33
(Осветитель высокой интенсивности NI-150)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
Глюкоза Millipore Sigma50-99-7
Средние чашки Петри (35 x 10 мм)Falcon353001
Metal SpatulaSP Scienceware8TL24
Среда для роста нематод (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Калий Фосфат одноосновнойSigmaP0662-500G
Хлорид натрияFisher ScientificBP358-1
Фосфат натрияFisher ScientificBP332-500
Стрептомицина сульфатThermo-Fisher Scientific11860038
триптонмиллипор Sigma91079-40-2
УридинМиллипор SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
дрожжейMillipore Sigma8013-01-2
алюминиевую проволоку Микроскоп для препарирования Экстракт

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Underhill, D. M., Iliev, I. D. The mycobiota: interactions between commensal fungi and the host immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (6), (2014).
  2. Ibrahim, A. S., Filler, S. G., Sanglard, D., Edwards, J. E., Hube, B. Secreted Aspartyl Proteinases and Interactions of Candida albicans with Human Endothelial Cells. Infection and Immunity. 66 (6), 3003-3005 (1998).
  3. Calderone, R. A., Fonzi, W. A. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 9 (7), 327-335 (2001).
  4. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  5. Chin, V., Lee, T., Rusliza, B., Chong, P. Dissecting Candida albicans Infection from the Perspective of C. albicans Virulence and Omics Approaches on Host-Pathogen Interaction: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (10), 1643(2016).
  6. Elkabti, A., Issi, L., Rao, R. Caenorhabditis elegans as a Model Host to Monitor the Candida Infection Processes. Journal of Fungi. 4 (4), 123(2018).
  7. Arvanitis, M., Glavis-Bloom, J., Mylonakis, E. Invertebrate models of fungal infection. Biochimica et biophysica acta. 1832 (9), 1378-1383 (2013).
  8. Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. Journal of Visualized Experiments. (128), e56487(2017).
  9. Breger, J., et al. Antifungal Chemical Compounds Identified Using a C. elegans Pathogenicity Assay. PLoS Pathogens. 3 (2), 18(2007).
  10. Okoli, I., et al. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PloS one. 4 (9), 7025(2009).
  11. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans Infection of Caenorhabditis elegans Induces Antifungal Immune Defenses. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002074(2011).
  12. Kim, D. H., Ausubel, F. M. Evolutionary perspectives on innate immunity from the study of Caenorhabditis elegans. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 4-10 (2005).
  13. Kim, D. H., et al. A Conserved p38 MAP Kinase Pathway in Caenorhabditis elegans Innate Immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  14. van der Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generated Reactive Oxygen Species Trigger Protective SKN-1 Activity via p38 MAPK Signaling during Infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 7 (12), 1002453(2011).
  15. van der Hoeven, R., Cruz, M. R., Chávez, V., Garsin, D. A. Localization of the Dual Oxidase BLI-3 and Characterization of Its NADPH Oxidase Domain during Infection of Caenorhabditis elegans. PLOS ONE. 10 (4), 0124091(2015).
  16. Chávez, V., Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generates Reactive Oxygen Species as a Protective Innate Immune Mechanism in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 77 (11), 4983-4989 (2009).
  17. Vander, H., Prabha, V. Evaluation of fertility outcome as a consequence of intravaginal inoculation with sperm-impairing micro-organisms in a mouse model. Journal of Medical Microbiology. 64, Pt_4 344-347 (2015).
  18. Castrillón-Duque, E. X., Suárez, J. P., Maya, W. D. C. Yeast and Fertility: Effects of In Vitro Activity of Candida spp. on Sperm Quality. Journal of Reproduction & Infertility. 19 (1), 49-55 (2018).
  19. Feistel, D. J., et al. A Novel Virulence Phenotype Rapidly Assesses Candida Fungal Pathogenesis in Healthy and Immunocompromised Caenorhabditis elegans Hosts. mSphere. 4 (2), (2019).
  20. Feistel, D. J., Elmostafa, R., Hickman, M. A. Virulence phenotypes result from interactions between pathogen ploidy and genetic background. Ecology and Evolution. 10 (17), 9326-9338 (2020).
  21. Mitchell, B. M., Wu, T. G., Jackson, B. E., Wilhelmus, K. R. Candida albicans Strain-Dependent Virulence and Rim13p-Mediated Filamentation in Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (2), 774-780 (2007).
  22. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook - Introduction. WormAtlas. , (2006).
  23. Yuan, X., Mitchell, B. M., Hua, X., Davis, D. A., Wilhelmus, K. R. The RIM101 Signal Transduction Pathway Regulates Candida albicans Virulence during Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (9), 4668-4676 (2010).
  24. Davis, D., Edwards, J. E., Mitchell, A. P., Ibrahim, A. S. Candida albicans RIM101 pH Response Pathway Is Required for Host-Pathogen Interactions. Infection and Immunity. 68 (10), 5953-5959 (2000).
  25. Chamilos, G., et al. Candida albicans Cas5, a Regulator of Cell Wall Integrity, Is Required for Virulence in Murine and Toll Mutant Fly Models. The Journal of Infectious Diseases. 200 (1), 152-157 (2009).
  26. Bruno, V. M., et al. Control of the C. albicans Cell Wall Damage Response by Transcriptional Regulator Cas5. PLoS Pathogens. 2 (3), 21(2006).
  27. Davis, D. Adaptation to environmental pH in Candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics. 44 (1), 58(2003).
  28. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A Pathogenesis Assay Using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Reveals Novel Roles for Yeast AP-1, Yap1, and Host Dual Oxidase BLI-3 in Fungal Pathogenesis. Eukaryotic Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  29. De, A., Sahu, A. K., Singh, V. Bite size of Caenorhabditis elegans regulates feeding, satiety and development on yeast diet. bioRxiv. , 473256(2018).
  30. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  31. Smith, A. C., Hickman, M. A. Host-Induced Genome Instability Rapidly Generates Phenotypic Variation across Candida albicans Strains and Ploidy States. mSphere. 5 (3), 00433(2020).
  32. Palominos, M. F., Calixto, A. Quantification of Bacteria Residing in Caenorhabditis elegans Intestine. BIO-PROTOCOL. 10 (9), (2020).
  33. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a Model Organism for Investigating Immunity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  34. Liberati, N. T., et al. Requirement for a conserved Toll/interleukin-1 resistance domain protein in the Caenorhabditis elegans immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6593-6598 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Candida albicans
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи