Липидные наночастицы разработаны с использованием микрофлюидного подхода к смешиванию платформы для инкапсуляции мРНК и ДНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Формулирование и характеристика липидных наночастиц для доставки генов с использованием платформы микрофлюидного смешивания
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Носители лекарств на основе липидов использовались для клинически и коммерчески доступных систем доставки из-за их небольшого размера, биосовместимости и высокой эффективности инкапсуляции. Использование липидных наночастиц (ЛНФ) для инкапсуляции нуклеиновых кислот выгодно для защиты РНК или ДНК от деградации, а также способствует поглощению клеток. ЛНП часто содержат несколько липидных компонентов, включая ионизируемый липид, хелперный липид, холестерин и конъюгированный липид полиэтиленгликоля (ПЭГ). ЛНФ могут легко инкапсулировать нуклеиновые кислоты благодаря ионизируемому липидному присутствию, которое при низком рН является катионным и позволяет комплексовать с отрицательно заряженной РНК или ДНК. Здесь ЛНП образуются путем инкапсуляции матричной РНК (мРНК) или плазмидной ДНК (пДНК) с использованием быстрого смешивания липидных компонентов в органической фазе и компонента нуклеиновой кислоты в водной фазе. Это смешивание выполняется с использованием точной микрофлюидной платформы смешивания, позволяющей самосборку наночастиц при сохранении ламинарного потока. Гидродинамический размер и полидисперсность измеряются с помощью динамического рассеяния света (DLS). Эффективный поверхностный заряд на LNP определяется путем измерения дзета-потенциала. Эффективность инкапсуляции характеризуется с использованием флуоресцентного красителя для количественной оценки застрявленной нуклеиновой кислоты. Репрезентативные результаты демонстрируют воспроизводимость этого метода и влияние, которое различные рецептурные и технологические параметры оказывают на разработанные ЛМП.
Введение
Лекарственные носители используются для защиты и доставки терапевтических средств с типичными благоприятными свойствами, включая низкую цитотоксичность, повышенную биодоступность и улучшенную стабильность1,2,3. Полимерные наночастицы, мицеллы и частицы на основе липидов ранее были исследованы для инкапсуляции и доставки нуклеиновых кислот4,5,6,7. Липиды были использованы в различных типах нанонесушек, включая липосомы и липидные наночастицы, посколь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Схема всего процесса приведена на рисунке 1.
1. Подготовка буферов
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная фильтрация буферов здесь настоятельно рекомендуется для удаления любых частиц, которые могут повлиять на качество нуклеиновой кислоты и LNP.
- Фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)
- Подготовьте 1x PBS, используя8 мМNa 2 HPO4,2 мМ KH2PO4, 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl в воде без нуклеаз и отрегулируйте рН до 7,4.
- Стерилизуйте вакуумной фильтрацией с помощью фильтра размером пор 0,22 мкм.
- Цитра....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Несколько партий ЛНП с одинаковым липидным составом и соотношением N/P 6 были разработаны в отдельные дни, чтобы продемонстрировать воспроизводимость метода. Партии 1 и 2 привели к перекрытию размерных распределений с аналогичной полидисперсностью(рисунок 2A)Не наблюдалось существенной разницы в размере или эффективности инкапсуляции между двумя различными партиями(рисунок 2B). Эффективность инкапсуляции была высокой для каждой п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Воспроизводимость, скорость и малый объем скрининга являются значительными преимуществами использования микрофлюидного смешивания для образования ЛНП по сравнению с другими существующими методами (например, гидратация липидной пленки и инъекция этанола). Мы продемонстрировали воспроизводимость этого метода без влияния на эффективность инкапсуляции или размер частиц, наблюдаемых с различными партиями LNP. Это важный критерий для того, чтобы любая терапевтическая, включая ЛМП, стала клинически доступной.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все авторы являются сотрудниками Sanofi. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов или конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Спасибо Атулу Салудже, Ятину Гокарну, Марии-Терезе Пераккии, Вальтеру Швенгеру и Филипу Закасу за их руководство и вклад в развитие LNP.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,2-димиристоил-рак-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 &; l Градуированные фильтрующие наконечники (без РНКазы-,ДНКазы-, ДНК-) | США Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 &микро; l Градуированные фильтрующие наконечники (РНКаза-,ДНКаза-, без ДНК) | США Scientific | 1111-2831 | |
| 20 &; l Скошенные фильтрующие наконечники (РНКаза-,ДНКаза-, без ДНК) | США Scientific | 1120-1810 | |
| 200 &микро; l Граудированные фильтрующие наконечники (РНКаза-,ДНКаза-, без ДНК) | США Scientific | 1120-8810 | |
| 3&бета;-гидрокси-5-холестен, 5-холестен-3&бета;-ол (холестерин) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Стерильные шприцы со скользящим наконечником (шприц 1 мл) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Стерильные шприцы с скользящим наконечником (шприц 3 мл) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer Иглы для шприцев общего назначения (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Настольная центрифуга | Beckman coulter | ||
| Black 96 луночных пластин | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT РНКаза, ДНКаза, ДНК-безДНК микроцентрифужные пробирки (1,5 мл) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Лимонная кислота | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500мл Вакуумный фильтр / Система хранения бутылок, 0,22 мкм поры | Corning | 430769 | |
| Одноразовые складчатые капиллярные клетки | Malvern | DTS1070 | |
| этиловый спирт, чистый 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Конические | 14955127 | |
| Invitrogen (15 мл) (без ДНКазы-РНКазы) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeЦентробежные фильтрующие блоки Sigma Amicon Ultra | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Настольные | прецизионные Nanyosystems | ||
| безнуклеазная вода | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Anamine Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT Набор для анализа РНК RiboGreen | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Хлорид натрия | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Цитрат натрия, дигидрат, гранулированный | Fisher | Scientific 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Молекулярные устройства Zetasizer | ||
| Nano | Malvern |
Ссылки
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
