Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация и расширение кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента

4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62206

⸱

12 февраля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для надежной генерации и расширения кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента.

Аннотация

Получение специфических для пациента кардиомиоцитов из одного забора крови привлекло огромный интерес к прецизионной медицине сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечная дифференцировка из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) модулируется определенными сигнальными путями, которые необходимы для эмбрионального развития сердца. Разработаны многочисленные методы сердечной дифференцировки на 2-D и 3-D платформах с различной эффективностью и выходом кардиомиоцитов. Это озадачило исследователей за пределами поля, поскольку разнообразие этих методов может быть трудно проследить. Здесь мы представляем комплексный протокол, который разрабатывает надежную генерацию и расширение специфических для пациента кардиомиоцитов из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs). Сначала мы опишем высокоэффективный протокол перепрограммирования iPSC из образца крови пациента с использованием неинтегрированных векторов вируса Сендай. Затем мы подробно описываем метод дифференцировки монослоя с небольшими молекулами, который может надежно производить бьющиеся кардиомиоциты из большинства линий iPSC человека. Кроме того, масштабируемый протокол расширения кардиомиоцитов вводится с использованием небольшой молекулы (CHIR99021), которая может быстро расширять кардиомиоциты, полученные от пациента, для промышленного и клинического применения. В конце изображены подробные протоколы молекулярной идентификации и электрофизиологической характеристики этих iPSC-CM. Мы ожидаем, что этот протокол будет прагматичным для новичков с ограниченными знаниями в области сердечно-сосудистого развития и биологии стволовых клеток.

Введение

Открытие индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток произвело революцию в современной сердечно-сосудистоймедицине1,2. Человеческие ИПСК способны самообновляться и генерировать все типы клеток в сердце, включая кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и сердечные фибробласты. Кардиомиоциты пациента, полученные из iPSC (iPSC-CMs), могут служить неопределенными ресурсами для моделирования генетически наследуемых сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и тестирования сердечной безопасности для новых лекарств3. В частности, пациенты iPSC-CMs хорошо подготовлены к исследованию генетической и молекулярной этиологии ССЗ, которые получены из дефектов кардиомиоцитов, таких как синдром удлиненного интервала QT4 и дилатационная кардиомиопатия (DCM)5. В сочетании с CRISPR/Cas9-опосредованным редактированием генома, iPSC-CM пациентов открыли беспрецедентный путь к пониманию сложной генетической основы ССЗ, включая врожденные пороки сердца (ИБС)6,7,8. Человеческие iPSC-CM также продемонстрировали потенциал служить аутологичными клеточными источниками для пополнения поврежденного миокарда во время сердечного приступа9. В последние годы первостепенное значение приобрела генерация высококачественных человеческих iPSC-CM с определенными подтипами (предсердные, желудочковые и узловые) для регенерации сердца и тестирования лекарств10.

Сердечная дифференциация от человеческих ИПСК значительно продвинулась за последнее десятилетие. Методы дифференцировки перешли от спонтанной дифференцировки на основе эмбриоидного тела (EB) к химически определенной и направленной сердечной дифференцировке11. Ключевые сигнальные молекулы, необходимые для эмбрионального развития сердца, такие как Wnt, BMP, Nodal и FGF, манипулируются для усиления дифференцировки кардиомиоцитов от ИПСК человека10,12. Значительные достижения включают последовательную модуляцию передачи сигналов Wnt (активация с последующим ингибированием) для надежной генерации кардиомиоцитов из человеческих ИПСК13,14. Химически определенные рецепты сердечной дифференцировки были изучены для облегчения крупномасштабного производства бьющихся кардиомиоцитов15,16,которые могут быть модернизированы до промышленного и клинического уровня производства. Кроме того, устойчивое расширение ранних человеческих iPSC-CM достигается воздействием конститутивной активации Wnt с использованием небольшого химического вещества (CHIR99021)17. В последнее время специфические для подтипа кардиомиоциты генерируются путем манипуляций с сигнальными путями ретиноевой кислоты (РА) и Wnt в определенных окнах дифференцировки во время приверженности линии кардиомиоцитов от человеческих ИПСК18,19,20,21,22.

В этом протоколе мы подробно описываем рабочую процедуру для надежной генерации и пролиферации человеческих КМ, происходящих из мононуклеарных клеток периферической крови пациента. Мы представляем протоколы для 1) перепрограммирования человеческих PBMC в iPSCs, 2) надежной генерации бьющихся кардиомиоцитов из человеческих IPSCs, 3) быстрого расширения ранних iPSC-CM, 4) молекулярной характеристики человеческих iPSC-CM и 5) электрофизиологического измерения человеческих iPSC-CM на уровне одноклеточных клеток с помощью зажима пластыря. Этот протокол охватывает подробные экспериментальные процедуры по преобразованию клеток крови пациента в биение кардиомиоцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Экспериментальные протоколы и информированное согласие для людей были одобрены Институциональным наблюдательным советом (IRB) в Национальной детской больнице.

1. Приготовление сред клеточных культур, растворов и реагентов

  1. Подготовка носителя PBMC
    1. Смешайте 20 мл базальной питательной среды PBMC (1x) и 0,52 мл добавки. Добавьте по 20 мкл SCF и FLT3 (концентрация запаса: 100 мкг/мл), по 4 мкл IL3, IL6 и EPO (концентрация запаса: 100 мкг/мл) и 200 мкл L-глутаминовой альтернативы (100x). Тщательно перемешайте. Фильтруйте в стерильной вытяжке с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм. Назовите это как Complete Blood Media.
    2. Смешайте 20 мл базальной питательной среды PBMC (1x) и 0,52 мл добавки. Добавьте 200 мкл альтернативного L-глутамина (100x). Тщательно перемешайте. Фильтрация с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм. Назовите это как Supplement Blood Media.
  2. Подготовка полного носителя E8
    1. Смешайте 500 мл базальной среды E8 и 10 мл добавки E8 (размороженной в течение ночи при 4 °C), чтобы получить полную среду E8. Уравновешивайте до комнатной температуры (RT) перед использованием.
  3. Подготовка носителей для передачи iPSC
    1. Добавьте 40 мкл ингибитора породы Y-27632 (разбавление 1:5000, концентрация запаса: 10 мМ) к 200 мл полной среды E8. Тщательно перемешайте. Уравновешивайте до RT перед использованием.
  4. Подготовка сред дифференцировки кардиомиоцитов
    1. Среда I: Смешайте 500 мл RPMI1640 с 10 мл B27 минус добавка инсулина (50x).
    2. Среда II: Добавьте соответствующий объем запаса CHIR99021 (ингибитор GSK3) в среду I (конечная концентрация CHIR99021 6 мкМ). Тщательно перемешать.
    3. Среда III: Добавьте соответствующий объем запаса IWR-1 (ингибитор Wnt) в среду I (конечная концентрация IWR-1 5 мкМ). Тщательно перемешать.
    4. Носитель IV: Смешайте 500 мл RPMI1640 с 10 мл добавки B27 (50x). Тщательно перемешать.
    5. Среда V: Смешайте 500 мл RPMI1640 (без глюкозы) с 10 мл добавки B27 (50x). Тщательно перемешать.
    6. Носитель VI: Добавьте соответствующий объем запаса CHIR99021 в Media IV (конечная концентрация CHIR99021 2 мкМ). Тщательно перемешать.
  5. Подготовка носителей для передачи iPSC-CM
    1. Добавьте 10 мл нокаутирующей сыворотки (KSR) к 90 мл Media IV (конечная концентрация KSR: 10%). Хорошо перемешать.
  6. Подготовка морозильной среды iPSC-CM
    1. Добавьте 1 мл ДМСО к 9 мл KSR (конечные концентрации: 10% DMSO/90% KSR) и хорошо перемешайте.
  7. Подготовка пластин со средним покрытием фундаментной мембранной матрицы
    1. Оттаивать матричную среду базальной мембраны при 4 °C в течение ночи и аликвоту в трубках по 1,5 мл. Добавьте 1 мл этой среды к 250 мл среды DMEM/F12 (разбавление 1:250) и тщательно перемешайте их. Применяют 2 мл разбавленного раствора на лунку в 6-луночной пластине и инкубируют в 5%СО2 при 37 °С в течение 30 мин перед применением.

2. iPSC перепрограммирование PBMC

  1. Отделите PBMC от образцов крови.
    1. Собрать образцы крови пациента (~5 мл) и перенести в трубки для разделения клеток крови (см. Таблицу материалов). Смешайте путем инвертирования 10x.
    2. Центрифуга при 1 500 х г в течение 30 мин при комнатной температуре.
    3. Осторожно выньте пробирки и распылите 70% этанола. Под капотом биобезопасности снимите колпачки, не нарушая мононуклеарные клетки (слой баффи). НБМК будут находиться в беловатом слое прямо под слоем плазмы(рисунок 1А). Соберите весь слой баффи с помощью пипетки 1000 мкл и переложите в коническую трубку объемом 15 мл.
    4. Подсчитайте номер ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек. Раскрутите тюбик при 300 х г в течение 25 мин при RT.
    5. Выбросьте супернатант. Промывайте 10 мл DPBS (Ca2+/ Mg2 + свободно).
    6. Раскрутите тюбик при 300 х г в течение 15 мин при RT.
    7. Удалите супернатант. Повторное суспендирование клеточных гранул в 1 мл морозильной среды (KSR плюс 10% DMSO). Отрегулируйте плотность клеток, чтобы сделать 1 x 106 клеток на флакон.
    8. Поместите криовиалы PBMC в контейнер для замораживания клеток и храните при температуре -80 °C в течение ночи. Переложить в резервуар для жидкого азота для длительного хранения на следующий день.
  2. Перепрограммирование iPSC.
    1. Добавьте 3 мл добавки среды крови в коническую пробирку объемом 15 мл. Разморозьте НБМК на водяной бане при температуре 37 °C и перенесите их в коническую трубку. Отжим при 300 х г в течение 7 мин при RT.
    2. Выбросьте супернатант. Повторное суспендирование НБМК с полной средой крови. Засейте их в две лунки из 24 лунок тканевых культуральных пластин (без матрицы базальной мембраны).
    3. Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение ночи. На следующий день аккуратно удалить половину старой среды (0,5 мл) и добавить 0,5 мл свежей полной среды крови.
    4. Меняйте медиа через день, обновляя половину старых медиа.
    5. Через неделю агрессивно промыть лунку 1 мл добавки к среде крови и перенести клетки в центрифужную трубку объемом 15 мл.
    6. Подсчитайте номер ячейки. Взять 2 х 105 ячеек и центрифугу при 300 х г в течение 7 мин.
    7. Выбросьте супернатант. Повторное суспендирование клеток с 300 мкл полной среды крови. Выполните трансфекцию, добавив соответствующий объем векторов перепрограммирования вируса Сендай в соответствии с инструкциями производителя. Переложите их в одну скважину из 24-луночной пластины (без матрицы базальной мембраны). Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение ночи.
    8. На следующий день вращайтесь при 300 х г в течение 7 мин. Удаляют супернатант и повторно суспендируют в 2 мл полной среды крови. Переложить в одну лунку 6 скважин пластин, предварительно покрытую базальной мембранной матрицей. Это День 1 (D1).
    9. Не прикасайтесь к тарелке на следующий день.
    10. На D3 удалите 1 мл старого носителя. Добавьте 1 мл добавки среды крови.
    11. Повторите шаг 2.2.10 на D5.
    12. На D7 удалите 1 мл старого носителя. Добавьте 1 мл полного носителя E8.
    13. На D8 повторите шаг 2.2.12.
    14. На D9 удалите старый носитель. Добавьте 2 мл полного носителя E8. Ожидается, что полностью перепрограммированные клетки прикрепятся и начнут образовывать колонии.
    15. Обновляйте 2 мл полного носителя E8 каждый день.
    16. Примерно через 2 недели после трансдукции вируса Сендай появятся большие колонии iPSC и будут готовы к сбору.
    17. Вырежьте колонии iPSC под стереомикроскопом в капоте и переведите отдельные колонии в 24-луночную пластину с покрытием базальной мембраны с 24-луночным покрытием, предварительно загруженную 0,5 мл iPSC пассирующей среды.
    18. Обновляйте 0,5 мл полной среды E8 каждый день, пока колонии iPSC не вырастут достаточно большими для перехода в новую 6-луночную пластину с матричным покрытием с базальной мембраной.

3. Обслуживание и прохождение iPSC человеком

  1. Когда человеческие IPSC достигают слияния более 90%, удалите старые носители. Промыть 3 мл DPBS один раз.
  2. Добавьте 1 мл 0,5 мМ ЭДТА в раствор DPBS. Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение 5-8 мин.
  3. Удалить ЭДТА путем аспирации. Добавьте 1 мл носителя iPSC. Вручную вытесняйте iPSC.
  4. Возьмите 600-900 мкл одноклеточной суспензии и повторно нанесите их на 6-луночную пластину с покрытием основы мембраны с матричным покрытием (разбавление: от 1:6 до 1:10). Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение ночи.
  5. Обновляйте 2 мл полного носителя E8 каждый день. Культуры iPSC обычно достигают слияния через 3-4 дня.

4. Химически определенная дифференцировка кардиомиоцитов

  1. Культивируйте человеческие ИПСК в полных средах Е8 до 95% слива (3-4 дня).
  2. Удалите старый носитель. Добавьте 2 мл дифференцировки CM Media II (6 мкМ CHIR в RPMI1640 плюс B27 минус добавка инсулина) в каждую лунку 6-луночной пластины. Это D0. Не прикасайтесь к D1.
  3. На D2 заменить на 2 мл дифференцирующей среды CM I (RPMI1640 плюс B27 минус добавка инсулина).
  4. На D3 заменить 2 мл дифференцировки CM Media III (5 мкМ IWR-1 в RPMI1640 плюс B27 минус добавка инсулина). Не прикасайтесь к D4.
  5. На D5 заменить на 2 мл см дифференциации среды I.
  6. На D7 замените на 2 мл дифференцировки CM Media IV (RPMI1640 плюс добавка B27). После этого обновляйте средства массовой информации через день.
  7. На D11 при сокращении клеток заменяют 2 мл дифференцировки СМ средой V (без глюкозы).
  8. На D13 заменить на 2 мл дифференцированного НОСИТЕЛЯ СМ V.
  9. На D15 заменить на 2 мл дифференцирующей среды СМ IV.
  10. На D17-D21 заменить на 2 мл СМ дифференцировки Среды IV через день.

5. Прохождение человека iPSC-CM

  1. Удалите старые носители и промойте ячейки 3 мл DPBS один раз.
  2. Нанесите 1 мл раствора диссоциации КМ (см. Таблицу материалов)на каждую скважину 6-луночной пластины. Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение 5-8 мин.
  3. Механически диссоциируют iPSC-CM на одиночные ячейки путем энергичного пипетирования.
  4. Переведите клетки в коническую трубку объемом 15 мл. Добавьте 2 мл пропускающей среды CM (10% KSR в добавке RMPI1640 плюс B27) для нейтрализации раствора диссоциации КМ.
  5. Отжим при 300 х г в течение 5 мин при RT.
  6. Выбросьте супернатант. Повторное суспендирование ячеек с требуемым объемом среды пропускания СМ. Посейте их в тарелку/блюдо, покрытое базальной мембраной. Человеческие iPSC-CM возобновляют избиение через 1-3 дня после прохождения.

6. Расширение человеческих iPSC-CM

  1. Промыть D10-12 взбивая iPSC-CM 3 мл DPBS для каждой скважины 6-луночной пластины один раз. Добавьте 1 мл раствора для диссоциации КМ (Шаг 5.2). Инкубировать в 5% CO2 при 37 °C в течение 7-10 мин.
  2. Механически диссоциируют iPSC-CM на одиночные ячейки путем энергичного пипетирования.
  3. Переведите клетки в коническую трубку объемом 15 мл. Добавьте 2 мл пропускающих сред CM для нейтрализации раствора диссоциации CM.
  4. Отжим при 300 х г в течение 5 мин при RT.
  5. Выбросьте супернатант. Повторное суспендирование ячеек с соответствующим объемом среды пропускания СМ. Пипетка вверх и вниз, чтобы сделать одноклеточную суспензию. Посейте один миллион iPSC-CM в блюдо с базальной мембраной, покрытое матрицей 10 см.
  6. На следующий день удалите старые носители. Добавьте 10 мл среды пролиферации кардиомиоцитов (Среда VI: 2 мкМ CHIR99021). Меняйте медиа через день.
  7. Когда iPSC-CM становятся сливающимися через 7-9 дней культуры, повторите шаг прохождения для дальнейшего расширения iPSC-CM.

7. Иммунофлуоресценция

  1. Перед иммунофлуоресцентным окрашиванием семена iPSC-CMs на покрытые базальной мембраной покрытые матрицей покровные листы, которые помещают в пластину из 24 лунок (плотность посева: 0,5-1 х 106 клеток/мл). Поддерживайте iPSC-CM в культуре не менее 4 дней.
  2. Промывайте ячейки, используя 1 мл DPBS один раз.
  3. Добавьте 0,5 мл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируйте в течение 15 мин при RT.
  4. Мойте ячейки, используя 1 мл DPBS. Повторите один раз.
  5. Добавьте 0,5 мл 0,1% Тритона Х-100 и инкубируйте в течение 20 мин при RT.
  6. Дважды промыть 1 мл DPBS.
  7. Добавьте 0,5 мл 0,2% BSA в DPBS (блокирующий раствор). Инкубировать на РТ в течение 1 ч.
  8. Добавить 200 мкл первичного антитела, разведенного блокирующим раствором (разведение: 1:400-1:1000). Инкубировать при 4 °C в течение ночи.
  9. Промыть клетки 0,5 мл блокирующего раствора в течение 3 мин с встряхиванием. Повторите дважды.
  10. Добавляют 200 мкл вторичного антитела, разведенного в блокирующем растворе. Инкубировать на РТ в течение 1 ч.
  11. Промыть клетки три раза 0,5 мл DPBS, каждый в течение 3 мин с встряхиванием.
  12. Противодействовать ядрам с помощью DAPI (разведение 1:2000) и инкубировать в течение 5 мин при RT.
  13. Промыть клетки три раза 0,5 мл DPBS.
  14. Установите ячейки на крышках на предметное стекло микроскопа с помощью монтажного носителя объемом 5 мкл. Хранить при температуре 4 °C и защищать от света.

8. Пробоподготовка для проточной цитометрии

  1. Мойте человеческие iPSC-CM с 3 мл DPBS один раз.
  2. Добавляют 1 мл раствора для диссоциации СМ и инкубируют в 5%СО2 при 37 °С в течение 7-10 мин.
  3. Вытесняйте клетки с помощью пипетки объемом 1000 мкл. Перенесите суспензию ячейки на круглую трубку FACS через крышку сетчатого фильтра. Трубка FACS предварительно заполняется 1 мл проходной среды iPSC-CM (10% KSR) для нейтрализации активности фермента.
  4. Открутите при 300 х г в течение 5 мин.
  5. Удалите супернатант, не нарушая гранулы клеток. Добавьте 250 мкл раствора для фиксации/пермеабилизации (см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение 20 мин при 4 °C.
  6. Добавьте 1 мл буфера Perm/Wash. Вихрь ненадолго и вращается при 300 х г в течение 4 мин.
  7. Выбросьте супернатант. Добавьте 100 мкл разбавленных первичных антител (1:200-1:500) в 1 буфер Perm/Wash. Вихрь ненадолго и насиживайте ночью при 4 °C.
  8. Промывайте ячейки, добавляя 1 мл буфера Perm/Wash. Вихрь ненадолго и вращается при 300 х г в течение 4 мин.
  9. Выбросьте супернатант. Добавьте 100 мкл разбавленных вторичных антител (1:500-1:1000). Вихрь кратковременно и насиживается при RT в течение 1 ч. Защищают от света, если вторичные антитела конъюгированы со светочувствительной флуоресценцией.
  10. Промывайте ячейки, добавляя 1 мл пермского/промывочного буфера. Вихрь ненадолго и вращается при 300 г в течение 4 мин.
  11. Выбросьте супернатант. Повторное суспендирование клеток с 400 мкл буфера окрашивания FACS (PBS/4% FBS). Хранить при температуре 4 °C до загрузки в прибор FACS.

9. qPCR в реальном времени

  1. Удалите старые носители в человеческом языке iPSC-CM. Добавьте 500-700 мкл лизисного буфера к лизатным клеткам. Инкубировать в течение 3 мин в лизате клеток RT. Scape и переложить в 1,5 мл без РНКазы. Приступайте к полной экстракции РНК немедленно или храните при -80 °C.
  2. Изолируйте общую РНК с помощью набора для экстракции РНК в соответствии с инструкцией производителя.
  3. Измерьте концентрацию РНК и оцените качество общей РНК с помощью спектрофотометра.
  4. Выполняйте реакцию обратной транскрипции с помощью набора синтеза кДНК. Общий объем реакции RT составляет 20 мкл, включая 4 мкл реакционной смеси (5x), 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкг общей РНК и воды без РНКазы.
  5. Инкубировать полную реакционную смесь РТ в термоциклере по следующему протоколу: 25 °C в течение 5 мин; 46 °C в течение 20 мин; 95 °C в течение 1 мин; удерживать при 4 °C.
  6. Разбавить кДНК на 1:10, используя воду без нуклеазы. Настройте реакцию qPCR в реальном времени путем смешивания 1 мкл шаблона кДНК, 1 мкл праймеров/зондов, 10 мкл мастер-смеси qPCR и 8 мкл воды без нуклеазы.
  7. Запуск в системе ПЦР в режиме реального времени. Протокол циклирования: 50 °C 2 мин (удержание), 95 °C 10 мин (удержание), 95 °C 15 сек, 60 °C 1 мин, повторите в течение 40 циклов.
  8. Соберите значения CT для каждого гена в каждом образце. Относительное содержание мРНК рассчитывается путем вычитания значения CT гена-мишени из значения CT гена домашнего хозяйства. Относительная экспрессия генов анализируется методом2 -ΔΔCT.

10. Запись зажима для целых клеток

  1. Диссоциация iPSC-CM на отдельные клетки с помощью раствора диссоциации CM, как описано ранее.
  2. Семенные клетки при низкой плотности на покрытых базальной мембраной покрытой матрицей покровных пластинках. Культивируйте их в течение 3-4 дней в Media IV.
  3. Вытягивайте пипетки (сопротивление 0,9-1,5 МОм) из боросиликатных стеклянных капилляров с помощью горизонтального микроэлектродного съемника.
  4. Инкубировать клетки в растворе Тирода (рН=7,35).
  5. Наполните пипетки раствором электрода (pH=7,3), состоящим из следующих химических веществ: 120 мМ аспарагиновой кислоты, 20 мМ KCl, 2 мМ MgCl2,5 мМ HEPES, 10 мМ NaCl, 5 мМ EGTA, 0,3 мМ Na-GTP, 14 мМ фосфокреатина, 4 мМ K-АТФ и 2 мМ креатинфосфокиназы.
  6. Поместите ячейки в режим текущего зажима с помощью диастолического порога 1,5-2 мс тока импульса тока при 1 Гц.
  7. Записывайте потенциалы действия (точки доступа) с помощью микроэлектродного усилителя и программной платы сбора данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Перепрограммирование iPSC человека из PBMCs
После предварительной культивации с полной средой крови в течение 7 дней НБМК становятся большими с видимыми ядрами и цитоплазмой(рисунок 1B),что указывает на то, что они готовы к трансфекции вируса. После трансфекции с помощью факторов перепрограммирования вируса Сендай, PBMCs будут подвергаться эпигенетическому процессу перепрограммирования в течение еще одной недели. Как правило, мы получаем 3...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Во время перепрограммирования iPSC крайне важно культивировать PBMC в течение 1 недели, пока они не будут увеличены прозрачными ядрами и цитоплазмой. Поскольку PBMC не размножаются, соответствующий номер клеток для вирусной трансдукции важен для успешного перепрограммирования iPSC. Количество клеток PBMCs, множественность инфекции (MOI) и титр вируса должны быть рассмотрены и скорректированы для достижения оптимальных результатов трансдукции. Для сердечной дифференцировки начальная плотность посева имеет решающее значени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано премией Американской кардиологической ассоциации (AHA) за развитие карьеры 18CDA34110293 (M-T.Z.), наградами AVIF и SVRF (M-T.Z.), грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH / NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 и R01HL096962 (I.D.). Доктор Мин-Тао Чжао также получил поддержку стартовых фондов из Исследовательского института Эбигейл Векснер при Национальной детской больнице.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ABI 7300 Система быстрой ПЦР в реальном времениThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Усилитель микроэлектродовМолекулярные устройства Усилительмикроэлектродов
Добавка B27 ThermoFisher Scientific17504044
B27 добавка минус инсулинThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Набор для фиксации/пермеабилизацииBD Biosciences554714Раствор для фиксации/пермабилизации, буфер для пермии/промывки
BD Vacutainer CPT пробиркаBD Biosciences362753Трубка для разделения клеток крови
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Набор для перепрограммированиявирусов Thermo Fisher ScientificA16517Sendai набор для перепрограммирования вирусов
Digidata 1200BAxon InstrumentsПлата сбора данных
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050Набор для экстракции РНК
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8 mediumThermo Fisher ScientificA1517001E8 среда для iPSC культуры
GlutaMAX добавкаThermo Fisher Scientific35050061L-глютаминовая альтернатива
Сниженный фактор роста MatrigelCorning356231Матрица базальной мембраны
iScript cDNA Snythesis KitBio-Rad1708891синтез кДНК
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Молекулярные устройстваПрограммное обеспечение для сбора и анализа электрофизиологических данных
Рекомбинантный человек EPOThermo Fisher ScientificPHC9631
Рекомбинантный человек FLT3Thermo Fisher ScientificPHC9414
Рекомбинантный человек IL3Peprotech200-03
Рекомбинантный человек IL6Thermo Fisher Scientific
Рекомбинантный человеческий SCFPeprotech300-07
RPMI 1640 среднийThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 средний, без глюкозыThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificS36936Монтажный материал
StemPro-34 SFMThermo Питательные среды Fisher Scientific10639011PBMC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444964мастер-смесь для количественной ПЦР
TrypLE Select Enzyme 10x, без фенола красногоThermo Fisher ScientificA1217703CM раствор для диссоциации
UltraPure 0,5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020раствор для диссоциации iPSC
Y-27632 2HClSelleck ChemicalsS1049
PHC0065

Ссылки

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150(2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Получение кардиомиоцитоврепрограммирование иПКСрепрограммирование с помощью вируса Сендайкардиальная дифференцировкамонослойная дифференцировкаэкспансия кардиомиоцитовметод патч-клампэкспрессия тропонина Тактивация Wnt
Генерация и расширение кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.