Здесь мы представляем простой в использовании анализ кокультуры для анализа миграции глиобластомы (GBM) на паттерновых нейронах. Мы разработали макрос в программном обеспечении FiJi для легкой количественной оценки миграции клеток GBM на нейронах и заметили, что нейроны модифицируют инвазивную емкость клеток GBM.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Кокультура стволовых клеток глиобластомы на узорчатых нейронах для изучения миграции и клеточных взаимодействий
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Глиобластомы (GBM), злокачественные глиомы IV степени, являются одним из самых смертоносных видов рака человека из-за их агрессивных характеристик. Несмотря на значительные успехи в генетике этих опухолей, то, как клетки GBM вторгаются в здоровую паренхиму мозга, не совсем понятно. В частности, было показано, что ячейки GBM вторгаются в перитуморальное пространство различными путями; основной интерес данной статьи представляет маршрут по трактам белого вещества (WMP). Взаимодействие опухолевых клеток с компонентами перитуморальных нервных клеток характеризуется недостаточно хорошо. Здесь описан способ, оцениваемый влияние нейронов на инвазию клеток GBM. В этой статье представлен передовой анализ кокультуры in vitro, который имитирует инвазию WMT путем анализа миграции стволовых клеток GBM на нейронах. Поведение клеток GBM в присутствии нейронов контролируется с помощью автоматизированной процедуры отслеживания с открытым исходным кодом и программным обеспечением свободного доступа. Этот метод полезен для многих применений, в частности, для функциональных и механистических исследований, а также для анализа эффектов фармакологических агентов, которые могут блокировать миграцию клеток GBM на нейроны.
Введение
Первичные злокачественные глиомы, включая GBM, являются разрушительными опухолями со средней выживаемостью от 12 до 15 месяцев, зарегистрированной для пациентов с GBM. Современная терапия опирается на резекцию большой опухолевой массы и химиотерапию в сочетании с лучевой терапией, которая только продлевает выживаемость на несколько месяцев. Терапевтические неудачи тесно связаны с плохой доставкой лекарств через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и инвазивным ростом в периваскулярных пространствах, мозговых оболочках и вдоль ВМТ1. Периваскулярная инвазия, также называемая сосудистым коовитацией, является хорошо изученным процессом, и молекулярные....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Информированное письменное согласие было получено от всех пациентов (из больницы Хаукеланд, Берген, Норвегия, в соответствии с правилами местного комитета по этике). Этот протокол следует руководящим принципам комитетов по этике исследований человека и животных Университета Бордо. Беременных крыс размещали и лечили в животноводском учреждении Университета Бордо. Эвтаназия беременной крысы, временной E18, проводилась с использованием CO2. Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами и одобрены местным комитетом по этике. Все коммерческие продукты указаны в Таблице материалов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Узорчатые нейроны, культивируемые совместно с флуоресцентными клетками GBM, были подготовлены, как описано в разделе протокола, и были проведены эксперименты по отслеживанию. Клетки GBM быстро модифицировали свою форму во время миграции на нейронах(Рисунок 1B:панель 6 и Video 1). Клетки мигрировали вдоль расширений нейронов, в случайном движении(Видео 1). Флуоресцентные клетки GBM и нефлуоресцентные нейроны можно легко отличить, и это позвол.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Глиобластомы широко вторгаются в паренхиму, используя различные режимы: коопалита окружающих кровеносных сосудов, интерстициальная инвазия или инвазия на WMT18. Этот последний способ не очень хорошо охарактеризован в литературе из-за трудности поиска подходящих моделей in vitro или in vivo, связанных с вторжением WMT. Здесь была предложена упрощенная модель, в которой культивируемые нейроны грызунов были завезены на поверхностях, покрытых ламинином, а флуоресцентные стволовые кле.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Альвеол поддерживается Национальным агентством исследований (Грант Лабекс МОЗГ ANR-10-LABX-43). Йорис Гийон является стипендиатом Университетской больницы Тулузы (CHU Toulouse).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| (3-аминопропил) триэтоксисилан | Sigma | 440140-100ML | Аминогруппа полезна для биоконъюгации mPEG-SVA |
| 96-луночная пластина с круглым дном | Sarstedt | 2582624 | Используется для получения сфероидов |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Хранится при -20 °°; C (долгосрочный) или 4° C (кратковременный), фермент диссоциации сферы |
| B27 | Gibco | 12587 | Хранится при -20 °°; С, разморозить перед применением |
| Основной фактор роста фибробластов | Peprotech | 100-18B | Хранится при -20 °°С; C, разморозить перед использованием |
| Камеру для подсчета клеток CountessСлайды | Invitrogen | C10283 | Используется для подсчета клеток |
| Покровные стекла | Marienfeld | 111580 | Субстрат для клеточных культур |
| Картриджи с дессикатором | Sigma | Z363456-6EA | Используется для уменьшения большей части во время (3-аминопропиловой) обработки триэтоксисиланом |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Хранится при 4 ° C |
| Fiji программное обеспечение, MTrack2 макрос | ImageJ | Используется для анализа фотографий | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Гепарин натрия | Sigma | H3149-100KU | хранится при температуре 4 ° C |
| Laminin | 114956-81-9 | Способствует адгезии нейронов | |
| Программное обеспечение Leonardo загрузка | предполагаемых микропаттернов | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Программное обеспечение для автоматизации микроскопии |
| Метилцеллюлоза | Sigma | M0512 | Разведенная в NBM для 2% конечной концентрации |
| Нейробазальная среда | Gibco | 21103-049 | Хранится при 4 ° C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | инвертированный микроскоп, оснащенный моторизованным столиком | ||
| Пенициллин - стрептомицин | Gibco | 15140-122 | хранится при 4 °deg; C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Фотоинициатор, используемый для разложения ПЭГ-щетки |
| Поли(этиленгликоль)-сукцинимидилвалерата (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Используется в качестве противообрастающего покрытия |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Цифровой микрозеркальный прибор (DMD) на основе УФ-проекционного аппарата |
| Трипан синий 0,4% | ThermoFisher | T10282 | Используется для подсчета клеток |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Используется для отсоединения адгезивных клеток |
Ссылки
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
