Method Article

Функциональная характеристика эндогенно экспрессированных вариантов RYR1 человека

DOI:

10.3791/62196

⸱

June 9th, 2021

 ,  , 
1Department of Biomedicine, Basel University Hospital, 2Department of Life Sciences, University of Ferrara, 3Department of Anesthesia, Basel University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описаны методы, используемые для изучения функционального эффекта мутаций RYR1, эндогенно экспрессируемых в вирусе Эпштейна Барра, увековеченных В-лимфоцитах человека и биопсии мышц, полученных из клеток-сателлитов, дифференцированных в миотрубы.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Более 700 вариантов гена RYR1 были идентифицированы у пациентов с различными нервно-мышечными расстройствами, включая восприимчивость к злокачественной гипертермии, основные миопатии и центроядерную миопатию. Из-за различных фенотипов, связанных с мутациями RYR1, крайне важно охарактеризовать их функциональные эффекты, чтобы классифицировать варианты, переносимые пациентами для будущих терапевтических вмешательств, и идентифицировать непатогенные варианты. Многие лаборатории были заинтересованы в разработке методов функциональной характеристики мутаций RYR1, экспрессируемых в клетках пациентов. Такой подход имеет многочисленные преимущества, в том числе: мутации эндогенно экспрессируются, RyR1 не переэкспрессируется, использование гетерологичных клеток, экспрессирующих RyR1, избегается. Однако, поскольку у пациентов могут присутствовать мутации в разных генах, кроме RYR1, важно сравнивать результаты биологического материала от людей, имеющих одну и ту же мутацию, с разным генетическим фоном. В настоящей рукописи описаны методы, разработанные для изучения функциональных эффектов эндогенно экспрессированных вариантов RYR1 в: (а) вирус Эпштейна Барра увековечил человеческие В-лимфоциты и (б) клетки-сателлиты, полученные из биопсии мышц и дифференцированные в миотрубы. Затем контролируют изменения внутриклеточной концентрации кальция, вызванные добавлением фармакологических активаторов RyR1. Выбранный тип клеток нагружается ратиометрическим флуоресцентным индикатором кальция, а внутриклеточные [Ca2+] изменения контролируются либо на уровне одной клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, либо в клеточных популяциях с использованием спектрофлуорометра. Затем кривые реакции агониста агониста в состоянии покоя [Ca2+]сравниваются между клетками здорового контроля и пациентами, имеющими варианты RYR1, что приводит к пониманию функционального эффекта данного варианта.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На сегодняшний день более 700 вариантов RYR1 были идентифицированы в человеческой популяции и связаны с различными нервно-мышечными расстройствами, включая восприимчивость к злокачественной гипертермии (MHS), рабдомиолиз, индуцированный физической нагрузкой, заболевание центрального ядра (CCD), многомикровое заболевание (MmD), центроядерную миопатию (CNM)1,2,3 ; тем не менее, исследования по характеристике их функциональных эффектов отстают, и только около 10% мутаций были протестированы функционально. Различные экспериментальные подходы могут быть использованы для оценки влияния данного варианта RyR1, включая трансфекцию гетерологичных клеток, таких как HEK293 и КЛЕТКИ COS-7 с плазмидным кодированием для WT и мутантной КДНК RYR14,5,трансдукцию диспедических фибробластов мышей с плазмидами и векторами, кодирующими WT и мутантную кДНК RYR1, с последующей трансдукцией с мио-D и дифференцировкой в миотрубы6 , генерация трансгенных животных моделей, несущих мутантные RyR1s7,8,9,характеристику клеток у пациентов, экспрессирующих вариант RYR1 эндогенно10,11,12. Такие методы помогли установить, как различные мутации функционально влияют на канал RyR1 Ca2+.

Здесь описаны методы, разработанные для оценки функциональных эффектов мутаций RYR1. Различные параметры внутриклеточного гомеостаза кальция исследуются в клетках человека, эндогенно экспрессирующих кальциевый канал RyR1, включая миотрубки и увековеченные вирусом Эпштейна Барра (EBV) В-лимфоциты. Клетки получают от пациентов, расширяют в культуре и нагружают ратиометрическими флуоресцентными индикаторами кальция, такими как Fura-2 или indo-1. Параметры, которые, как сообщалось, были изменены из-за патогенных мутаций RYR1, включая покоящуюся [Ca2+],чувствительность к различным фармакологическим агонистам и размер внутриклеточных запасов Ca2+, измеряются либо на уровне одной клетки, с помощью флуоресцентной микроскопии, либо в клеточных популяциях с использованием флуориметра. Результаты, полученные в клетках от носителей мутаций, затем сравниваются с результатами, полученными от здоровых членов контрольной семьи. Этот подход продемонстрировал, что: (i) многие мутации, связанные с MHS, приводят к увеличению покоя [Ca2+]и сдвигу влево кривой реакции дозы либо к KCl-индуцированной деполяризации, либо к фармакологической активации RyR1 с 4-хлор-м-крезолом10,11,12,13; (ii) мутации, связанные с ПЗС, приводят к снижению пика [Ca2+],высвобождаемого фармакологической активацией RyR1, и уменьшению размера, если внутриклеточный Ca2+ хранит12,13,14,15; (iii) некоторые варианты не влияют на гомеостаз Ca2+13. Преимущества этого экспериментального подхода заключаются в следующем: белок RyR1 не переэкспрессирован и физиологические уровни присутствуют, клетки могут быть увековечены (как мышечные клетки, так и В-лимфоциты), обеспечивая клеточные линии, содержащие мутации. Некоторые недостатки связаны с тем, что пациенты могут нести мутации в более чем одном гене, кодирующем белки, участвующие в гомеостазе кальция и / или связи сокращения возбуждения (ECC), и это может усложнить экспериментальные выводы. Например, два варианта JP-45 были идентифицированы в MHS и контрольной популяции, и было показано, что их присутствие влияет на чувствительность рецептора дигидропиридина (DHPR) к активации16. Пациенты должны быть доступны, биологический материал должен быть собран заново, а этические разрешения должны быть получены от местных этических советов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы, описанные ниже, соответствуют этическим принципам Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.

1. Препарат Эпштейна Барра увековечил клеточные линии В-лимфоцитов11

  1. После информированного согласия соберите 30 мл цельной крови в обработанных ЭДТА стерильных трубках из пробанда, несущего мутацию RYR1, и у здоровых членов семьи без мутации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все растворы стерильными и работайте в вытяжке для культивирования тканей.
  2. Выделяют мононуклеарные клетки из цельной крови с помощью сред центрифугирования с градиентом плотности (например, Ficoll-Hypaque, 0,077 г/л).
    1. Поместите 30 мл стерильной крови в коническую стерильную трубку объемом 50 мл.
    2. Поместите наконечник пипетки Пастера, содержащей градиентную центрифугированную среду плотности, на дно трубки и слой 20 мл стерильного раствора центрифугирования градиентной плотности медленно под кровью.
    3. Центрифуга в течение 30 мин при 900 х г при 18°-20°C, без перерыва.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слой мононуклеарных клеток выглядит в виде мутного кольца на межфазе между слоем центрифугирования с градиентом плотности и верхним слоем, содержащим обогащенную тромбоцитами плазму.
  3. Стерильной пипеткой аккуратно удаляют межфазный слой, содержащий мононуклеарные клетки (приблизительно 3-5 мл) и переносят раствор в чистую 50 мл стерильную коническую трубку.
  4. Добавьте 20 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) для промывки клеток, центрифуги в течение 10 мин при 600 х г при комнатной температуре и повторно суспендируйте гранулу в PBS. Повторите в общей сложности три раза; это гарантирует, что все носители будут удалены.
  5. После последней промывки повторно суспендируют клетки в 1-2 мл тканевой культуральной среды (среда RPMI дополнена 10% сывороткой для телят плода, 2 мМ L-глутамина и 100 единицами пенициллина и стрептомицина). Поместите мононуклеарные клетки (приблизительно 1 х 106 клеток) в колбу для культивирования тканей T125, содержащую 20 мл питательной среды ткани.
  6. Инфицировать мононуклеарные клетки вирусом Эпштейна-Барра.
    1. В качестве источника ВЭБ используют супернатанты из культур клеточных линий B95.8 (содержащих 102-10 3 трансформаторных единиц/мл при -80 °C).
    2. Повторно суспендировать 1 х10 6 мононуклеарных клеток со стадии 1,5 в 20 мл тканевой культуральной среды и подвергать их воздействию 2 мл супернатанта из клеточной линии B95,8 в присутствии циклоспорина А (конечная концентрация 0,2 мкг/мл) для инфекции.
  7. Поместите колбу в инкубатор для культивирования клеток при температуре 37 °C и дайте клеткам расти. Через неделю меняют культуральную среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только В-клетки начинают размножаться, они образуют узнаваемые сгустки и быстро растут, так что культуры могут быть расширены и заморожены.
  8. Извлечение геномной ДНК из увековеченных клеточных линий В-лимфоцитов В-лимфоцитов11 для подтверждения наличия или отсутствия данной мутации.

2. Внутриклеточные измерения Ca2+

ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения внутриклеточной концентрации кальция в клеточных линиях В-лимфоцитов, трансформированных в ВЭБ, могут контролироваться в клеточных популяциях с помощью спектрофлуорометра, оснащенного магнитной мешалкой и держателем кюветы, установленным на 37 °C. Альтернативно, изменения Ca2+ могут контролироваться в отдельных клетках с помощью флуоресцентной микроскопии. В обоих случаях клетки извлекают из колбы культуры тканей, дважды промывают раствором Кребса Рингера (140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2,20 мМ HEPES, 1 мМ NaHPO4,5,5 мМ глюкозы, рН 7,4, содержащий 1 мМ CaCl2)и подсчитывают.

  1. Для экспериментов в клеточных популяциях с использованием спектрофторометра11,13,14
    1. Повторно суспендируют клетки в конечной концентрации 1х 10 7 клеток/мл в растворе Кребса Рингера и инкубируют при 37°С в течение 30 мин с конечной концентрацией 5 мкМ Фура-2/АМ.
    2. Центрифужные ячейки при 900 х г в течение 10 мин и повторное их суспендирование в растворе Кребса Рингера в концентрации 2 х 106 клеток/мл.
    3. Измерьте изменения флуоресценции (соотношение 340/380 нм) с помощью спектрофлуорометра, оснащенного магнитной мешалкой, установленной на максимальной скорости и установленной на 37 °C.
    4. Непосредственно перед экспериментом раскрутит клетки на 900 х г в течение 5 мин в микроцентрифуге и быстро повторно суспендирует гранулу в 1,5 мл раствора Кребса Рингера с 0,5 мМ EGTA, но без добавления Ca2+.
    5. Поместите ячейки в стеклянную спектрофлуорометрическую кювету емкостью 3 мл и запишите коэффициент флуоресценции (возбуждение 340 нм/380 нм, эмиссия 510 нм).
    6. Достигните стабильной базовой линии (приблизительно 30 секунд), добавьте выбранную концентрацию агониста RyR1 (4-хлор-м-крезол или 4-cmc) и запишите переходный кальций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве исходного реагента используется 300 мМ запасной раствор 4-cmc, изготовленный в ДМСО. Этот раствор можно сделать заранее, аликвотировать и хранить при -20 °C в течение нескольких месяцев.
    7. Проводите эксперименты для различных концентраций 4-cmc.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включить 75 мкМ, 150 мкМ, 300 мкМ, 450 мкМ, 600 мкМ, 750 мкМ до 1 мМ для получения кривой реакции агониста дозы в сравнении с изменением [Ca2+]. Различные концентрации 4-cmc получают путем добавления соответствующего объема 4-cmc из исходного раствора непосредственно в кювету, содержащую нагруженные ячейки Fura-2. Например, для конечной концентрации 300 мкМ 4-cmc 1,5 мкл исходного раствора добавляют к кювете, содержащей 1,5 мл клеток в растворе Кребса Рингера. Для более низких концентраций агонистов исходный раствор 300 мМ следует разбавить до 75 мМ дМСО и добавить соответствующий объем в кювету, содержащую 1,5 мл клеток в растворе Кребса Рингера.
    8. Добавьте 400 нМ тапсигаргина к клеткам, чтобы рассчитать общее количество Ca2+, присутствующего во внутриклеточных запасах. Запишите пик Ca2+.
    9. Построить график пика кальция, индуцированного заданной концентрацией 4-cmc, по сравнению с пиком кальция, индуцированным тапсигаргином, который считается 100%, и построить кривую реакции дозы 4-cmc, сравнивая клетки из пробанда и здорового родственника
  2. Для экспериментов на одиночных клетках13
    1. Разбавить поли-L-лизин 1:10 в стерильномH2Oи предварительно обработать стеклянные крышки в течение 30 мин. Дайте высохнуть на воздухе под стерильной культуральной вытяжкой.
    2. Повторно суспендировать EBV-трансформированные В-лимфоциты до конечной концентрации 1х 10 6 клеток/мл в растворе Кребса Рингера, содержащем 1 мМ CaCl2, и добавить конечную концентрацию 5 мкМ Fura-2/AM.
    3. Поместите 1 мл клеток на обработанные поли-L-лизином покровы и инкубируйте при 37 °C в увлажненном инкубаторе клеточной культуры в течение 30 минут, чтобы клетки EBV прилипали к стеклянному покровному листу во время загрузки.
    4. Поместите крышку в перфузионную камеру и начните перфузию (со скоростью 2 мл/мин) раствором Кребса Рингера, содержащим 1 мМ Ca2+.
    5. Используйте перевернутый флуоресцентный микроскоп (оснащенный 40-кратным масляным иммерсионным объективом (числовая апертура 0,17), фильтры (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) для записи онлайн-измерений с программным управлением камерой с зарядовой связью (ПЗС).
    6. Получение изображений с интервалом 1 с фиксированной экспозицией (100 мс для длин волн возбуждения 340 и 380 нм). Используйте программное обеспечение для визуализации для анализа изменений флуоресценции. Измерьте среднее значение пикселя для каждой ячейки при длинах волн возбуждения 340 и 380 нм13.
    7. Для достижения стимуляции клеток используйте стимулятор перфузии клеток с 12 клапанами и добавляйте различные концентрации 4-cmc. Промывочный клапан содержит раствор Кребса Рингера без добавления Ca2+ плюс 100 мкМ La3+ для контроля высвобождения кальция только из внутриклеточных запасов.
    8. Построить кривую реакции дозы 4-cmc в сравнении с изменением [Ca2+],как описано выше.

3. Подготовка миотруб человека из биопсии мышц10,12,15

ПРИМЕЧАНИЕ: Различные лаборатории использовали различные методы для получения миобластов и миотуб, полученных из спутниковых клеток. Ниже приведено описание метода, используемого в Базеле.

  1. Промыть биопсию мышц стерильным PBS для удаления лишней крови и разрезать на мелкие фрагменты размером около 0,5-1 мм.
  2. Приготовьте 6 блюд для посева тканей с помощью вкладыша. Добавьте 1,5 мл среды роста мышц человека к каждой лунке и 0,5 мл среды роста мышц человека к каждой вставке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда состоит из 500 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle's с высоким содержанием глюкозы или DMEM (4,5 мг / мл), содержащей 10% конской сыворотки, 5 нг / мл инсулина, 3 мМ глутамина, 600 нг / мл пенициллина G и стрептомицина и 7 мМ HEPES, рН 7,4. Также может быть использована коммерчески доступная среда для роста скелетных мышц.
  3. Поместите 2-3 небольших мышечных фрагмента в каждуювставку (рисунок 1А)и поместите чашки для культивирования в инкубатор клеточных культур (5% CO2,37 °C). Примерно через 8-10 дней можно увидеть, как клетки-сателлиты растут из и вокруг биопсии мышц, прикрепленной к вставке(рисунок 1,B и C, стрелки).
  4. Высвободите достаточное количество клеток из биопсии (примерно через 10-14 дней), трипсинизируют следующим образом:
    1. Удалить всю культуральную среду, промыть клетки один раз 1 мл PBS, добавить 0,5 мл раствора трипсина/ЭДТА (0,025% трипсина и 0,01% ЭДТА) и инкубировать при 37 °C в течение 5 мин.
    2. Добавить 1 мл питательной среды к клеткам для нейтрализации эффекта трипсина и перенести клетки-сателлиты в новую колбу для культуры клеток Т25; добавить 3 мл питательной среды и поместить клетки в инкубатор клеточной культуры (5% CO2,37 °C).
    3. Измените питательную среду на следующий день, чтобы удалить ЭДТА, а затем измените среду один раз в неделю.
  5. Когда миобласты будут примерно на 75% сливаться, попробуйте и перенесите их на обработанные ламинином стеклянные крышки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве пропорции клетки, растущие в одной колбе T25, должны быть перенесены на одну стеклянную крышку диаметром 43 мм. Стеклянная крышка должна быть помещена в тканевую культуральную пластину диаметром 60 мм, содержащую 3 мл питательной среды.
  6. Выращивайте клетки на стеклянном покровном листе в питательной среде в инкубаторе клеточной культуры (5% CO2,37 °C), меняя среду один раз в неделю. При 90% слиянии переходят на дифференцировочную среду, состоящую из следующих: высокий уровень глюкозы DMEM (4,5 мг/мл), 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, креатин 0,15 мг/мл, инсулин 5 нг/мл, 200 мМ глутамина, 600 нг/мл пенициллина G и стрептомицина и 7 мМ HEPES, рН 7,4). Также может быть использована коммерчески доступная дифференциационная среда. Меняйте дифференцирующую среду один раз в неделю.
  7. Через 7-10 дней в дифференцирующей среде видны многоядерные миотрубки. Оцените изменения в [Ca2+] в течение одной недели, как описано ниже.

4. [Ca2+] измерения соотношенияi, определяемые с помощью Fura-2

  1. Загрузить стеклянные покровы, выращенные миотрубами с Фура-2/АМ (конечная концентрация 5 мкМ), разбавленными в ДМЭМ в течение 30 мин при 37 °С. Вкратце, удалите дифференцировочную среду из стеклянных покровных клеток и добавьте 2 мл свежей дифференцировочной среды. Добавьте 10 мкл Fura-2 AM из исходного раствора 1 мМ и инкубируйте 30 мин в инкубаторе клеточной культуры (5% CO2,37 °C).
  2. Переложите стеклянную крышку в перфузионную камеру и промойте ячейки раствором Кребса Рингера, содержащим 2 мМ CaCl2.
  3. Выполняйте онлайн-измерения [Ca2+],как описано выше в одноэлементном разделе EBV с использованием объектива FLUAR с погружением в воду 20x (числовая апертура 0,17).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

[Ca2+]i измерения в популяциях УВ-увековеченных В-лимфоцитов
Первичные В-лимфоциты экспрессируют изоформу RyR1, которая функционирует как канал высвобождения Ca2+ во время сигнальных процессов, стимулируемых рецептором антигена В-клеток17. Увековечение В-клеток с помощью ВЭБ, процедура, обычно используемая генетиками для получения клеточных линий, содержащих геномную информацию ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы, описанные в этой статье, были успешно использованы несколькими лабораториями для изучения влияния мутаций RYR1 на гомеостаз кальция. Важнейшие этапы подходов, изложенных в настоящем документе, касаются стерильности, навыков и методов культивирования клеток и доступности биологического материала. В принципе, использование В-увековеченных В-лимфоцитов проще и позволяет генерировать клеточные линии, содержащие мутантные каналы RyR1. Клетки могут быть заморожены и храниться в жидком азоте в течение многих лет, а к...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа, описанная в этой рукописи, была поддержана грантами Швейцарского национального научного фонда (SNF) и Швейцарского мышечного фонда.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-хлор-м-крезолFluka24940
Пробирки для сбора кровиSarstedt172202
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-AldrichA7906
кофеинMerk102584
Cascade 125+ CCD камераФотометрия
Cascade 128+ CCDФотометрика
КреатинSigma-AldrichC-3630
DMEMThermoFisher Scientific11965092
DMSOSigma41639
EGTAFluka3778
Эпидермальный фактор роста (EGF)Sigma-AldrichE9644
Ficoll PaqueCytiva17144002
Эмбриональная сыворотка для теленкаThermoFisher Scientific26140079
Fura-2/AMInvitrogen Life SciencesF1201
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050061
HEPESThermoFisher Scientific15630049
Сыворотка для лошадейThermo Fisher Scientific16050122
инсулинThermoFisher НаучныйA11382II
ИономицинSigmaI0634
KClSigma-AldrichP9333
ЛамининThermoFisher Scientific23017015
LanthanumFluka61490
Микроперфузионная системаALA-ScientificDAD VM 12 клапанный коллектор
Origin SoftwareобеспечениеOriginLab Corp
Пеннициллин/стрептомицинGibco Life Sciences15140-122
Перфузионная камера POC-RPecon000000-1116-079
поли-L-лизинSigma-AldrichP8920
RPMIНаучный21875091
спектрофлуориметрPerkin ElmerLS50
Чашки для культуры тканей ThapsigarginCalbiochem586005
Falcon353046
Колба для культуры тканейFalcon353107
Вкладыши для культуры тканейFalcon353090
Раствор трипсина/ЭДТАThermoFisher Scientific25300054
VisiviewVisitron Systems GmbHSoftware Zeiss
Axiovert S100 Телевизионный микроскопCarl Zeiss AG
Стеклянные покровные стекла ZeissCarl Zeiss AG0727-016
Программное

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
  2. Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
  3. Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
  4. Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
  5. Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
  6. Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
  7. Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
  8. Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
  9. Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
  10. Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
  11. Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077(2001).
  12. Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
  13. Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
  14. Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
  15. Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
  16. Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
  17. Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
  18. Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
  19. Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
  20. Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
  21. Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372(2016).
  22. Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
  23. Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
  24. Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
  25. Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
  26. Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
  27. Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RYR1 VariantsCalcium HomeostasisIntracellular CalciumFluorescence MicroscopySpectrofluorometer AnalysisB LymphocytesHuman MyotubesFura 2 AMDose Response CurveMalignant Hyperthermia

Related Articles