Генерация и расширение кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента

Shiqiao Ye; Xiaoping Wan; Juan Su; Akshar Patel; Blake Justis; Isabelle Deschênes; Ming-Tao Zhao

doi:10.3791/62206

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация и расширение кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента

3.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62206

⸱

12 февраля 2021 г.

Shiqiao Ye¹^,² , Xiaoping Wan³ , Juan Su¹^,² , Akshar Patel¹^,²^,⁴ , Blake Justis¹^,²^,⁵ , Isabelle Deschênes³ , Ming-Tao Zhao¹^,²^,⁵^,⁶

¹Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, ²The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, ³Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, ⁴Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, ⁵MCDB Graduate Program, The Ohio State University, ⁶Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для надежной генерации и расширения кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента.

Аннотация

Получение специфических для пациента кардиомиоцитов из одного забора крови привлекло огромный интерес к прецизионной медицине сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечная дифференцировка из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) модулируется определенными сигнальными путями, которые необходимы для эмбрионального развития сердца. Разработаны многочисленные методы сердечной дифференцировки на 2-D и 3-D платформах с различной эффективностью и выходом кардиомиоцитов. Это озадачило исследователей за пределами поля, поскольку разнообразие этих методов может быть трудно проследить. Здесь мы представляем комплексный протокол, который разрабатывает надежную генерацию и расширение специфических для пациента кардиомиоцитов из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs). Сначала мы опишем высокоэффективный протокол перепрограммирования iPSC из образца крови пациента с использованием неинтегрированных векторов вируса Сендай. Затем мы подробно описываем метод дифференцировки монослоя с небольшими молекулами, который может надежно производить бьющиеся кардиомиоциты из большинства линий iPSC человека. Кроме того, масштабируемый протокол расширения кардиомиоцитов вводится с использованием небольшой молекулы (CHIR99021), которая может быстро расширять кардиомиоциты, полученные от пациента, для промышленного и клинического применения. В конце изображены подробные протоколы молекулярной идентификации и электрофизиологической характеристики этих iPSC-CM. Мы ожидаем, что этот протокол будет прагматичным для новичков с ограниченными знаниями в области сердечно-сосудистого развития и биологии стволовых клеток.

Введение

Открытие индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток произвело революцию в современной сердечно-сосудистой^{медицине}^1,^2. Человеческие ИПСК способны самообновляться и генерировать все типы клеток в сердце, включая кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и сердечные фибробласты. Кардиомиоциты пациента, полученные из iPSC (iPSC-CMs), могут служить неопределенными ресурсами для моделирования генетически наследуемых сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и тестирования сердечной безопасности для новых лекарств^3. В частности, пациенты iPSC-CMs хорошо подготовлены....