Method Article

Оценка и количественная оценка микроэпителиальных промежутков в слизистой оболочке толстой кишки с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания

DOI:

10.3791/62204

⸱

June 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы описываем новый метод визуализации конкретного места, где трансцеллюлярная и парацеллюлярная проницаемость усиливается в воспаленной слизистой оболочке толстой кишки. В этом анализе мы применяем флуоресцентный краситель с массой 10 кДа, конъюгированный с декстраном, фиксируемым лизином, для визуализации областей с высокой проницаемостью (HPR) в слизистой оболочке толстой кишки.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителиальные клетки, выстилающие слизистую оболочку кишечника, создают физический барьер, отделяющий содержимое люминала от интерстиция. Нарушение эпителиального барьера связано с развитием различных патологий, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). В воспаленной слизистой оболочке поверхностные эрозии или микроэрозии, повреждающие монослои эпителия, соответствуют участкам высокой проницаемости. В образовании микроэрозий участвует несколько механизмов, включая выделение клеток и апоптоз. Эти микроэрозии часто представляют собой микроскопические эпителиальные промежутки, случайно распределенные в толстой кишке. Визуализация и количественная оценка этих эпителиальных промежутков стали важным инструментом для исследования барьерной функции кишечного эпителия. В этой статье мы описываем новый метод визуализации конкретного места, где трансцеллюлярная и парацеллюлярная проницаемость усиливается в воспаленной слизистой оболочке толстой кишки. В этом анализе мы применяем флуоресцентный краситель с массой 10 кДа, конъюгированный с декстраном, фиксируемым лизином, для визуализации областей с высокой проницаемостью (HPR) в слизистой оболочке толстой кишки. Дополнительное использование маркеров клеточной смерти показало, что HPR охватывает апоптотические очаги, где происходит экструзия/отслаивание эпителия. Описанный здесь протокол обеспечивает простой, но эффективный подход к визуализации и количественной оценке микроэрозий в кишечнике, что является очень полезным инструментом в моделях заболеваний, при которых кишечный эпителиальный барьер нарушен.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) создает физический барьер, который разделяет внеклеточную среду и внутреннюю среду хозяина и участвует в усвоении питательных веществ, воды и электролитов. Кишечный барьер включает в себя слой слизи, состоящий из гликопротеинов, монослой эпителиальных клеток, а также лежащую в основе собственную пластинку, в которой находятся иммунные и стромальные клетки. Эпителиальные клетки кишечника, образующие физический барьер, связаны между собой различными белковыми комплексами, которые включают в себя адгезивное соединение (AJ), плотное соединение (TJ) и десмосомы (DMs). Нарушение функции эпителиального барьера увеличивает проницаемость кишечника и позволяет перемещать вредные вещества и патогены из просвета в интерстиций1. Растет число заболеваний, при которых эпителиальный барьер нарушен, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), такие как болезнь Крона (БК), язвенный колит (ЯК) и интерминантный колит (ИЦ). Заболеваемость ВЗК растет во всем мире, а на Западе ее распространенность приближается к 0,5%. Хотя причины ВЗК неясны, чрезмерная иммунная/воспалительная реакция, вызванная стенкой кишечника, непосредственно способствует нарушению эпителиального барьера, ограничивая восстановление гомеостаза кишечного эпителия 2,3,4. Кроме того, пациенты с длительным воспалением толстой кишки подвержены высокому риску развития колоректального рака (КРР)5. Другими патологиями, связанными с нарушением кишечного эпителиального барьера, являются синдром раздраженного кишечника, ожирение, целиакия, нецелиакическая чувствительность к глютену и пищевая аллергия6. По этим причинам существует острая необходимость в разработке экспериментальных подходов, позволяющих анализировать целостность кишечного эпителиального барьера на животных моделях, имитирующих патогенез, происходящий у человека.

Здесь мы оценили желудочно-кишечную пассивную парацеллюлярную и трансцеллюлярную проницаемость, связанную с воспалительным процессом в эпителии толстой кишки, с помощью простой методики. Для исследования трансмурального потока макромолекул мы измерили пассивную диффузию FITC-декстрана (4 кДа) и RITC-декстрана (10 кДа) в мешочках толстой кишки ex vivo. Кроме того, путем введения флуоресцентного декстрана с массой 10 кДа, фиксируемого лизином, в просвет кишечных мешков, мы специально идентифицировали участки с высокой проницаемостью в воспаленной слизистой оболочке. Использование маркеров апоптоза и антител к белкам AJ позволило продемонстрировать, что участки с высокой проницаемостью в воспаленной слизистой оболочке соответствуют специфическим участкам, где происходит апоптоз эпителиальных клеток и нарушаются межклеточные соединения. Этот новый метод может быть использован для оценки целостности эпителия в любой модели, где нарушен кишечный эпителиальный барьер.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом CINVESTAV по уходу и использованию лабораторных животных (CICUAL).

1. Подготовка материалов и реактивов

  1. Предварительно подогрейте раствор Гартмана (130 мМ NaCl, 28 мМ лактата, 4 мМ KCl, 1,5 мМ CaCl2) до 37 °C при барботировании с 95% O2/5% CO2. Поддерживайте физиологический pH (7,4) для раствора.
  2. Для анализа пассивной парацеллюлярной проницаемости готовят рабочий раствор, растворяя в предварительно подогретом растворе Гартмана 1 мг/мл ФИТК-декстрана (4 кДа) и 1 мг/мл РИТК-декстрана (10 кДа).
  3. Приготовьте 4 мкг/мл раствора Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 кДа) в растворе Гартмана. Храните рабочие растворы в конической пробирке объемом 15 мл и беречь от света до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: потребуется 300 μл рабочего раствора на толстую кишку.
  4. Подготовьте хирургический шов, вырезав два среза по 5 см для каждой толстой кишки. Закрутите швы в незамкнутый узел.

2. Вскрытие и подготовка желудочно-кишечного тракта

  1. Откажитесь от твердой пищи в течение 6 часов перед усыплением мышей. Обеспечьте питьевую воду в неограниченном количестве.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, давайте мышам питательные гелевые добавки (очищенная вода, патока, тыква, кукурузный сироп, семена подсолнечника, пшеничный белок, растительное масло, пищевая кислота, гидроколлоиды, электролиты, кукурузная клетчатка, минеральная смесь NIH-31M, витаминная смесь NIH-31M).
  2. Усыплять мышей в камереСО2 с последующим вывихом шейки матки в соответствии с протоколами институциональной этики.
  3. Простерилизуйте брюшную полость и грудную клетку с помощью 70% этанола.
  4. С помощью ножниц сделайте разрез посередине живота и обнажите брюшную полость.
  5. В целях ориентации отделите и рассеките толстую кишку, разрезав в конце тонкой кишки (конечная часть подвздошной кишки) прямо перед слепой кишкой, а затем на анальной краю. С помощью хирургических щипцов аккуратно удалите брыжейку и поместите толстую кишку в раствор Гартмана.
  6. Важно отметить, что для поддержания согласованности между животными выявляйте похожие участки и используйте их для оценки проницаемости. Настоятельно рекомендуется использовать регионы, близкие к слепой кишке.
  7. Используйте инсулиновый шприц, оснащенный тупой пластиковой канюлей, чтобы аккуратно промыть содержимое просвета, присутствующее в толстой кишке. Если стул твердый, осторожно надавите с помощью тупых щипцов. После того, как кал будет удален, промыть 3 раза 400 мкл раствора Гартмана.
  8. Перевяжите проксимальную область (ближайшую к слепой кишке) и поместите предварительно перевязанный шов-петлю в дистальную область толстой кишки. С помощью шприца, оснащенного затупленной пластиковой канюлей, заполните кишечный мешок раствором, содержащим зонд желания. Аккуратно снимите пластиковую канюлю и завяжите петлю в дистальной области.
  9. Поместите кишечный мешок в коническую пробирку объемом 15 мл с 6 мл раствора Гартмана и инкубируйте в течение 1 часа, чтобы оценить пассивный парацеллюлярный поток FITC/RITC-декстрана, или 30 минут, чтобы проанализировать поток Alexa Fluor Fixable-Dextran.
    1. Поддерживайте коническую трубку, содержащую кишечные мешочки, при температуре 37 °C с 5%CO2 и защищайте от света.
  10. Для измерения пассивной проницаемости с помощью FITC/RITC-Dextran. Через 0 и 60 минут возьмите образец объемом 100 мкл из конической трубки и переложите его в планшет на 96 лунок. Добавьте обратно 100 μL свежей среды, чтобы восполнить потерянный объем.
  11. Измерение образцов и стандартов для FITC/RITC на считывателе флуоресцентных пластин (возбуждение/излучение FITC: 495 нм/519 нм; Возбуждение/излучение RITC: 570/595 нм).
  12. Чтобы измерить пассивную проницаемость с помощью Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran, удалите кишечник, разрежьте его близко к хирургическому узлу и разрежьте кишечник, чтобы обнажить просвет для удаления раствора с помощью зонда. Промыть просвет кишечника 2 раза холодным раствором Гартмана.
  13. Поместите ткань в тканевую форму, предварительно заполненную составом для оптимальной температуры резки (O.C.T.). Расположите ткань вертикально или горизонтально в соответствии с стороной, которую нужно рассекать. Храните образцы при температуре -80 °C.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Зафиксировать замороженные срезы размером 20 мкм с 3,7% параформальдегидом (PFA) на 20 мин при комнатной температуре, а затем 3 раза промыть холодным фосфатным буферным раствором (PBS; 37 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2 PO4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вертикальные срезы кишечника имеют тенденцию отрываться, если промывки очень сильные.
  2. Пропитать 0,2% TX-100/PBS в течение 12 минут при комнатной температуре, а затем 3 раза вымыть холодной PBS.
  3. Заблокируйте 0,2% BSA/PBS на 1 час при комнатной температуре.
  4. Разведите первичное антитело в блокирующем растворе и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре. Умыться 3 раза холодной PBS.
  5. Инкубировать в течение 1 ч с вторичными антителами в блокирующем растворе. Умыться 3 раза холодной PBS.
  6. Нанесите монтажное средство на пропилы и запечатайте покровным стеклом. Предметные стекла могут храниться до 3 месяцев при температуре -20 °C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В воспаленной слизистой оболочке поверхностные эрозии или микроэрозии нарушают целостность монослоя эпителиальных клеток и представляют собой участки с высокой проницаемостью 7,8. Чтобы оценить такие возможности, мы проанализировали пассивную проницаемость в воспаленной слизистой оболочке толстой кишки на мышиной модели декстрана с сульфатом натрия колитом. Вкратце, в течение 5 дней мыши C57BL/6J получали 2,5% DSS (w/v, 40-50 кДа), растворенных в питьевой воде. Э...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителиальный гомеостаз, возникающий в результате балансировки пролиферации клеток и эпителиального апоптоза, поддерживает надлежащий и функциональный кишечный барьер. Многие клинические расстройства, такие как ВЗК, сопровождаются или характеризуются изменениями проницаемости кишечника, воспалением слизистой оболочки и нарушением эпителиального гомеостаза1. Взаимосвязь между этими процессами до сих пор вызывает большие споры. Поэтому разработка новых исследователь...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование было частично поддержано грантом SEP-Conacyt (No 179 для NV/PND) и поддержано отраслевым финансированием исследований и образования через грант на фундаментальные науки от Conacyt (No A1-S-20887 для PND). Мы хотим выразить нашу благодарность Норме Трехо, М.В.З. Раулю Кастро Луне, М.К. Леонелю Мартинесу, Фелипе Крусу Мартинесу, Виктору Мануэлю Гарсиа Гомесу и М.В.З. Рикардо Гаксиоле Сентено за их помощь и техническое содействие.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Антитела к активной каспазе-3 (1:1000)Клеточная сигнализация9664Расщепленная каспаза-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  анти-кролик (1:1000)InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 антикрысиный (1:1000)InvitrogenA21209
(Leica TCS SP8x)Детекторы LeicaHyD и лазер белого света
Антитело к E-кадгерину (1:750)SigmaMABT26Крысиное моноклональное антитело Delma-1
Этанол 70%Дженерик
Фиксируемый ДекстранИнвитрогенD22914Декстран, Alexa Fluor, 10 000 МВт, анионный, поправимый
FITC ДексонСигма46944Флуоресцеин изотиоцианат– dextran M. Wt. 4 кДа
Hartmann's SolutionPiSAHT PiSA
Инкубатор (AutoFlow NU-8500)микропланшетов Nuaire
(Tecan Infinite 200 PRO)Tecan
Nunc F96 MicroWell Черно-белая полистирольная пластинаThermoFisher Scientific
ПараформальдегидSigmaP6148
Фаллоидин (1:1000)ИнвитрогенA12380Alexa Fluor 568 Фаллоидин
RITC ДекстранSigmaR8881-100MGРодамин B Изотиоцианат-декстран. M. Wt. 10 кДа
Вторичные антитела (1:10000)Jackson ImmunoResearch LaboratoriesHRP-конъюгированные вторичные антитела
Шовные нитиДженерикПлетеный шелк и плетеный полиэстер Предпочтение отдается хирургическим швам.
ЗО-1 (1:1000)Инвитроген40-2200Rb анти-ЗО-1
Конфокальный микроскоп Считыватель

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human Intestinal Barrier Function in Health and Disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Gassler, N., et al. Inflammatory bowel disease is associated with changes of enterocytic junctions. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (1), 216-228 (2001).
  3. Negroni, A., Cucchiara, S., Stronati, L. Apoptosis, Necrosis, and Necroptosis in the Gut and Intestinal Homeostasis. Mediators of Inflammation. 2015, 250762(2015).
  4. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  5. Choi, C. -H. R., Bakir, I. A., Hart, A. L., Graham, T. A. Clonal evolution of colorectal cancer in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (4), 218-229 (2017).
  6. González-González, M., Díaz-Zepeda, C., Eyzaguirre-Velásquez, J., González-Arancibia, C., Bravo, J. A., Julio-Pieper, M. Investigating Gut Permeability in Animal Models of Disease. Frontiers in Physiology. 9, (2019).
  7. Poulsen, S. S., Pedersen, N. T., Jarnum, S. "Microerosions" in rectal biopsies in Crohn's disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 19 (5), 607-612 (1984).
  8. Neumann, H., et al. Assessment of Crohn's disease activity by confocal laser endomicroscopy. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (12), 2261-2269 (2012).
  9. Laroui, H., et al. Dextran Sodium Sulfate (DSS) Induces Colitis in Mice by Forming Nano-Lipocomplexes with Medium-Chain-Length Fatty Acids in the Colon. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
  10. John, L. J., Fromm, M., Schulzke, J. -D. Epithelial barriers in intestinal inflammation. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1255-1270 (2011).
  11. Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145 (2), 407-415 (2013).
  12. Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53250(2016).
  13. Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57038(2018).
  14. Stamatovic, S. M., Johnson, A. M., Sladojevic, N., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Endocytosis of tight junction proteins and the regulation of degradation and recycling. Annals of the New York Academy of Sciences. 1397 (1), 54-65 (2017).
  15. Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  16. Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19(2018).
  17. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial GapsColonic MucosaImmunofluorescence StainingEpithelial BarrierMicro ErosionsIntestinal PermeabilityCell SheddingApoptotic FociFluorescent DyeBarrier Function
Video Coming Soon

Related Articles