Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Аллотрансплантация опухоли у Drosophila melanogaster с программируемым авто-нанолитрным инъектором

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62229

⸱

2 февраля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Tulane University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предоставляет подробное руководство для начальной и продолжающейся аллотрансплантации опухолей дрозофилы в брюшную полость взрослых хозяев для изучения различных аспектов неоплазии. Используя аутоинжекторный аппарат, исследователи могут достичь улучшенной эффективности и выхода опухоли по сравнению с теми, которые достигаются традиционными, ручными методами.

Аннотация

Этот протокол описывает аллотрансплантацию опухолей у Drosophila melanogaster с использованием автомата нанолитра инъекционного аппарата. С помощью автоинжекторного аппарата обученные операторы могут достичь более эффективных и последовательных результатов трансплантации по сравнению с теми, которые получены с использованием ручного инъектора. Здесь мы освещаем темы в хронологическом порядке: от пересечения линий дрозофилы до индукции и рассечения первичной опухоли, трансплантации первичной опухоли новому взрослому хозяину и продолжающейся трансплантации опухоли для расширенных исследований. В качестве демонстрации здесь мы используем внутриклеточный домен Notch (NICD), индуцированную сверхэкспрессией слюнных желез имагинальных кольцевых опухолей для трансплантации поколений. Эти опухоли могут быть сначала надежно индуцированы в микроокружении переходной зоны в воображаемых кольцах личиночной слюнной железы, а затем аллотрансплантированы и культивированы in vivo для изучения продолжающегося роста, эволюции и метастазирования опухоли. Этот метод аллотрансплантации может быть полезен в потенциальных программах скрининга лекарств, а также для изучения взаимодействий опухоли и хозяина.

Введение

Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство по аллотрансплантации опухолей имагинального кольца личиночной слюнной железы Drosophila (SG) в брюшную полость взрослых хозяев с использованием аппарата для инъекции автонанолитров (например, Nanoject). Этот протокол также предоставляет направления для последующей реаллотрансплантации опухолей в новые поколения взрослых хозяев, что обеспечивает возможности для продолжения продольного изучения характеристик опухоли, таких как эволюция опухоли и взаимодействия опухоли с хозяином. Протокол также может быть применен к экспериментам по скринингу лекарств.

Этот метод был разработан для повышения эффективности выполнения аллотрансплантации опухоли при дрозофиле с использованием ручных инъекторов1, которые часто непоследовательны в своих силах всасывания и инъекции, что приводит к неоптимальным результатам для аллотрансплантации опухоли. Автоинжекторный аппарат обеспечивает лучший контроль и может привести к более низким показателям смертности мух после аллотрансплантата. Обученный оператор мог достичь выживаемости хозяина более 90% с автоинжектором, по сравнению с примерно 80%, когда использовался ручной инжектор1. Общая скорость приобретения опухоли составляет 60%-80% на 8-12 день после аллотрансплантата. Среднее время впрыска также было улучшено с 30-40 с на муху при использовании ручного инжектора до 20-25 с на муху с использованием автоинжектора.

Этот протокол является одним из первых нескольких протоколов для использования аутоинъекторного аппарата при аллотрансплантации опухоли дрозофилы . В недавнем исследовании также использовался аутоинъектор для аллотрансплантации опухолевых нервных стволовых клеток2. Ранее аутоинжекторный аппарат применялся у дрозофилы для изучения бактериальной вирулентности3, паразитарных инфекций и защиты хозяина4, а также скрининга на биоактивность различных соединений5. Наш протокол адаптирует аутоинжекторный аппарат для инъекций опухоли и стремится предоставить исследователям дрозофилы более высокое качество и более последовательные результаты, экономя при этом их значительное время. Этот протокол может быть не только использован для аллотрансплантации опухолей, но также может быть адаптирован к аллотрансплантации диких типов и мутантных тканей аналогичного калибра6.

Опухоль Drosophila NICD, используемая в этом протоколе, была впервые введена Yang et al.7 в переходную зону имагинального кольца SG, «опухолевую горячую точку», которая демонстрирует высокие уровни эндогенной янус-киназы / сигнального преобразователя и активаторов транскрипции (JAK-STAT) и активности c-Jun N-терминальной киназы (JNK). Кроме того, переходная зона имеет высокие уровни матриксной металлопротеиназы-1 (MMP1)7, что делает эту область особенно благоприятной для опухолевого генеза. Активация пути Notch только через сверхэкспрессию NICD достаточна для последовательного инициирования образования опухоли. Эти опухоли могут быть впоследствии аллотрансплантированы, чтобы позволить исследовать широкий спектр тем, включая деление опухолевых клеток, инвазию и взаимодействие опухоли с хозяином.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Препарат опухоли имагинального кольца SG

  1. Скрещивайте взрослых мух с генотипами UAS-NICD (самец: 10-15 мух) и Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (девственная самка: 10-15 мух) и позволяйте им размножаться в течение 1 дня при 18 °C. Отобранным взрослым мухам должно быть 5-9 дней для обеспечения высокой фертильности.
  2. Дайте взрослым мухам отложить яйца в корм мух, содержащийся во флаконах, в течение 24 ч при 18 °C, затем удалите взрослых мух.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корм для мух готовится по стандартному рецепту кукурузной муки от Drosophila Stock Center8. Каждый флакон должен содержать около 10 мл пищи для мух.
  3. Дайте яйцам инкубироваться в течение 6 дней при 18 °C. В этот период личинки будут вылупляться.
  4. Перенесите флаконы, содержащие личинки, в инкубатор при температуре 29 °C и инкубируйте еще 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап инкубации является необязательным в зависимости от конкретной экспериментальной конструкции.

2. Подготовка взрослой особи дикого типа дрозофилы к аллотрансплантации

  1. Обезболивают диких или соответствующих взрослых мух-мутантов со 100% CO2 и сортируют мух по половому признаку. Как самцы, так и самки мух могут быть использованы в качестве хозяев опухоли.
  2. Закрепите кусок ленты длиной 5 см к предметной доске микроскопа липкой стороной вверх, закрепив его двумя меньшими кусками ленты, по одному на каждом конце.
  3. Обездвиживайте мух, приклеивая их крылья к ленте. Используйте щипцы во время маневрирования мух.
    1. Повторите описанный выше шаг для 60-80 взрослых мух, используемых в качестве акцепторов аллотрансплантата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего организовать мух в аккуратные ряды, с осью их тела, выровненной параллельно друг другу для более эффективного по времени процесса впрыска позже. На рисунке 1 показаны ряды мух-хозяев, заклеенных таким образом.

3. Сборка автоинжекторного аппарата

  1. Подключите устройство автоинжектора и шнур питания к блоку управления.
    1. Установите объем впрыска на 59,8 нЛ. Это поможет поддерживать соответствующее количество сил всасывания и впрыска во время аллотрансплантации.
  2. Поместите блок контроллера и автоинжектор на противоположные стороны светового микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для операторов-правшей блок управления должен быть размещен на левой стороне микроскопа, а инжектор - на правой. Наоборот для операторов-левшей.
  3. Подготовьте 3,5-дюймовый стеклянный капилляр для использования, отрезав закрытый конец щипцами.
    1. Обработайте один конец стеклянного капилляра с помощью четырехступенчатого съемника микропипетки и нагрейте до узкого закрытого конца, используя следующие спецификации прибора: Тепло = 650, Сила = 200 и Расстояние = 8. Аккуратно поместите капилляры в съемный аппарат и запустите программу после ввода вышеуказанных настроек.
    2. Используйте щипцы, чтобы обрезать капилляр под углом примерно 60°, чтобы сделать более острый конец для легкого проникновения в брюшко взрослой мухи1. См. рисунок 2 для примера хорошо обрезанного капилляра.
  4. Слегка открутите колпачок инжектора. Удерживайте кнопку Empty , чтобы продвинуть иглу инжектора до 70-80% от ее общей длины. Чтобы ускорить продвижение капилляров, нажмите кнопку Fill один раз, одновременно удерживая кнопку Empty .
  5. Используйте шприц, чтобы заполнить стеклянный капилляр минеральным маслом. Затем осторожно вставьте стеклянный капилляр на иглу инжектора до тех пор, пока первый не будет прочно прикреплен к резиновой пробке инжектора. Теперь прикрутите крышку инжектора плотно.
    1. Протрите остатки минерального масла на внешней поверхности стеклянной капиллярной крышки, чтобы избежать загрязнения среды во время аллотрансплантации.

4. Рассечение опухоли имагинального кольца SG

  1. Выберите одну из личинок и перенесите ее на рассеченную пластину, заполненную 100 мкл среды Шнайдера, чтобы подготовиться к рассечению опухоли имагинального кольца SG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только образцы, содержащие опухоль, останутся в качестве личинок. Это связано с тем, что рост опухоли задерживает развитие и прогрессирование личинок9. Две трети образцов не будут содержать опухоль и, таким образом, прогрессируют до куколок / взрослых.
    1. Для рассечения и аллотрансплантации используйте стереомикроскоп с диапазоном увеличения 10x-20x.
  2. Используя одну пару щипцов, чтобы удержать среднюю часть тела личинки, зажмите головку личинки с помощью другой пары щипцов и приложите силу растяжения вдоль.
  3. Найдите Y-образный SG личинок и изолируйте его от остальной части личиночной ткани10.
  4. Рассекните и изолируйте опухоль воображаемого кольца SG путем удаления прилегающей ткани. См. рисунок 3 для описания этого процесса рассечения.
  5. Повторите шаги 4.1-4.4 для дополнительных опухолей с имагинальным кольцом от 10 до 20 SG на основе потребностей в исследованиях.

5. Аллотрансплантат первичной опухоли имагинального кольца SG

  1. Погрузите капилляр в среду Шнайдера, содержащую первичные опухоли Имагинального кольца SG. Удерживайте кнопку «Заполнить », чтобы заполнить стеклянный капилляр средней частью Schneider до верхнего сегмента 0,5 см. Этот верхний сегмент должен оставаться заполненным минеральным маслом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ускорьте этот процесс, нажав кнопку Empty один раз, одновременно удерживая кнопку Fill .
  2. Найдите первичную опухоль и нажмите кнопку Fill , пока опухоль не будет отсасываться в капилляр.
    1. Убедитесь, что опухоль находится на кончике капилляра или в нескольких миллиметрах от кончика капилляра. Это помогает избежать дрейфа опухоли и потери в растворе, содержащемся в капилляре. См. Рисунок 4А для демонстрации соответствующего расположения опухоли, когда она находится в капилляре.
  3. Найдите взрослую муху, иммобилизованную к ленте на предметном стекле микроскопа. Используя щипцы, осторожно удерживайте нижнюю часть живота. Затем проколоть нижнюю боковую кутикулу брюшка капилляром. Нажимайте кнопку Empty до тех пор, пока опухоль не войдет в живот нового хозяина. См. рисунок 4B для демонстрации этой техники.
  4. Используя щипцы, аккуратно зажмите крылья хозяина вверх, чтобы снять его с ленты. Поместите хозяина в новый флакон со свежими продуктами. Лучше всего размещать флакон боком в течение первых 24 ч после инъекции. Каждый флакон должен содержать не более 20 мух.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мухи-хозяева будут иметь отсутствующие крылья и другие раны на своих телах после инъекции и могут прилипать к пище мухи, если флакон размещен вертикально.
  5. Повторите шаги с 5.2 по 5.4, чтобы пересадить оставшиеся первичные опухоли в их новых взрослыххозяев.
  6. Утилизируйте капилляры в контейнер для острых предметов и очистите остатки минерального масла с внешней стороны автоинжектора, прежде чем заменить аппарат обратно в его коробку.
  7. Храните флакон хозяев при комнатной температуре в течение 1 дня, затем перенесите флакон в инкубационную камеру при 29 °C. Переводите хозяев на новые флаконы каждые 2-3 дня.
  8. Ежедневно контролируйте хозяев мух и рассчитывайте выживаемость. Через неделю опухоли должны быть видны под стереомикроскопом с флуоресцентным адаптером и могут постоянно контролироваться на предмет их размера и прогрессирования.

6. Реаллотрансплантат трансплантированных опухолей

  1. Примерно через 10-14 дней после аллотрансплантата скрининг на опухоли, которые выросли в брюшной полости хозяина, с помощью флуоресцентного микроскопа.
  2. Обезболить хозяина CO2 и поместить его в рассеченную пластину, заполненную 100 мкл средой Шнайдера. Рассекните выращенную аллотрансплантированную опухоль из хозяина с помощью двух пар щипцов.
    1. Используйте одну пару щипцов, чтобы удерживать живот, а другую пару, чтобы разрезать брюшную кутикулу, обнажая аллотрансплантированную опухоль1.
    2. Тщательно изолируйте опухоль от прикрепленных тканей хозяина как можно больше, используя маркеры флуоресценции в качестве ориентира.
  3. Повторите шаг 6.2, чтобы подготовиться к двум-трем дополнительным аллотрансплантированным опухолям.
  4. Перенесите рассеченную пластину, содержащую собранные опухоли, на стадию светового микроскопа.
  5. Используйте стерильные иглы и рассекайте опухоли на более мелкие кусочки, которые подходят для размера капилляров.
  6. Повторите шаги 4.1-4.5 для подготовки нового поколения взрослых хозяев и повторите шаги 5.1-5.7, чтобы завершить аллотрансплантацию опухолей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Показатели успеха, как правило, выше для непервичных опухолей по сравнению с первичными опухолями.
  7. Повторите шаги 6.1-6.6 для каждого последующего поколения мух, используемых в исследовании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите линии для размещения Drosophila , соответствующие экспериментальным потребностям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы провели поколенческую аллотрансплантацию опухолей имагинального кольца SG с использованием нанолитрового инъекционного аутоинжекторного аппарата и провели последующую визуализацию опухоли в реальном времени с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, что позволило глубже погрузиться в темы роста опухоли, миграции опухолевых клеток и взаимодействия опухоли с хозяином. При монтаже мух приклейте их к предметному стеклу микроскопа и удерживайте их с помощью блока11 полидиметилс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Аллотрансплантация опухоли может помочь исследователям решить определенные проблемы, возникающие во время роста и прогрессирования опухоли дрозофилы. Одной из таких проблем является обход преждевременной смерти опухоленосных личинок или взрослых особей во время первичной опухолевой культуры12. В этом контексте продолжающаяся аллотрансплантация опухоли позволяет опухолям расти бесконечно, что облегчает продольные исследования роста опухоли, метастазирования и эволюции. Аллотрансплантация о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Среди авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим бывших членов лаборатории д-ра Шэн-Ан Яна и г-на Хуана-Мартина Портилью за их вклад в разработку этого протокола. Мы благодарны лаборатории доктора Яна Сонга в Школе наук о жизни Пекинского университета за то, что она поделилась своим протоколом ручной аллотрансплантации. Мы также благодарим г-на Колдера Эллсворта и г-на Эвереста Шапиро за критическое прочтение рукописи.

ОМУ получил финансирование (GM072562, CA224381, CA227789) для этой работы от Национального института здравоохранения (https://www.nih.gov/) и финансирование (IOS-155790) от Национального научного фонда (htps://nsf.gov/). Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZeissLSM 980Также известный как "Zeiss LSM 980"
Корм для мухи из кукурузной мукиBloomington Drosophila Stock CenterN/AТакже известный как "BDSC Standard Cornmeal Food"
Игла для препарирования (30 г x 1 / 2)BD PrecisionГлайд305106
препарирование тарелкиFisher Scientific12-565B
Лента от мухFisherbrand159015A
Флуоресцентный адаптер для микроскопа SteroЭлектронная микроскопия наукSFA-UVТакже известен как "NightSea Флуоресцентный адаптер"
Флуоресцентный микроскопZeiss495015-0001-000Также известен как "Zeiss Stereo Discovery.V8"
ЩипцыFine Science Tools11251-10Также известен как "Щипцы Дюмон #5" 
Стеклянный капилляр (3,5'')Drummond3-000-203-G/X
КлейElmerE305Также известен как "Elmer Washabale Clear Glue"
Световой микроскопZeiss435063-9010-100Также известен как "Zeiss Stemi 305"
Съемник микропипетокWorld PrecisionInstruments PUL-1000Также известен как "Четырехступенчатый съемник микропипеток"
Nanoject ApparatusDrummond3-000-204Также известен как "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"
Schneider's MediumThermoFisher21720001
Шприц (27G x1/2)BD PrecisionGlide305109
флаконFisherbrandAS507

Ссылки

  1. Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
  2. Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
  3. Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. Pseudomonas Methods and Protocols. , Springer. 723-740 (2014).
  4. Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
  5. Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597(2012).
  6. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753(2011).
  7. Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
  8. Bloomington Drosophila Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , (2020).
  9. Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
  10. Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
  11. Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
  12. Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51(2019).
  13. Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103(2013).
  14. Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
  15. Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
  16. Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Аллотрансплантация опухоли у Drosophila melanogaster с программируемым авто-нанолитрным инъектором
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.