Оценка и количественная оценка микроэпителиальных промежутков в слизистой оболочке толстой кишки с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания

Summary

В этой статье мы описываем новый метод визуализации конкретного места, где трансцеллюлярная и парацеллюлярная проницаемость усиливается в воспаленной слизистой оболочке толстой кишки. В этом анализе мы применяем флуоресцентный краситель с массой 10 кДа, конъюгированный с декстраном, фиксируемым лизином, для визуализации областей с высокой проницаемостью (HPR) в слизистой оболочке толстой кишки.

Abstract

Эпителиальные клетки, выстилающие слизистую оболочку кишечника, создают физический барьер, отделяющий содержимое люминала от интерстиция. Нарушение эпителиального барьера связано с развитием различных патологий, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). В воспаленной слизистой оболочке поверхностные эрозии или микроэрозии, повреждающие монослои эпителия, соответствуют участкам высокой проницаемости. В образовании микроэрозий участвует несколько механизмов, включая выделение клеток и апоптоз. Эти микроэрозии часто представляют собой микроскопические эпителиальные промежутки, случайно распределенные в толстой кишке. Визуализация и количественная оценка этих эпителиальных промежутков стали важным инструментом для исследования барьерной функции кишечного эпителия. В этой статье мы описываем новый метод визуализации конкретного места, где трансцеллюлярная и парацеллюлярная проницаемость усиливается в воспаленной слизистой оболочке толстой кишки. В этом анализе мы применяем флуоресцентный краситель с массой 10 кДа, конъюгированный с декстраном, фиксируемым лизином, для визуализации областей с высокой проницаемостью (HPR) в слизистой оболочке толстой кишки. Дополнительное использование маркеров клеточной смерти показало, что HPR охватывает апоптотические очаги, где происходит экструзия/отслаивание эпителия. Описанный здесь протокол обеспечивает простой, но эффективный подход к визуализации и количественной оценке микроэрозий в кишечнике, что является очень полезным инструментом в моделях заболеваний, при которых кишечный эпителиальный барьер нарушен.

Introduction

Слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) создает физический барьер, который разделяет внеклеточную среду и внутреннюю среду хозяина и участвует в усвоении питательных веществ, воды и электролитов. Кишечный барьер включает в себя слой слизи, состоящий из гликопротеинов, монослой эпителиальных клеток, а также лежащую в основе собственную пластинку, в которой находятся иммунные и стромальные клетки. Эпителиальные клетки кишечника, образующие физический барьер, связаны между собой различными белковыми комплексами, которые включают в себя адгезивное соединение (AJ), плотное соединение (TJ) и десмосомы (DMs). Нарушение функции эп....

Protocol

Все процедуры были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом CINVESTAV по уходу и использованию лабораторных животных (CICUAL).

1. Подготовка материалов и реактивов

1. Предварительно подогрейте раствор Гартмана (130 мМ NaCl, 28 мМ лактата, 4 мМ KCl, 1,5 мМ CaCl₂) до 37 °C при барботировании с 95% O₂/5% CO₂. Поддерживайте физиологический pH (7,4) для раствора.
2. Для анализа пассивной парацеллюлярной проницаемости готовят рабочий раствор, растворяя в предварительно подогретом растворе Гартмана 1 мг/мл ФИТК-декстрана (4 кДа) и 1 мг/мл РИТК-декстрана (1....

Results

В воспаленной слизистой оболочке поверхностные эрозии или микроэрозии нарушают целостность монослоя эпителиальных клеток и представляют собой участки с высокой проницаемостью ^7,8. Чтобы оценить такие возможности, мы проанализировали пассивную проницаемость в воспаленной слизистой оболочке толстой кишки на мышиной модели декстрана с сульфатом натрия колитом. Вкратце, в течение 5 дней мыши C57BL/6J получали 2,5% DSS (w/v, 40-50 кДа), растворенных в питьевой воде. Э.......

Discussion

Эпителиальный гомеостаз, возникающий в результате балансировки пролиферации клеток и эпителиального апоптоза, поддерживает надлежащий и функциональный кишечный барьер. Многие клинические расстройства, такие как ВЗК, сопровождаются или характеризуются изменениями проницаемости кишечника, воспалением слизистой оболочки и нарушением эпителиального гомеостаза¹. Взаимосвязь между этими процессами до сих пор вызывает большие споры. Поэтому разработка новых исследователь.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Антитела к активной каспазе-3 (1:1000)	Клеточная сигнализация	9664	Расщепленная каспаза-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  анти-кролик (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 антикрысиный (1:1000)	Invitrogen	A21209
(Leica TCS SP8x)	Детекторы Leica		HyD и лазер белого света
Антитело к E-кадгерину (1:750)	Sigma	MABT26	Крысиное моноклональное антитело Delma-1
Этанол 70%	Дженерик
Фиксируемый Декстран	Инвитроген	D22914	Декстран, Alexa Fluor, 10 000 МВт, анионный, поправимый
FITC Дексон	Сигма	46944	Флуоресцеин изотиоцианат– dextran M. Wt. 4 кДа
Hartmann's Solution	PiSA	HT PiSA
Инкубатор (AutoFlow NU-8500)	микропланшетов Nuaire
(Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Черно-белая полистирольная пластина	ThermoFisher Scientific
Параформальдегид	Sigma	P6148
Фаллоидин (1:1000)	Инвитроген	A12380	Alexa Fluor 568 Фаллоидин
RITC Декстран	Sigma	R8881-100MG	Родамин B Изотиоцианат-декстран. M. Wt. 10 кДа
Вторичные антитела (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP-конъюгированные вторичные антитела
Шовные нити	Дженерик		Плетеный шелк и плетеный полиэстер Предпочтение отдается хирургическим швам.
ЗО-1 (1:1000)	Инвитроген	40-2200	Rb анти-ЗО-1