Методическая статья

Создание химер переднего мозга птиц для оценки развития лица

DOI:

10.3791/62183

⸱

18 февраля 2021 г.

 , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute, University of California

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается метод трансплантации тканей, который был разработан для проверки сигнальных и паттернирующих свойств базального переднего мозга во время черепно-лицевого развития.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Птичий эмбрион использовался в качестве модельной системы более века и привел к фундаментальному пониманию развития позвоночных. Одной из сильных сторон этой модельной системы является то, что влияние и взаимодействие между тканями могут быть непосредственно оценены у химерных эмбрионов. Ранее мы показали, что сигналы от переднего мозга способствуют морфогенезу лица, регулируя форму домена экспрессии звукового ежа (SHH) в лобно-эктодермальной зоне (FEZ). В данной статье описан метод генерации химер переднего мозга и приведены иллюстрации результатов этих экспериментов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие современные исследования в области биологии развития сосредоточены на роли генов в формировании эмбрионов. Существуют хорошие инструменты для изучения механизмов развития с генетической точки зрения. Однако эмбрионы собираются и подвергаются морфогенезу в ответ на тканевые взаимодействия. Птичья система является классическим инструментом, используемым для оценки разнообразия тканевых взаимодействий, регулирующих развитие, по следующим причинам: эмбриология хорошо изучена, эмбрионы легко доступны, инструменты для анализа птичьих систем хорошо развиты, а эмбрионы недороги.

Система трансплантации птиц широко используется для отслеживания происхождения и оценки тканевых взаимодействий во время развития в течение почти столетия 1,2,3,4. Эта система была использована для исследования сигнального центра, фронтоназальной эктодермальной зоны (FEZ), которая регулирует морфогенез верхней челюсти5, и ранее было опубликовано видео, описывающее эту технику6. В дополнение к перепелам-птенцам, другие виды также использовались для получения химер для анализа тканевых взаимодействий. Например, мышь FEZ была пересажена от дикого типа7 и мутантных мышей8, а другие использовали системы утки, перепела и цыплят для оценки роли нервного гребня в формировании паттерна лицевого скелета 9,10,11,12.

В этой работе была оценена роль переднего мозга в регуляции паттерна экспрессии генов в СЭЗ путем реципрокной трансплантации вентрального переднего мозга между эмбрионами перепелов, уток и цыплят, поскольку для индуцирования экспрессии звукового ежа в СЭЗ требуется сигнал от переднего мозга. Трансплантация переднего мозга не уникальна в этой области. Эти трансплантаты использовали для оценки развития подвижности у эмбрионов перепелов и уток13, хотя в этих экспериментах также трансплантировали ткани, которые вносили вклад в ненейронные производные. В другой работе слуховые контуры у птиц были оценены с помощью трансплантации переднего мозга14, но эти трансплантаты содержали предполагаемые клетки нервного гребня, которые вносят вклад в форму лица 9,10 и участвуют в регуляции экспрессии SHH в FEZ 15. Следовательно, для оценки роли мозга в формелица 16 была разработана система для пересадки только вентрального переднего мозга от одного вида птиц к другому до закрытия нервной трубки (рис. 1A, B). Этот метод был лишен контаминации нервного гребня трансплантата. В этой статье проиллюстрирован метод и описаны ожидаемые результаты, а также обсуждены проблемы, с которыми приходится сталкиваться.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белая пекинская утка (Anas platyrhynchos), белая курица породы леггорн (Gallus gallus) и японский перепел (Cortunix coturnix japonica) инкубируются при температуре 37 °C во влажной камере до согласования стадии HH7/817.

1. Подготовка донорской ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление реагентов и инструментов, а также способ вскрытия яиц для экспериментальных манипуляций был описан6.

  1. Подготовьте носитель DMEM с нейтральным красным цветом, стеклянной пипеткой для переноса и заточенными вольфрамовыми иглами.
  2. Экспонируйте эмбрионы (как показано нарисунке 6).
  3. Забор тканевых трансплантатов с левой стороны базального переднего мозга эмбрионов 7/8 стадии. Используйте изогнутые заостренные вольфрамовые иглы6 , чтобы аккуратно надрезать кусок переднего мозга размером ~ 0,3 мм в длину и 0,2 мм в ширину, следя за тем, чтобы не включать нижележащую энтодерму, скользя иглой под передним мозгом так, чтобы игла была параллельна оси нервной трубки.
  4. Используя стеклянную пипетку для переноса, возьмите трансплантат у донорского эмбриона.
  5. Перенесите трансплантат в DMEM, содержащий нейтральный красный (0,01% в PBS, 23 °C), на 2 минуты, чтобы окрасить его, а затем поместите окрашенный трансплантат в DMEM, который не содержит нейтрального красного, до тех пор, пока он не будет готов к приживлению.

2. Подготовка хоста

  1. Инкубируют оплодотворенные яйца белой курицы породы Леггорн (Gallus gallus) при 37 °C в увлажненной камере до HH7/8 17.
  2. Экспонируйте эмбрионы (как показано нарисунке 6).
  3. Используя заостренные вольфрамовые иглы, подготовьте место трансплантата, аккуратно разрезав, а затем удалив кусок базального переднего мозга размером 0,3 мм на 0,2 мм с левой стороны, чтобы разместить трансплантат, как это было сделано для изоляции донорской ткани.
  4. Позаботьтесь о том, чтобы избежать чрезмерного разрушения основной энтодермы, что будет очевидно, поскольку гранулы желтка начнут просачиваться через любой сделанный разрыв. Это требует практики, и не все попытки будут успешными.
  5. После переноса на хозяина6 поместите трансплантат так, чтобы заменить экстирпированный базальный передний мозг хозяина.
  6. Плотно наклейте ленту на отверстие и верните эмбрион в инкубатор с температурой 37 °C на соответствующий период времени для анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка химеризма и контаминации трансплантата
Чтобы оценить химеры, следует рассмотреть степень химеризма и контаминации трансплантата другими типами клеток. Создание химер путем пересадки тканей перепелов в эмбрионы цыплят позволяет проводить этот тип анализа. С помощью антител QCPN клетки перепелов можно визуализировать и отличить от тканей хозяина (рис. 1 C,D). В этом случае только ткани, полученные из вентрального переднего мозга, были окрашены антите...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный метод позволяет исследовать тканевые взаимодействия между базальным передним мозгом и прилегающей эктодермой. Этот подход отличается от предыдущих методов трансплантации переднего мозга, потому что донорская ткань была ограничена вентральным передним мозгом. Это исключает трансплантацию клеток нервного гребня, которые, как было показано, участвуют в формировании морфологии лица 9,10. Следовательно, ограничение трансплантата базальным передним мозгом был...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Всем авторам раскрывать нечего.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом стоматологических и черепно-лицевых исследований Национальных институтов здравоохранения под номерами R01DE019648, R01DE018234 и R01DE019638.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x PBSTEKTEKZR114
35x10 мм чашка ПетриFalcon1008
DMEMThermofisher11965084
ИглодержательFine Science Tools26016-12
Нейтральный красныйSigma553-24-2
No5 Щипцы DumontFine Science Tools11252-20
Пастер ПипецThermofisher13-678-6B
QCPN антителаИсследования развития Гибридома банк, Университет Айовы, Айова, США
НожницыFine Science Tools14058-11
Вольфрамовая иглаFine Science Tools26000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
  2. Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
  3. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  4. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
  5. Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
  6. Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  7. Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
  8. Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
  9. Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
  10. Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
  11. Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  12. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
  13. Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
  14. Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477(2012).
  15. Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
  16. Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
  19. Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
  20. Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Sonic Hedgehog

Похожие статьи