Исследования белков в природных мембранах с высоким разрешением методом твердотельного ЯМР

Краткое содержание

В этой работе подробно описаны надежные базовые процедуры подготовки образцов мембранных белков, меченных изотопами, и их анализа с высоким разрешением с помощью современных методов твердотельной ЯМР-спектроскопии.

Аннотация

Мембранные белки жизненно важны для функционирования клеток и, таким образом, являются важными мишенями для лекарств. Твердотельная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ssNMR) предлагает уникальный доступ к исследованию структуры и динамики таких белков в биологических мембранах возрастающей сложности. В данной работе мы представляем современную твердотельную ЯМР-спектроскопию как инструмент для изучения структуры и динамики белков в естественных липидных мембранах и на атомном уровне. В таких спектроскопических исследованиях используются высокочувствительные методы ЯМР, т.е. ЯМР, детектируемый протонами (¹H), и ДНФ (динамическая ядерная поляризация) с поддержкой ЯМР. Используя бактериальный бета-бочонок BamA и ионный канал KcsA, мы представляем методы получения меченых изотопами мембранных белков и получения структурной и двигательной информации с помощью ssNMR.

Введение

Структурные и двигательные исследования мембранных белков в физиологически значимых средах бросают вызов традиционным методам структурной биологии¹. Современные методы твердотельной ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии (ЯМР) предлагают уникальный подход к характеризации мембранных белков 2,3,4,5,6,7 и уже давно используются для изучения мембранных белков, включая мембранные белковые насосы 8, каналы ^9,10,11 или рецепторы^12,13,14,15. Технические достижения, такие как сверхвысокие магнитные поля >1000 МГц, быстрые частоты вращения под магическим углом >100 кГц, а также методы^{гиперполяризации16}, сделали ЯМР мощным методом изучения мембранных белков в средах все возрастающей сложности, от липосом до клеточных мембран и даже целых клеток. Например, ДНФ стал мощным инструментом для таких экспериментов (см. ссылку 17,18,19,20,21,22,23,24,25). В последнее время ¹H-детектируемый ssNMR предлагает все больше возможностей для изучения мембранных белков с высоким спектральным разрешением и чувствительностью 25,26,27,28,29. В этой работе выделены два бактериальных мембранных белка, которые участвуют в основных функциях, т.е. в вставке белка и транспортировке ионов. Соответствующие белки, BamA 25,30,31,32,33 и KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (или их химерные варианты ^10,40) были исследованы с помощью ssNMR методов уже более десяти лет.

Здесь представлен репрезентативный протокол получения и характеристики ssNMR мембранных белков, происходящих из бактериального происхождения. Различные этапы протокола показаны на рисунке 1. Во-первых, объясняется экспрессия, мечение изотопов, очистка и мембранное восстановление BamA. Затем представлен общий рабочий процесс для определения характеристик мембранного белка с помощью ssNMR; в частности, распределение белковых основ мембраны с помощью 1-H-детектируемого ssNMR при быстром магическом угле вращения. Наконец, подробно описываются основы настройки и регистрации экспериментов с динамической ядерной поляризацией (DNP), которые значительно повышают чувствительность сигнала ssNMR.

Протокол

1. Производство унифицированных ^{марок 2}H, ¹³C, ¹⁵N BamA-P4P5

ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что этот протокол требует работы с непатогенными грамотрицательными бактериями, соблюдение основных процедур биологической безопасности является обязательным, а именно: ношение защитных очков, лабораторных халатов, перчаток и следование стандартным рабочим процедурам учреждения для работы с микроорганизмами.

1. Используйте одну колонию E. coli BL 21 Star (DE3), содержащую плазмиду pET11aΔssYaeT, кодирующую E. coli BamA-P4P5, для инокуляции 50 мл бульона Lysogeny с добавлением 50 мкг/л ампициллина.
2. Выращивайте культуру при 37 °C при 200 об/мин до тех пор, пока не будет достигнут внешний диаметр₆₀₀ 0,6. Вращайте при скорости 2 000 x g в течение 10 минут. Ресуспендируйте гранулу в 50 мл M9 (см. Таблицу 1) до максимального наружного диаметра₆₀₀ 0,1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы выращивания происходят при условиях, указанных выше, если не указано иное.
3. Выращивают культуру до ОД₆₀₀ от 0,5. Вращайте при температуре 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторно суспендируйте гранулу в 50 мл M9, содержащей 90%_D2O(рецепт см. в Таблице 1 ) до максимального наружного диаметра₆₀₀ 0,1. Выращивайте культуру в течение ночи при 30 °C при 200 об/мин.
4. Уменьшите температуру культуры при 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте гранулу в предварительно подогретом 50 мл 90% D₂O M9 до максимального наружного диаметра₆₀₀ 0,1. Увеличивайте до тех пор, пока не будет достигнут внешний диаметр₆₀₀ 1,0.
5. Уменьшите температуру культуры при 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Приготовьте 100 мл 100% среды D₂O M9 с обогащенным изотопами количеством необогащенной глюкозы и хлорида аммония. Ресуспензия в среде 100% D₂O M9 до максимального наружного диаметра₆₀₀ 0,1. Выращивайте до тех пор, пока не будет достигнут внешний диаметр₆₀₀ 0,7.
6. Уменьшите температуру культуры при 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 мл 100% D₂O M9 среды с изотопами (см. таблицу 1) до максимального наружного диаметра₆₀₀ 0,1.
7. Дайте культуре расти до тех пор, пока не будет достигнут ОД₆₀₀ в 0,6-0,9. Индуцировать 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранизида (IPTG). Сцеживайте в течение 4 ч и собирайте клетки при 4 000 x g в течение 15 мин при комнатной температуре.

2. Очистка, рефолдинг и формирование протеолипосомы BamA-P4P5

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы этого раздела должны выполняться в вытяжном шкафу. При открытии пробирок необходимо соблюдать особую осторожность при ограничении содержания вредных аэрозолей после центрифугирования.

1. Разморозьте гранулу на льду. Суспендируйте гранулу в 20 мл холодного буфера 1. Буферы см. в таблице 2 .
2. Уменьшите температуру раствора при 4 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Повторно суспендируйте гранулу в 20 мл холодного дистиллированного H₂O. Дайте суспензии инкубироваться на льду в течение 10 минут.
3. Убавьте суспензию при 4 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Ресуспендируйте в холодный буфер 2 объемом 10 мл и дайте инкубироваться на льду в течение 30 минут.
4. Добавьте в смесь еще 10 мл холодного буфера 2 и инкубируйте еще 30 минут на льду. Добавьте 0,5% n-додецил-B-D-мальтозид (ДДМ) и аккуратно перемешайте.
5. Ультразвуковая обработка образца на льду с частотой 13 кГц до интенсивного использования импульсов включения/выключения длительностью 10 с. Вращайте при 25 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Трижды умыться 20 мл буфера 3. Центрифугируйте при 25 000 x g в течение 20 мин при 4 °C.
6. Ресуспендируйте гранулу в 20 мл буфера 4. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут. Обработайте образец ультразвуком на льду с частотой 13 кГц до четких импульсов включения/выключения продолжительностью 10 с.
7. Уменьшите температуру образца при 25 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Повторите шаги с 2.4 по 2.6, не добавляя ингибитора протеазы, и инкубируйте при 37 °С.
8. Промойте гранулу 20 мл воды и дважды с Буфером 3. Вращайте при 25 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Разложите суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1 мл и вращайте микроцентрифужные пробирки с максимальной скоростью на настольной центрифуге в течение 20 минут. Чистоту тела включения оценивают с помощью 10% геля SDS-Page, см. Рисунок 2A. Ожидаемый выход для очищенного BamA-P4P5 трижды (^{2 H,13 C,15}N) меченого составляет 30 мг/л.
9. Растворяют тела включения в 200 мкл буфера 5 и 300 мкл H₂O. Добавляют 6М гуанидия хлорида (GdnCl). Отрегулируйте объем микроцентрифужной пробирки до 1 мл с помощью Н₂О. Перебейте смесь в вихрь и выдержите в течение 4 ч при комнатной температуре. Периодически (каждые 30 минут) делайте вихревые пробирки микроцентрифуги.
10. Вращайте при 100 000 x g в течение 1 часа при 4 °C. Используйте закон Бера-Ламберта для определения концентрации белка с точностью до 280 нм. Коэффициент затухания моляров составляет 117,120 ^{М-1 см-1}. Если концентрация составляет >100 мкМ, разбавьте 1x Буфером 5 с 6 M GdnCl. Быстро разбавьте белок в 10 раз в буфере 6. Инкубируйте смесь в течение ночи при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ультрацентрифугирования используйте пробирки класса ультрацентрифугирования 1,5 мл.
11. Определите эффективность повторного сворачивания с помощью полунативного геля SDS-Page. Возьмите две аликвоты по 10 мкл из шага 2.10 и добавьте 10 мкл буфера Lameili (буфер 8) к каждой аликвоте. Кипятить один образец в течение 10 минут при температуре 95 °C; Оставшуюся аликвоту оставьте на льду. После этого запустите оба образца при 14 мА на 10% геле SDS-Page. В укладывающей и рабочей частях гелей отсутствует восстановитель и SDS. Окрашивание белка достигается с помощью красителя кумасси. Ожидаемые результаты показаны на рисунке 2B.
12. Уменьшите температуру образца при 4 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Сконцентрируйте образец до рабочего объема 8 мл с помощью центробежного фильтра с усилием 30 кДа. Вращайте образец при температуре 4 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Измерьте абсорбцию белка при длине волны 280 нм. Как и в шаге 2.10, определите концентрацию белка.
13. Рассчитайте количество липидов, необходимое для соотношения липидов к белку 10:1 (LPR-моль/моль). Добавьте необходимое количество липидов, рассчитанное на шаге 2.12, в колбу с круглым дном объемом 100 мл (RBF). Откачайте хлороформ из RBF под слабой струей азота. Поместите RBF в режим высокого вакуума на 3 часа. Увлажните липидную пленку 1 мл Buffer 7. Инкубируйте RBF в течение 10 минут при 37 °C.
14. Добавьте белковую смесь (с шага 2.12) в RBF.
15. Разбавьте смесь белка и липидов (с шага 2.14) до конечного объема 50 мл в RBF. Используйте Буфер 7 с добавлением 1х ингибитора протеазы, растворенного в ДМСО, и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
16. Диализируйте против 100 объемов Buffer 7 в течение 2 недель (используйте трубки для отсечения молекулярной массы 12-14 кДа). В течение первых 24 часов проводите диализ при комнатной температуре с добавлением свежего буфера 7 каждые 8 часов. После этого меняйте буфер один раз в день и проводите диализ при температуре 4 °C.

3. Заполнение ротора ssNMR

1. После шага 2.16 центрифугируйте в течение 30-60 минут при 10 000 x g при 4 °C, чтобы образовалась гранула. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная ниже методика была оптимизирована для ротора диаметром 3,2 мм, но применима практически для ротора любого диаметра.
2. Поместите образец пипеткой в ротор и аккуратно открутите его с помощью настольной центрифуги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от консистенции образца можно использовать либо инструмент для уплотнения образца, либо шпатель вместо пипетки для помещения образца в ротор.
3. Повторите этот процесс 2-3 раза, пока ротор не заполнится до нужной высоты, и проверьте, достаточно ли места для колпачка, как указано маркерной линией на инструменте уплотнения. Закройте ротор с помощью инструмента для позиционирования крышки на ровной поверхности. Отметьте половину нижнего края ротора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Новые поколения роторов ssNMR поставляются с прочной лазерной меткой на нижнем краю для оптического обнаружения частоты вращения ротора. В противном случае рекомендуется использовать ручку для острых резон; так как детектор MAS был оптимизирован специально для чернил sharpie.
4. Используйте лупу, чтобы проверить, правильно ли установлен колпачок.

4. Определение характеристик образцов с помощью 2D ^{13 C-13}C ssNMR спектроскопии

1. Вставьте ротор в магнит, используя автоматическую процедуру вращения устройства MAS, раскрутите образец до желаемой частоты MAS в диапазоне от 10 до 20 кГц MAS, охлаждая образец до заданной температуры 270 K. Настройте и совместите каналы ¹H и ¹³C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе частоты MAS избегайте случайного совпадения расстояния химического сдвига между спектральной областью Cα и областью карбонильного углерода с частотой вращения, т.е. избегайте условия резонанса вращения^{первого порядка 41}.
2. Оптимизируйте ^{эксперимент}по кроссполяризации⁴² (CP) 1 ^H-13C путем изменения мощности радиочастот на протонном канале в диапазоне от 25 до 80 кГц. Типичными параметрами являются ВЧ мощность 45 кГц при ¹³С, гетероядерная развязка 80-100 кГц ¹H-развязка⁴³ во время регистрации, задержка рециркуляции 1,8-2,0 с и 64 сканирования.
   1. Оптимизируйте время контакта CP для максимальной чувствительности сигнала на алифатических углях.
   2. Определите длину импульса ¹ч 90° в эксперименте ¹³C-CP, умножив начальный импульс на четыре, т. е. оптимизировав импульс на 360°, и изменяйте длину до тех пор, пока сигнал не исчезнет. Включите прямоугольный импульс непосредственно после переноса CP и аналогично оптимизируйте длину импульса ¹³C 90°.
3. Проведите эксперимент 2D ^{13 C-13}C по протонной спиновой диффузии (PDSD), такой как PARIS, с временем передачи намагниченности 30 мс для обнаружения внутриостаточных корреляций и оценки качества образца. Передайте уровни мощности, время контакта и длину импульсов 90° из ранее оптимизированного эксперимента ¹³C-CP. Используйте время сбора данных 4–6 мс в косвенном измерении. Обрабатывайте спектр с помощью функций квадрата син-колокола (QSIN) или, для нечувствительных образцов, экспоненциального уширения линии в обоих измерениях.
4. Извлекаем срезы изолированных перекрестных пиков и определяем ширину линии на половинных высотах. Ширина линии в пределах ~0,3-1,0 ¹³°C ppm указывает на хорошо упорядоченный образец, идеально подходящий для характеристики ssNMR, в то время как ширина линии выше ^{1,0 13}C ppm указывает на конформационную гетерогенность, которая может нарушить характеристику ssNMR. Спектр BamA в 2D CC Paris, показанный на рисунке 3A , является примером хорошо упорядоченного белка, который дает высококачественные спектры.

5. Назначение магистральных магистралей с помощью ¹H-детектируемой 3D ssNMR спектроскопии

1. Получение спектральных отпечатков 2D NH
   1. Залейте образец в ротор диаметром 1,3 мм, как описано выше. Вставьте ротор в магнит, раскрутите образец до 10-20 кГц MAS и охладите образец до заданной температуры 240-250 К или ниже, в зависимости от технических характеристик зондовой головки ssNMR. Используйте интерфейс блока MAS для постепенного увеличения частоты MAS с шагом от 5 кГц до 60 кГц MAS.
   2. Оптимизируйте амплитуды CP, время контакта и длину импульсов 90° в экспериментах с CP ¹³C- и ¹⁵N. Используйте амплитуды около 30-50 или 70-100 кГц на гетероядерных каналах и варьируйте амплитуду на ¹H-канале от 80-180 кГц. Используйте задержку рециркуляции 0,7-1,2 с, а также маломощную развязку маломощных гетероядерных протонов на частоте 15 кГц⁴⁴. Кроме того, см. ссылку⁴⁵ для получения дополнительной практической информации о том, как проводить эксперименты CP ssNMR.
   3. Приобретите 2D-эксперимент NH для измерения разрешения ¹H. Передайте ¹⁵параметров N-CP и используйте время сбора данных приблизительно 15 и 25 мс в прямых и косвенных размерах. Для первой передачи CP от ¹H до ¹⁵N используйте ранее оптимизированное время контакта. Для обратного переноса с ¹⁵Н на ¹Н используйте время контакта 0,7-1,0 мс, чтобы свести к минимуму передачу межостаточной намагниченности.
   4. Используйте 50-250 мс воды MISSISSIPPI suppression⁴⁶, в зависимости от содержания воды в пробе. Обработка спектра с помощью функций Син-Колокола (QSIN) в обоих измерениях. Извлекаем срезы изолированных перекрестных пиков и определяем ширину линии на половинных высотах. Пример высококачественного 2D спектра^{NH 25} показан для мембранного BamA-P4P5 на рисунке 3B.
2. Назначения магистральных магистралей
   1. Оптимизация эксперимента по CP-симметрии ^{1D 15}N до ¹³Cα⁴⁷. Поместите носитель ¹³C в середину области Cα около 55 ppm. Используйте радиочастотную амплитуду ¹³C 20 кГц и изменяйте амплитуду ¹⁵Н в диапазоне от 35 до 45 кГц для максимальной передачи сигналам Cα и минимальной передачи карбонильных сигналов. Оптимизируйте время контакта от 3 до 10 мс с шагом 1 мс.
   2. Проведите 3D-эксперимент CαNH. Перенос всех амплитуд CP, времени контакта и длительности импульсов из ранее оптимизированных этапов. Используйте приблизительно 10 мс и 30 мс в измерениях косвенного и прямого захвата. Обрабатывайте спектр с помощью функций квадрата син-колокола (QSIN) во всех трех измерениях.
   3. Оптимизация переноса намагниченности 1D Cα в CO DREAM⁴⁸. Начните с переноса ЦП в диапазоне ^{от 15}Н до ¹³Cα. Затем перенесите намагниченность с Cα на CO с помощью спинового замка на канале ¹³C. Изменяйте амплитуду РЧ в диапазоне от 20 до 35 кГц для оптимальной передачи. Оптимизируйте время передачи от 4 до 10 мс.
   4. Проведите 3D-эксперимент Cα(CO)NH. Перенос всех амплитуд РЧ-сигналов, времени контакта и длины импульсов с ранее оптимизированных шагов. Используйте приблизительно 10 мс и 30 мс в измерениях косвенного и прямого захвата. Обрабатывайте спектр с помощью функций квадрата син-колокола (QSIN) во всех трех измерениях.
   5. Повторите и адаптируйте шаги 1-4 для аналогичных 3D экспериментов CONH и CO(Cα)NH. Используйте этот квартет 3D-экспериментов для последовательных прогулок Cα и CO для назначения белковой основы, как показано на примере KcsA на рисунке 4²⁸.

6. Динамика ^{белков с помощью}1-H-детектируемой ssNMR-спектроскопии

1. Для исследований ¹⁵N T₁ используйте ранее оптимизированный эксперимент 2D NH на частоте MAS 60 кГц и включите задержку после первого шага кроссполяризации от ¹H до ¹⁵N. Проведите серию двухмерных NH-экспериментов и изменяйте задержку от 0 до 16 с, используя шаги, например, 0, 2, 4, 8 и 16 с.
2. Построение графика нормализованной интенсивности разрешенных сигналов в зависимости от увеличения времени задержки. Подгоним затухание T₁ к одиночным экспоненциалам в соответствии с y = exp^(-x/T1), где y — интенсивность сигнала в момент затухания x.
3. Аналогично, для исследований ¹⁵Н Т_1rho включите импульс спин-синхронизации в программу импульсов на канале ¹⁵Н с амплитудой РЧ в диапазоне от 15-20 кГц после первого шага кроссполяризации ^26,49 от 1 Н до ¹⁵Н. Получить серию 2D NH экспериментов и варьировать задержку от 0 до 150 мс, а также подгонять затухание T_1rho разрешенных сигналов к единичным экспоненциалам. Иллюстративные данные ¹⁵N T_1rho для мембранных каналов K⁺ показаны на рисунке 5^27,28.

7. Динамическая ядерная поляризация

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие подготовительные шаги относятся к использованию коммерческих установок DNP с использованием 3,2-миллиметровых сапфировых роторов MAS (Рисунок 6)²⁰. Использование роторов из диоксида циркония или другого оборудования DNP может привести к снижению усиления сигнала DNP.

1. Ресуспендируйте гранулу мембранного белка (начиная со стадии 3.1) в 50 мкл дейтерированного буфера DNP (60% (v/v) дейтерированных d8- и глицерина и 15 мМ AMUPol⁵⁰. Для экспериментов на частоте 800 МГц мы рекомендуем использовать 10 мМ NATriPOL-3⁵¹. Также см. ссылку⁵² для дальнейших практических аспектов экспериментов DNP ssNMR.
2. Центрифугируйте в течение 10-20 минут при 100 000 x g при 4 °C, чтобы образовалась гранула. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
3. Предварительно охладите центробежный адаптер и компоненты сапфирового ротора MAS диаметром 3,2 мм до <4 °C. Следующие шаги (7.4-7.7) должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы предотвратить снижение количества агентов DNP.
4. Поместите сапфировый ротор диаметром 3,2 мм в адаптер центрифуги и заполните его суспензией протеолипосом, начиная с шага 7.2.
5. Осторожно прижмите образец белка ресуспендированной мембраны к внутренней стенке ротора с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Дайте раствору сползти вниз к нижней части ротора. Следите за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха.
6. Вращайте образец в роторе в течение 5-10 минут при 4 500 x g при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость, содержащую избыток сока DNP, осторожно отпив его, не нарушая клеточную гранулу. Повторяйте шаги 6.4-6.6 до тех пор, пока ротор не заполнится.
7. Осторожно расположите распорку из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с помощью распорного винта в верхней части ротора.
8. Поместите ротор крышкой вниз в поршень ротора⁵³ и погрузите ротор в жидкий азот. Дайте ротору и образцу не менее 30-60 секунд, чтобы они замерзли.
9. Запустите блок теплообменника и охладите зонд DNP до ~90K.
10. Установите блок MAS в ручной режим и установите переменную температуру (VT) на 135 л/ч, а расход газа подшипника и привода на ~6 л/ч.
11. Включите функцию извлечения на консоли MAS.
12. Перенесите замороженный образец из Шага 7.8 из жидкости N2 в пробоуловитель и поместите его в зонд (см. также ссылку⁵³).
13. Вручную увеличьте давление подшипника щупа (Bp) до ~500 мбар перед включением «Вставки». Это целесообразно для стабильного и безопасного вращения ротора.
14. Увеличить скорость MAS до нужного значения с помощью процедуры, описанной в ссылке⁵³.
15. Проверьте наличие улучшений DNP с микроволнами и без них с помощью стандартных экспериментов 1D CP (см., например, ссылку^51,54) (рис. 7), прежде чем приступать к многомерным экспериментам, например, экспериментам 2D CC, описанным в разделе 3 данной статьи.

Результаты

На рисунке 2 показаны репрезентативные гели для чистоты тела включения (панель А) и повторного складывания тел включения (панель В3). Рисунок 2 подтверждает успешную очистку ^{13 C,15}N-меченного BamA-P4P5.

На фиг.3А показан типичный 2D ^{13 C-13}C спектра хорошо упорядоченного мембранного белка, а на фиг.3B показан типичный высококачеств...

Обсуждение

Мембранные белки играют ключевую роль в регуляции жизненно важных клеточных функций как у прокариотических, так и у эукариотических организмов; Таким образом, понимание механизмов их действия на атомных уровнях разрешения имеет жизненно важное значение. Существующие методы структурной биологии продвинули научное понимание мембранных белков довольно далеко, но в значительной степени опираются на экспериментальные данные, собранные из систем in vitro, лишенных мембран. В данной статье пред...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Молибдат аммония	Merck	277908
Хлорид аммония-15N	Кортекнет	CN80P50
ампициллин	Sigma Aldrich	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
бензоназа	EMD Millipore Corp	70746-3
Борная кислота	Merck	B6768
бромофеноловый синий	Sigma	B0126
дихлорид кальция	Merck	499609
хлорид холина	Sigma	C-1879
хлорид кобальта	Merck	449776
медный купорос	Merck	C1297
D-биотин	Merck	8512090025
оксид дейтерия	Cortecnet	CD5251P1000
Диметилсульфоксид	Merck	D9170
Этилендиаминтетрауксусная кислота	Sigma Aldrich	L6876
Фолиевая кислота	Sigma	F-7876
Глюкоза 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
глицерин	Honeywell	G7757
Глицерин (12C3, 99.95% D8, 98%)	Евизотоп	CDLM-8660-PK
глицерин (необогащенный)	Honeywell	G7757-1L
Глицин	Sigma Aldrich	50046
Гуанидина гидрохлорид	Roth Carl	NR.0037.1
Сульфат железа	Merck	307718
изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранизид	Thermofisher	R0392
Лизогенный бульон	Merck	L3022
Лизоцим	Sigma Aldrich	L6876
Хлорид магния - гексагидрат	Fluka	63064
Сульфат магния	Merck	M5921
монокалийфосфат	Merck	1051080050
Миоинозитол	Sigma	I-5125
n-додецил-B-D-мальтозид	Acros Organics	3293702509
N,N-диметилдодециламин N-оксид	Merck	40236
никатинамид	Sigma	N-3376
пантотеновая кислота	Sigma	21210-25G-F
ингибитор протеазы	Sigma	P8849
Пиридоксаль-HCl	Sigma	Aldrich P9130
Рибофлавин	Aldrich	R170-6
Хлорид натрия	Merck	K51107104914
Натрия дигидрофосфат - моногидрат	Sigma Aldrich	1,06,34,61,000
Додецилсульфат натрия	Thermo-scientific	28365
Гидроксид натрия	Merck	1,06,49,81,000
Сахароза	Sigma Life Science	S9378
Тиамин-HCl	Merck	5871
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10,70,89,76,001
Хлорид цинка	Merck	208086
E.coli BL21 DE3*	New England Biolabs	C2527
1,5 мл Ультра-пробирки	Beckman Сошник	357448
30 кДа центробежный фильтр	Amicon	UFC903024
3,2 мм сапфировый ротор DNP с колпачками	Cortecnet	H13861
3,2 мм тефлоновая вставка	Cortecnet	B6628
3,2 мм упаковщик/распаковщик образцов	Cortecnet	B6988
3,2 мм Ротор MAS с обычными стенками	Cortecnet	HZ16913
3,2 мм Ротор MAS с обычными стенками	Cortecnet	HZ09244
Набор инструментов для 3,2 мм Тонкостенный ротор	Cortecnet	B136904
ротор MAS 1,3 мм + колпачки	Cortecnet	HZ14752
Инструмент для наполнения 1,3 мм	Cortecnet	HZ14714
1,3 мм Упаковщик проб	Cortecnet	HZ14716
1,3 мм Съемник	колпачков 1,3 ммCortecnet	HZ14706
набор колпачков 1,3 мм	Cortecnet	HZ14744
Диализная трубка 12-14 кДа	Spectra/Por	132703
Sharpie - Black	Merck	HS15094