In vivo Кальций Изображения в мыши Нижняя Оливковая

Основная цель системной нейронауки – понять, как патиотемпоральные модели активности нейронных сетей способствуют генерации поведения животных. Таким образом, флуоресцентная методология визуализации с использованием чувствительных к кальцию зондов в последнее десятилетие стала основным инструментом для изучения активности нейронной^{сети у живых животных 1,}2 , так как позволяет визуализировать^такуюдинамику в пространственных масштабах от одиночных клеток до мезомасштабных схем. В последние годы общий подход, при котором нейронные цепи в поверхностных структурах мозга (таких как мозговые или мозжечковые кортисы)^{изобрагются через прозрачное черепное окно 3,} дополняется использованием градиентно-рефракционных линз (GRIN)^{4, позволяющих} изучать динамику сети в глубоких структурах мозга. В настоящее время доступные линзы GRIN позволяют достичь в структуры несколько миллиметров глубиной, такие как мышеловка миндалина, гиппокамп и базальные^{ганглии 5}. Тем не менее, многие области интереса, такие как различные ядра в брюшной медулле лежат значительно глубже, помещая их в крайности досягаемости объектива GRIN.

Здесь мы описываем, как преодолеть эту трудность, воспользовавшись относительно легкой доступностью медуллы через брюшной аспект мозга. Используя взрослых мышей, где нижняя оливка (IO), ядро в брюшной медулле, была вирусно трансфицирована с датчиком кальция GCaMP6s, мы описываем хирургические шаги (измененные из метода, описанного первоначально в Khosrovani и др. 2007⁶), чтобы поместить объектив GRIN на брюшной поверхности мозга обезболивающей мыши. Используя миниатюрный микроскоп, мы демонстрируем целесообразность записи нейронной активности в таких чрезвычайно вентраловых областях мозга. Хотя процедура обязательно не выживаемость хирургии и никаких экспериментов может быть выполнена в бодрствующим животным, метод позволяет изучение нетронутой динамики сети в контексте сенсорной или другой афферентной стимуляции пути, обеспечивая явные преимущества по сравнению с ex vivo-подходов, таких как использование острых препаратов ломтик.

Были соблюдены все применимые международные, национальные и институциональные руководящие принципы по уходу и использованию животных. Методы асептической хирургии были применены к инъекции стереотаксиического вируса вектора.

1. Стереотаксисная инъекция переносчика вируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус, несущий генетический материал для выражения GCaMP6s (AAV9. CAG. GCaMP6s.WPRE.SV40) стереотаксис вводится как ранее^{описанные 7,8 со} следующими изменениями.

1. Используйте кварцевое стекло (внешний диаметр: 1,14 мм, внутренний диаметр: 0,53 мм) вместо борозиликатного стекла для изготовления пипетки с длинным и жестким конусом для впрыска ИО с помощью лазерного капиллярного шкива с параметрами, скорректированными как в руководстве продукта. После вытягивания, отрезать 1-2 мм от кончика пипетки скальпелем, чтобы приобрести 8-10 мм длиной конус с 15-20 мкм внутреннего диаметра кончика(рисунок 1a). Завершите пипетку, скошенный его кончик до 30 "формы иглы с вращающейся микропипетой beveler для облегчения проникновения мозга и меньше изгиба пипетки(рисунок 1a).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Широко используемые borosilicate стеклянная пипетка будет слишком гибким, чтобы правильно целевой глубоких областях, когда вытащил до этой длины. Инжектор нанолитров был использован со стеклянной пипеткой для доставки вируса в этом исследовании. Кроме того, можно использовать высокоточный стеклянный шприц или инжектор давления.
2. Убедитесь, что грудь мыши лежит на тепловой панели, чтобы ее шея не растягивается с достаточной поддержкой тела, и быть очень осторожным с выравнивание черепа при фиксации мыши на стереотаксис кадр (Рисунок 1b).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разница Брегма-ламбда должна быть менее 0,05 мм в вертикальном измерении.
3. Используйте 6,2 мм хвостовой, ±0,5 мм боковой и 6,6 мм брюшной относительно брегмы в качестве координат для ориентации основного ядра IO (рисунок 1c).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное выравнивание мозга значительно увеличит уровень успеха инъекций вируса в IO. Координаты должны быть подтверждены экспериментатором, так как ожидаются значительные различия между лабораториями, штаммами мышей и отдельными исследователями. Для подготовки видеоматериалов для этой публикации мы использовали одну мужскую мышь C57Bl/6J.
4. Следуйте соответствующим институциональным руководящим принципам послеоперационного ухода и жилищных процедур для вирусно-трансфицированных животных в течение 3-4 недель.

Рисунок 1: Стереотаксис вирус вектор инъекции. (a ) лазерный вытащил кварцевый стеклянный пипетка имеет 10-12 мм длиной прямо конус. После вытягивания, отрезать 1-2 мм от кончика. Пипетка завершается путем скошения кончика до 30 "формы иглы. b)правильная инъекция зависит от правильного положения тела мыши в стереотаксисной раме. Подтмить грудь мыши, чтобы предотвратить растяжение шеи. Уровень мыши голову путем выравнивания брегма и lambda горизонтально. c)Координация IO по отношению к брегме показана в спинной вид (слева) черепа мыши и коронального вида (правый верх) мозга. Инъекция достигает боковой части основного (IOPr) и спинного (IOD) субнуклея IO (правое дно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Подготовка инструментов и расходных материалов для операции на брюшном подходе

1. Подготовьте интубацию трубки, разрезая 5-6 мм в длину и 0,8 мм в ширину щели от кончика 20-го калибра катетера, чтобы интубированное животное может выдохнуть(рисунок 2a).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез необходим для животных, чтобы выдыхать, если общий испаритель изофлурана с постоянным потоком воздуха используется. Если вентилятор используется в дополнение к испаритель, катетер может быть оставлен нетронутым.
2. Подготовь тупую иглу для поддержки трахеи во время трахеотомии. Отрежьте острый кончик 25-го калибра иглы плоскогубцами. Гладкая поверхность перелома с наждачной бумагой. Согните тупую иглу в середине примерно до 15 "с плоскогубцами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изогнутая игла поднимает трахею мягко. Это может уменьшить деформацию трахеи.
3. Разбавить 50 мг/мл кетамина солевым раствором до 15%. Окончательная концентрация составляет 7,5 мг/мл.
4. Соберите чистые хирургические инструменты и расходные средства, включая лидокаин гель, солевой раствор, желатин губки, абсорбющие тампоны, вазелин и чистящие ткани.
5. Включите испаритель изофлюран. Установите грелку для животных до 38 градусов по Цельсию.
6. Поверните носовой конус стереотаксиальной рамы на 180 градусов по горизонтали, чтобы мышь можно было зафиксировать в вентральную сторону рамы вверх. Отрегулируйте высоту конуса носа так, чтобы он был на уровне ушных батончиков.

3. Администрация анестезии и подготовка мыши к операции

1. Взвесить животное с весовой шкалой и рассчитать количество разбавленного кетамина для инъекций.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество кетамина необходимо 56,25 мг на кг массы тела. Таким образом, объем разбавленного кетамина составляет 7,5 мл на кг массы тела. Недостатки использования кетамина только включают плохое расслабление мышц, тахикардия и повышенный мышечный тонус^9. В этом протоколе, однако, кетамин используется только для покрытия 10-20 с период, в течение которого изофлуран администрации прерывается из-за трахеотомии. Сохраняя этот шаг как можно более кратким, анестезия эффект изофлюран не значительно уменьшается и недостатки с использованием кетамина сведены к минимуму.
2. Поместите мышь в анестетической индукционной камеры предварительно заполнены 5% изофлюран. Когда животное полностью обезболено, показано на потере правого рефлекса и более глубокой и медленной дыхательной модели, переключите поток изофлюрана на носовой конус стереотаксиаической рамы и уменьшите концентрацию изофлюрана до 2,5%.
3. Зафиксите животное в стереотаксисной раме брюшной стороны вверх(рисунок 2b). Отрегулируйте высоту и высоту носового конуса, чтобы убедиться, что животное может дышать легко. Держите животное в тепле с предварительно разогретой грелкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие нижней части тела животного с куском бумаги или алюминиевой фольги может помочь поддержанию температуры животного.
4. Удалите волосы на коже в области горла и бедра с бритвой и кремом для удаления волос(рисунок 2b). Местно нанесите лидокаин гель на кожу горла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик насыщения кислорода зажимом бедра периферического (SpO₂), который будет использоваться в процедуре 6, лучше всего работает на лысой коже.
5. Мониторинг температуры животных с ректальным термометром(рисунок 2b).
6. Ввись 1 мл теплого (37 градусов по Цельсию) солевого интраперитонеально, чтобы компенсировать потерю жидкости во время операции.
7. Оцените глубину анестезии сильным щепоткой на задних конечность ног. Не следует вызывать никаких обнаруживаемых ответов.

Рисунок 2: Подготовка операции брюшного подхода. (a)Подготовка интубации трубки путем резки 5-6 мм в длину и 0,8 мм в ширину щели в кончике 20-го калибра катетера. b)Смонтировать вентралую сторону животного в стереотаксисной раме и настроить угол конуса носа, чтобы животное легко дышало. Бритье кожи вокруг горла и бедер областях. Прикрепите датчик SpO₂ к бедру для мониторинга жизненно важных признаков мыши. Вставьте зонд прямой температуры для мониторинга температуры тела мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

4. Трахеотомия и интубация (20-25 мин)

1. Разоблачение трахеи.
   1. Сделайте вертикальный разрез в коже горла вдоль средней линии. Отделить кожу шеи от внутренностей под ним с помощью тупого метода вскрытия и отрезать кожу, чтобы выявить слюнные железы(рисунок 3a-b, 4a).
   2. Бесплатные слюнные железы из соединительной ткани и перевернуть их боковой подвергать стернотиреоидной мышцы покрыты трахеи с силами (Рисунок 3b-c).
      ПРИМЕЧАНИЕ: вазелин может быть применен на открытых тканей, чтобы держать их влажными. Избегайте области трахеи, чтобы держать его в чистоте для следующих шагов.
2. трахеотомия
   1. Вводят первую дозу разбавленного кетамина (7,5 мг/мл) интраперитонально, 5 мл на кг массы тела (37,5 мг/кг).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это занимает 3-5 мин для кетамина функционировать, таким образом, первая доза кетамина должны быть введены до отделения трахеи от окружающих мышц и кровеносных сосудов. Кетамин вводят в двух инъекциях из-за повышенного риска передозировки эффектов в сочетании с изофлюран анестезии.
   2. Тщательно разделить стернотиреоидной мышцы вдоль средней линии с кончиком тонкой типсов подвергать трахеи (Рисунок 3c). Отсоедините трахею от кровеносных сосудов и пищевода с помощью типса методом тупого вскрытия.
   3. Интраперитонально вводят вторую дозу разбавленного кетамина (7,5 мг/мл), 2,5 мл на кг массы тела (18,75 мг/кг).
   4. Вставьте тупую иглу под трахею поперечно, чтобы поддержать его (Рисунок 3d). Держите эту иглу пальцами, чтобы поддержать трахею. Руководство швовая нить вокруг третьего кольца трахеи caudal к щитовидной железе с половиной круга иглы(рисунок 3d). Сделайте четыре инструментальных галстука на этом трахеенном кольце.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нить, привязанная к трахее кольцо используется для обеспечения трахеи к груди животного. Не отрезай нить от иглы полукругового круга на этом шаге. Трахеальные кольца сделаны из хряща, который является гибким, но менее сильным, чем кости. Не завязывая шовную нить слишком туго или кольцо может сломаться.
   5. Pinch груди кожи с парой щипев. Пирс груди кожи с той же половины круга иглы, используемые в последний шаг и привести нить через кожу, в рамках подготовки к обеспечению трахеи к груди в следующем шаге (Рисунок 3d).
   6. Аккуратно поднимите трахею, потянув нить, привязанную к трахеальному кольцу, и разрежьте трахею рострал к связанному кольцу и хвостовую к щитовидной железе. Потяните каудальную трахею к груди. Поднимите отверстие трахеи, добавив небольшой кусочек хирургической губки под ним.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что более 5 минут прошло после второй инъекции кетамина перед резки трахеи для обеспечения уровня анестезии.
   7. Удалите оставшуюся жидкость внутри открывающейся кончика трахеи тонкой полоской чистящих тканей. Переключите поток изофлюрана из стереотаксийного конуса носа на инубную трубку. Вставьте интубацию трубки в трахею глубиной около 2 мм и убедитесь, что часть щели в трубке остается за пределами трахеи, чтобыдыхание (рисунок 3e, 4b).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно отрегулируйте угол трубки и глубину вставки, чтобы мышь дышала плавно и не повреждала трахею. Нефтяное желе может быть применено на внешней стороне трахеи, чтобы предотвратить его от высыхания, так что трахея не разрыв легко.
   8. Зафиксите трахею на коже грудной клетки, сделав 3-4 инструментальных связей. Свяжите трахею с шовной нитью, чтобы обеспечить трубку иноподации(рисунок 3e, 4b).

Рисунок 3: Трахеотомия и итонация мыши. (a-c) панели показывают процесс разоблачения трахеи. а)Удалить горло кожи, перерезав вдоль пунктирной линии. b)Переверните слюнные железы (SG) сбокулом, чтобы разоблачить трахею, покрытую стернотиреоидной мышцей (SM). c)Разрежьте открытый SM вдоль пунктирной линии, чтобы разоблачить трахею. (d-e) панели показывают трахеотомию. d)поддержка трахеи тупой и изогнутой иглой. Привяжу третье кольцо трахеи к щитовидной железе для обеспечения трахеи к коже грудной клетки. e)Нанесите изофлюран с инубляторной трубкой с разрезом в кончике. Закрепеть трахею к коже грудной клетки швовой нитью. Закрепейте интубацию трубки к трахее, связывая их вместе. Масштабная планка в 5 мм, применяется ко всем панелям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Схематическая диаграмма операции брюшного подхода с бокового вида. (a)Схематический рисунок с соответствующими анатомическими частями, указанными в их относительном расположении, когда мышь помещается вентральную сторону вверх. Сокращения: атлас мышечного покрытия (AM), продольные мышцы (ЛМ), слюнные железы (SG), стернотиреоидные мышцы (SM), щитовидная железа (TG). b)Схема расположения трубки инотубации по отношению к трахее, когда трахеотомия завершена. Трахея обеспечивается связями на коже грудной клетки (T-трахея). Индубация трубки (IT) обеспечивается связей вокруг трахеи конца (Т-трубка). c)Удалите атлас передней клубней (AAT), чтобы очистить линию зрения от IO. d)Схема, описывающая позиционирование миниатюрного микроскопа (ММ) и объектива GRIN над IO для эксперимента с визуализацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

5. Разоблачение ствола мозга (40-45 мин)

1. Разрежьте грудитиреоидную мышцу вдоль мышечного волокна с помощью тонких типсов. Вырезать изолированную часть с весенними ножницами (Рисунок 3e).
2. Тщательно освободите оставную трахею и гортань от мышц, чтобы свести к минимуму повреждения кровеносных сосудов в мышцах. Удалите оставную трахею и гортань. Освободите пищевод от прикрепленной ткани типсами и отрежьте его весенними ножницами. (Рисунок 5a).
3. Удалите мышцы, покрывающие вентерающую арку и переднюю клубень атласа с мелкими тибрями и пружинные ножницы(рисунок 5b).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении мышцы, разделить его часть с кончиком тонкой типсов. Отрежьте отделенную часть ножницами весны. Повторите это несколько раз, чтобы разоблачить атлас брюшной арки, чтобы свести к минимуму риск разрыва кровеносных сосудов.
4. Вырезать вентрал арки атласа с rongeur(рисунок 4c, 5c). Удалите переднюю клубень атласа. Удалите кровь и жидкость с хирургической губкой, чтобы посмотреть foramen magnum и ствол мозга(рисунок 4c, 5d).
5. Расширьте foramen magnum путем удаления затылочной кости с rongeur. (Рисунок 5d-e).
6. Удалите тонкий хрящ над foramen magnum с тонкими миппами и весенними ножницами. Тщательно очистить периостеальный слой dura mater с тонкой типсов, чтобы иметь четкое представление о брюшной ствол мозга (Рисунок 5f). Не ломай дура-матер.

Рисунок 5: Разоблачить ствол мозга мыши для изображения кальция. (a-f) панели показывают процесс разоблачения ствола мозга. a)Удалить стернотиреоидную мышцу (SM), помеченную на рисунке 3e. Отрежьте гортань и пищевод. b)Удалить продольную мышцу (ЛМ) и атлас мышечного покрытия (AM). c)Вырезать атласные вентрал арки (АВА) с помощью rongeur и удалить атлас передней клубней (AAT). d)отрезать затылчной кости (OB), чтобы расширить foramen magnum (FM). (e)Расширенный FM.( f) Тонкий хрящ выше foramen magnum удаляется. Периостейный слой dura mater снимается. Квадрат указывает на область, содержащую поверхностные нейроны IO. g)Изображение IO с объективом GRIN. Масштабная планка в 5 мм, применяется к a-c. Шкала бар в d'2 мм, применяется к d-e. Масштабная планка в 2 мм. Масштабная планка в 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

6. Кальций изображения

1. Зажим датчик SpO_{2 на} бедре мыши для мониторинга жизненно важных признаков, таких как частота сердечных сокращений, насыщение кислородом и частота дыхания (Рисунок 2b).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частота сердечных сокращений должна быть между 500 bpm и 600 bpm, насыщение кислородом должно быть выше, чем 90%, и частота дыхания должна быть 50-70 вдохов в^{минуту 10,11}.
2. Намонтировать зонд объектива GRIN (диаметр 9 мм. 1 мм) на имплантативном стержне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите объектив GRIN с 70% пропитанной этанолом очистки тканей перед визуализацией для хорошего качества изображения.
3. Зафиксировать имплантатный стержень на стереотаксисной раме и установить миниатюрный микроскоп на имплантатацию стержня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка миниатюрного микроскопа для визуализации должна быть завершена в соответствии с соответствующими рекомендациями пользователя продукта.
4. Добавьте несколько капель теплого солевого раствора в область ствола мозга для погружения в объектив GRIN.
5. Подойди к стволу мозга с объективом GRIN(рисунок 4d, 5g). Включите возбуждение синий светодиод (455 ± 8) в миниатюрном микроскопе. Найдите GCaMP6s-трансфицированных нейронов IO путем мониторинга флуоресценции изображения из миниатюрного микроскопа. Ищите нейроны IO в прямоугольной области 0,5-1,7 мм рострал к оставшемуся атласу и 0,6-1,1 мм боковой к средней линии в поверхностной области брюшного ствола мозга(рисунок 5f).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При поиске соответствующего поля зрения для визуализации IO ищите место, где средний диаметр сомата совпадает с диаметром IO нейрона сомата (около 15^{мкм 12}). Соседние регионы в медуллярном ретикулярном образовании состоят из значительно больших^{клеток 13,14.} Будьте осторожны при перемещении объектива GRIN вертикально, так как нажатие его на ствол мозга слишком сильно может убить животное.

7. Евтанизация животных после процедуры

1. В конце эксперимента усыпляйте животное с помощью вывиха шейки матки или другим методом, одобренным местной лабораторной регуляцией по уходу за животными.
2. Для дальнейшего исследования гистологии, сначала анестезировать животное с инъекционным препаратом, таким как кетамин / ксилазин сочетание (100 мг/кг и 10 мг/кг,^{соответственно) 15 до} перфузии сердца с решением Ringer следуют фиксативное решение для исправления мозга.

8. Обработка данных

1. Предварительная обработка записанного видео с изображением кальция перед анализом данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага использовалось коммерческое программное обеспечение для обработки данных в сопровождении миниатюрного микроскопа, и к этому относятся следующие этапы протокола. Кроме того, бесплатное и открытое программное обеспечение, такое как CaImAn^16,MINIPIPE¹⁷и MiniscoPy^{18, может} быть использовано как для предварительной обработки, так и для анализа.
   1. Загрузите записанное видео с изображением кальция в программное обеспечение для обработки данных.
   2. Нажмите кнопку Preprocess. Определите площадь урожая, исключая регионы без флуоресцентных нейронов и обуработав видео, чтобы уменьшить размер файла для более быстрой обработки.
   3. Нажмите кнопку пространственного фильтра. Установите низкий отключок и высокий отключок для пространственного фильтра до 0,005^{пикселя -1}и 0,5^{пикселя -1} соответственно. Нанесите пространственный фильтр на каждый кадр видео, чтобы увеличить контрастность и сгладить изображение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственный фильтр является полосой Госсианого фильтра. Низкочастотные компоненты, происходящие из внефокусных ячеек, могут сбить с толку коррекцию движения на следующем этапе. Компонент высокой пространственной частоты может привести к тому, что видео будет казаться менее гладким.
   4. Нажмите кнопку Коррекция движения. Примените коррекцию движения к видео, используя первый кадр в качестве эталонного кадра, чтобы уменьшить связанные с движением артефакты, вызванные кровотоком в стволе мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коррекция движения использует метод регистрации изображений, разработанный Thevenaz et al¹⁹.
   5. Экспорт скорректированного движения видео в формате TIFF.
2. Применить CNMF-E^{20 на} движение исправленное видео в MATLAB для выявления отдельных нейронов, следуя инструкциям для кода CNMF-E MATLAB в онлайн-хранилище²¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: CNMF-E является ограниченным не-негативный подход факторизации матрицы настроены для однофотонной визуализации. Демо-скрипты в репозитории могут быть изменены и использованы для обработки данных.

Здесь мы представляем репрезентативную запись, полученную методом, как описано. На рисунке 6a показано расположение ярко помеченных клеток IO, визуализированых в ходе эксперимента. Темные диагональные полосы кровеносных сосудов. Обратите внимание на переменную яркость отдельных клеток, в результате переменной эффективности трансфекции. На панели Рисунок 6b мы показываем средние нормализованные интенсивности флуоресценции (deltaF/F) следы, полученные из сомата указано с цветами и числами в панели. Отклонения вверх представляют собой переходное увеличение внутриклеточного кальция. Обратите внимание, как различное выражение GCaMP6s (отраженное в яркости ячейки в панели a) приводит к переменным соотношениям сигнала к шуму (SNR).

Рисунок 6: Пример записи активности нейронов IO в анестезированных мыши. ( ) Представитель пример кадра из записи после пространственной фильтрации. Яркими пятнами являются IO нейрональной сомата, некоторые из которых были указаны как регионы интересов (ROIs, цветные числа). Темные полосы кровеносных сосудов. b) Примерследов deltaF/F, полученных из ROIs, указанных в панели a. Отклонения вверх отражают увеличение сигнала кальция. Масштабная планка в a'10 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Авторов нечего раскрывать.