Method Article

Визуализация и количественная оценка повреждения ДНК на основе эндонуклеазы

DOI:

10.3791/62175

⸱

August 21st, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье представлены основные этапы иммуноокрашивания и иммунопреципитации хроматина. Эти протоколы обычно используются для изучения клеточных процессов, связанных с повреждением ДНК, а также для визуализации и количественной оценки набора белков, связанных с репарацией ДНК.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки постоянно подвергаются воздействию различных повреждающих ДНК агентов, вызывая различные клеточные реакции. Применение биохимического и генетического подходов имеет важное значение для выявления клеточных событий, связанных с набором и сборкой комплексов репарации ДНК в месте повреждения ДНК. За последние несколько лет было разработано несколько мощных инструментов, чтобы вызвать повреждение ДНК, специфичное для сайта. Более того, новые семенные методы позволяют изучать эти процессы на уровне одноклеточного разрешения с использованием как фиксированных, так и живых клеток. Хотя эти методы были использованы для изучения различных биологических процессов, здесь мы представляем наиболее широко используемые протоколы в области репарации ДНК, флуоресцентного иммуноокрашивания (IF) и иммунопреципитации хроматина (ChIP), которые в сочетании с повреждением ДНК на основе эндонуклеазы позволяют визуализировать и количественно оценивать геномную занятость факторов репарации ДНК направленным и регулируемым образом, соответственно. Эти методы предоставляют исследователям мощные инструменты для идентификации новых белков, связанных с поврежденным геномным локусом, а также их постперекренческих модификаций, необходимых для их тонкой регуляции во время репарации ДНК.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наш геном постоянно подвергается испытаниям со стороны различных агентов, повреждающих ДНК. Эти атаки могут происходить от источников окружающей среды, таких как ультрафиолетовый свет или облучение, а также от эндогенных источников, таких как побочные продукты метаболизма, вызванные окислительным стрессом или ошибками репликации1,2. Эти поражения могут влиять на целостность одной или обеих нитей ДНК, и если генерируемые ошибки становятся постоянными, это часто приводит к транслокациям и нестабильности генома, что может привести к опухолевомугенезу 3,4.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Иммунодетекция специфических белков

  1. Подготовка клеточной культуры и экспериментальная установка
    1. Поддерживать клетки U2OS в монослоях в питательной среде DMEM, дополненной 10% сывороткой для телят плода, 2 мМ глютамина и 1% антибиотико-антимикотическим раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для индукции повреждений ДНК на основе эндонуклеазы используйте среду, обработанную древесным углем или без стероидов, чтобы избежать утечки системы.
    2. Выращивают клетки в увлажненной 5% CO2 среде при 37 °C до 80% слияния, обновляя среду каждые 2-3 дня.
    3. Аспирировать среду и промыть клетки 1x PBS. Отсоедините клетки раствором ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение направленных на сайт процессов репарации DSB в клетках может быть достигнуто либо путем стабильной, либо путем транзиторной трансфекции. Однако следует отметить, что стабильная трансфекция обеспечивает однородную клеточную популяцию, что дает единый и, следовательно, более надежный клеточный ответ. В случае транзиторной трансфекции только небольшая часть клеточной популяции занимает и поддерживает плазмиду, что вносит разнообразие в эксперимент. Создание клеточных систем на основе эндонуклеазы ER-I-PpoI или ER-A.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя репарации ДНК является относительно недавней областью исследований, наши знания быстро расширяются с помощью различных биохимических и микроскопических методов. Сохранение генетической информации имеет решающее значение для клеток, поскольку мутации, происходящие в генах, участвующих в процессах репарации, являются одними из ведущих причин опухолевого генеза, и поэтому важно прояснить ключевые этапы путей репарации ДНК.

Биохимические методы (т.е. вестерн-блот, иммунопреципитация, масс-спе.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось грантом Национального офиса исследований, разработок и инноваций GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, исследовательской стипендией Яноша Больяй Венгерской академии наук BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, краткосрочной стипендией EMBO 8513 и Фондом Tempus.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgaroseLonza50004
антибиотик-антимикотический раствор (100×), стабилизированныйSigma AldrichA5955
Anti-gamma H2A. X (фосфо S139) антителоAbcamab26350
Bovine Serum Fraction V альбуминBioseraPM-T1725
TrackIt™ Голубой/желтый загрузочный буферThermo Fisher Scientific10482035
DMEM с 1,0 г/л глюкозы, без L-глутаминаLonza12-707F
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgGInvitrogen11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-rabbit IgGInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
EthanolMolar Chemicals02910-101-340
Фетальная бычья сыворотка (южноамериканское происхождение), одобренная ЕСGibcoECS0180L
Раствор формальдегида 37% без кислотыSigma Aldrich1.03999
GlutaMAX&торговля; ДобавкаThermo Fisher Scientific35050038
ГлицинSigma Aldrich50046
IPure kit v2ДиагенодC03010015
Изоамиловый спиртSigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
Na-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Неокарциностатин из Streptomyces carzinostaticusSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
PBS Порошок без Ca2+, Mg2+Sigma AldrichL182-50-BC
ФенолSigma AldrichP4557
ТРУБЫSigma AldrichP1851
Полисорбат 20 (Твин 20)Моляр Химикаты09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher ScientificP36935
Набор коктейлей ингибиторов протеазы IRoche11873580001
протеиназы KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs антителаAbcamab18192
РНКаза ARoche10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Трис ацетат-ЭДТА буферSigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100Molar Chemicals09370-006-340
Трипсин из свиной поджелудочной железыSigma AldrichT4799
Трипсин-ЭДТА (0,5%), без фенола красногоGibco15400054

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Site Specific DNA DamageDNA RepairChromatin ImmunoprecipitationFluorescence ImmunostainingDouble Strand BreaksProtein RecruitmentPost Translational ModificationsSingle Cell ResolutionWestern BlotSuper Resolution Microscopy

Related Articles