Здесь мы представляем протокол адаптации метода CLARITY тканей мозга для цельномонтных сетчаток для улучшения качества стандартного иммуногистохимического окрашивания и визуализации с высоким разрешением нейронов сетчатки и их субклеточных структур.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммуноокрашивание цельно-маунтных сетчаток с помощью метода очистки тканей CLARITY
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Метод делипидации тканевого гидрогеля (CLARITY), первоначально разработанный лабораторией Дейссерота, был модифицирован и широко используется для иммуноокрашения и визуализации толстых образцов мозга. Однако эта передовая технология еще не использовалась для цельномонтных сетчаток. Хотя сетчатка частично прозрачна, ее толщина примерно 200 мкм (у мышей) по-прежнему ограничивает проникновение антител в глубокие ткани, а также уменьшает проникновение света для визуализации с высоким разрешением. Здесь мы адаптировали метод CLARITY для цельномонтовых сетчаток мышей, полимеризовав их акриламидным мономером с образованием нанопористого гидрогеля, а затем очистив их в додецилсульфате натрия, чтобы свести к минимуму потерю белка и избежать повреждения тканей. Обработанные CLARITY сетчатки были иммуноокражены антителами к нейронам сетчатки, глиальным клеткам и синаптическим белкам, установлены в растворе, соответствующем индексу преломления, и визуалированы. Наши данные показывают, что CLARITY может улучшить качество стандартного иммуногистохимического окрашивания и визуализации нейронов сетчатки и глиальных клеток при подготовке к целому по креплению. Например, 3D-разрешение тонких аксоноподобных и дендритных структур дофаминергических амакриновых клеток было значительно улучшено CLARITY. По сравнению с необработанными цельномонтными сетчатками, CLARITY может выявить иммуноокрашивание синаптических белков, таких как белок постсинаптической плотности 95. Наши результаты показывают, что CLARITY делает сетчатку более оптически прозрачной после удаления липидов и сохраняет тонкие структуры нейронов сетчатки и их белков, которые могут обычно использоваться для получения визуализации нейронов сетчатки и их субклеточных структур с высоким разрешением при подготовке к целому монтажу.
Введение
Сетчатка позвоночных является, пожалуй, наиболее доступной частью центральной нервной системы (ЦНС), и она служит отличной моделью для изучения развития, структуры и функции мозга. Пять классов нейронов в сетчатке распределены в трех ядерных слоях, разделенных двумя плексиформными слоями. Внешний ядерный слой (ONL) состоит из классических фоторецепторов (стержней и колбочка), которые преобразуют свет в электрические сигналы. Электрические сигналы обрабатываются нейронами во внутреннем ядерном слое (INL), включая биполярные, горизонтальные и амакриновые клетки, а затем передаются в ганглиоцитные клетки сетчатки (RGCs) в ганглиевом клеточном слое (GCL). RGC являются вых....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Уход за мышами и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения для лабораторных животных и были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию в Оклендском университете (протокол No 18071).
ПРИМЕЧАНИЕ: Названия растворов и их составы приведены в таблице 1.
1. Тканевая подготовка
- Усыпить мышь при передозировкеСО2с последующим вывихом шейки матки.
- Энуклеазируют глаза изогнутыми щипцами и переносят их в небольшую чашку Петри с 0,1 М PBS(таблица 1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Модифицированные сетчатки, обработанные CLARITY, представляют собой оптически прозрачную ткань.
Чтобы сформулировать метод очистки тканей, совместимый с иммуногистохимическими приложениями в сетчатке, обеспечивая при этом адекватную делипидацию и сохраняя структурную целостность клеточных белков, мы адаптировали метод очистки тканей CLARITY к сетчатке мыши. Мы смогли упростить протокол и модифицировать его для сетчатки с целым креплением (см. Протокол). После завершения гибридизации тканей, очистки и .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Модификация протокола CLARITY для цельномонтных сетчаток.
Мы упростили протокол CLARITY для достижения адекватной полимеризации без необходимости вакуумной вакуумной эвакуации или сухой камеры, как это используется в большинстве предыдущих исследований7,9,11. Процесс полимеризации ингибируется кислородом, требуя, чтобы образец был изолирован из воздуха на этапе полимеризации протокола. Однако вместо дегазации.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Бин Е, Натана Спикса и Хао Лю за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Национальным институтом грантов здравоохранения EY022640 (D.-Q.Z.) и Оклендского университета Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 16% Параформальдегид | Электронная микроскопия | Sciences 15710 | Фиксативный |
| акриламид | Fisher Biotech | BP170 | Гидрогелевый мономер |
| Axio Imager.Z2 | Флуоресцентный микроскоп | Zeiss | |
| BSA | Scientific | BP1600 | Блокатор |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Сканирующий конфокальный микроскоп | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Буферный компонент |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Буферный компонент |
| Na2HPO4 | Sigma | Aldrich S9763 | Буферный компонент |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Буферный компонент |
| 2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Буферный компонент |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Бактериостатический консервант |
| NDS | Aurion | 900.122 | Блокатор |
| NIS Elements AR | Nikon | Программное обеспечение для анализа изображений | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Средство для удаления липидирования |
| Сорбит | Sigma Aldrich | 51876 | Буферный компонент |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Поверхностно-активное вещество |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Поверхностно-активное вещество |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Тепловой инициатор |
Ссылки
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
