Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) между двумя молекулами флуорофора может быть использован для изучения белковых взаимодействий в живой клетке. Здесь представлен протокол о том, как измерять FRET в живых клетках путем обнаружения сенсибилизированного излучения акцептора и гашения донорной молекулы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка белковых взаимодействий в живых клетках с FRET-сенсибилизированным излучением
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) представляет собой безрадиационный перенос энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния и ориентации молекул, а также от степени перекрытия между спектрами донорского излучения и акцепторного поглощения. FRET позволяет изучать взаимодействие белков в живой клетке с течением времени и в различных субклеточных компартментах. В литературе описаны различные алгоритмы измерения FRET с помощью микроскопии, основанные на интенсивности. Здесь представлены протокол и алгоритм для количественной оценки эффективности FRET, основанные на измерении как сенсибилизированного излучения акцептора, так и гашения молекулы-донора. Количественная оценка ратиометрического FRET в живой клетке требует не только определения перекрестных помех (спектрального перелива или утечки) флуоресцентных белков, но и эффективности обнаружения микроскопической установки. В приведенном здесь протоколе подробно описано, как оценить эти критические параметры.
Введение
Анализ резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) на основе микроскопии позволяет оценить взаимодействия между белками в живых клетках. Он предоставляет пространственную и временную информацию, включая информацию о том, где в клетке и в каком субклеточном компартменте происходит взаимодействие, и изменяется ли это взаимодействие с течением времени.
Теодор Фёрстер заложил теоретическую основу FRET в 1948 году1. FRET представляет собой безрадиационную передачу энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния между молекулами и относительной ориентации их переходных диполей, а также от п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Плазмидная конструкция
- Для генерации зонда слияния eGFP-mCherry1 используйте вектор экспрессии клеток млекопитающих N1 (см. Таблицу материалов) со вставленным mCherry110 с использованием сайтов рестрикции AgeI и BsrGI.
- Используйте следующие олигонуклеотиды для амплификации eGFP11 без стоп-кодона в виде фрагмента SalI-BamHI : N-концевой праймер 5'-AAT, TAA, CAG, TCG, ACG, ATG, GTG, AGC, AGC, AGC, GAG G, 3' и C-концевой праймер 5'-AAT, ATA, TGG, ATC, CCG, CTT, GTA, CGT, CTC, CAT, GC 3'.
- Вставьте этот фрагмент SalI-BamHI в сайт множественн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1 показаны изображения, полученные в донорном канале, канале 1 (488, 505-530 нм), канале передачи, канале 2 (488, >585 нм) и акцепторном канале, канале 3 (561, >585 нм) соответственно. Репрезентативные изображения клеток, экспрессирующих только GFP, только вишню, совместно экспрессирующих GFP и вишню и экспрессирующих слитый белок GFP-вишни. Средняя клеточная эффективность FRET, рассчитанная в клетках NRK, экспрессирующих слитый белок GFP-Che.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В представленном протоколе подробно описано использование генетически связанного взаимно-однозначного калибровочного зонда флуоресцентного белка для количественной оценки FRET с использованием детектирования сенсибилизированного излучения акцептора и гашения донорной молекулы методом конфокальной микроскопии. Этот метод может быть применен для оценки белковых взаимодействий в физиологическом контексте живой клетки в различных субклеточных компартментах. Пространственное разрешение может быть дополнительно улучшено путем .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Службу визуализации неврологии в Медицинской школе Стэнфордского университета за предоставление оборудования и места для этого проекта. Это исследование было поддержано очным финансированием Стэнфордского института рака и отделения гинекологической онкологии Стэнфорда, а также GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 от Национального управления исследований, разработок и инноваций, Венгрия.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5% Трипсин-ЭДТА без фенола красного (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 вектор | Addgene | 3553 | |
| DMEM без фенола красный | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 8-луночные камеры LabTek #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-глютамин (200 мМ) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
Ссылки
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 3/14/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:
György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
Теги
