Методическая статья

Обнаружение накопления амилоидного β с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания на мышиной модели болезни Альцгеймера

DOI:

10.3791/62254

⸱

19 апреля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesiology, Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesia and Analgesia Application Technology and NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Narcotic and Psychotropic Drugs, Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В невропатологии болезни Альцгеймера одной из наиболее важных характеристик является отложение амилоид-β. В данном протоколе мы описываем метод иммунофлуоресцентного окрашивания у трансгенных мышей с 5×FAD для выявления накопления амилоидного β в бляшках. Процесс перфузии, криосекции, окрашивания и количественной оценки будет подробно описан.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Болезнь Альцгеймера (БА) — это нейродегенеративное заболевание, которое способствует развитию 60-70% деменции во всем мире. Одним из признаков болезни Альцгеймера, несомненно, является накопление амилоид-β (Aβ) в мозге. Aβ образуется в результате протеолитического расщепления белка-предшественника бета-амилоида (APP) β-секретазой и γ-секретазой. В патологических условиях повышенное β-расщепление АПП приводит к гиперпродукции Aβ, которая агрегируется в Aβ-бляшки. Поскольку бляшки Aβ являются характерной чертой патологии БА, обнаружение количества Aβ очень важно в исследованиях БА. В этом протоколе мы представляем метод иммунофлуоресцентного окрашивания для визуализации осаждения Aβ. Мышиная модель, используемая в наших экспериментах, — 5×FAD, которая несет пять мутаций, обнаруженных в семейной болезни Альцгеймера человека. Невропатологический и поведенческий дефицит мышей 5xFAD хорошо задокументирован, что делает его хорошей моделью для изучения патологии Aβ на животных. Мы внедрим процедуру, включающую транскардиальную перфузию, криосекцию, иммунофлуоресцентное окрашивание и количественную оценку для выявления накопления Aβ у мышей 5×FAD. С помощью этого протокола исследователи могут исследовать патологию Aβ на мышиной модели с болезнью Альцгеймера.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Болезнь Альцгеймера (БА) – это нейродегенеративное заболевание, которое вызывает 60-70% деменции во всем мире и требует больших социальных ресурсов1. Хорошо известно, что накопление амилоид-β (Aβ) является патологическим признаком болезни Альцгеймера. Белок-предшественник амилоида (APP) — это интегральный мембранный белок, который существует во многих тканях. Аβ-пептид, состоящий из 36-42аминокислот2, продуцируется последующим расщеплением β- и γ-секретазы в APP 3,4. Изменения в расщеплении APP и мутации в гене APP приводят к гиперпродукции Aβ. Молекулы Aβ могут агрегировать с образованием олигомеров или фибрилл, которые считаются нейротоксичными 5,6. В предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что накопление Aβ коррелирует с гибелью нейронов приБА 7,8,9.

Трансгенные мыши 5×FAD (C57BL/6J) содержат 3 мутации в APP и 2 мутации в PSEN1. Накопление внутриклеточного Aβ начинается уже в возрасте 1,5 месяца. Внеклеточное накопление Aβ было обнаружено примерно через 2 месяца в коре головного мозга и гиппокампе. Накопление быстро увеличивалось с10 годами. Хорошо задокументированная патология Aβ делает его хорошей моделью на животных для нашего протокола.

Целью описанного метода окрашивания является визуализация и количественная оценка отложения Aβ в мозге модели мышей с болезнью Альцгеймера. Будет введена процедура, включающая транскардиальную параформальдегидную перфузию, криосекцию, иммунофлуоресцентное окрашивание и количественное определение для выявления накопления Aβ у мышей 5×FAD. Этот протокол является надежным и простым методом исследования патологии Aβ на мышиной модели БА.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были проведены с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию Медицинского университета Сюйчжоу и в соответствии с руководящими принципами китайского правительства по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Перфузия мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о процедуре перфузии можно найти в видео из лаборатории Вильяма Шейна 11.

  1. Обезболить трансгенных мышей 5×FAD (C57BL/6J) 1% пентобарбитала натрия (50 мг/кг массы тела) путем внутрибрюшинного введения12,13. Потеря реакции на щипывание задних лап свидетельствует о правильной анестезии. Не приступайте к перфузии до тех пор, пока мышь не будет должным образом обезболиваена.
  2. С помощью четырех штифтов закрепите конечности на пенопластовой доске. Поместите брюшную полость мыши, находящейся под наркозом, вверх, при этом ее конечности должны быть адекватно вытянуты. С помощью ножниц для радужной оболочки глаза сделайте разрез на мечевидном отростке. Тогда диафрагма будет оголена.
  3. Хирургическими ножницами сделайте разрез на диафрагме, и осторожно продолжайте разрез диафрагмы до верхней границы грудной клетки. Разрежьте ребра и грудные мышцы, рассеките прикрепленные ткани, чтобы обнажить сердце.
  4. Найдите подходящий атриум мыши. Разрежьте правое предсердие с помощью ножниц для ирисов.
  5. Введите 20 мл PBS 37 °C (0,01 М, pH 7,2-7,4) из левого желудочка сердца для промывания крови. Затем медленно введите 20 мл 4% PFA комнатной температуры из левого желудочка для фиксации тканей. Скорость инъекции PBS и 4% PFA составляет около 5 мл/мин. Фиксирующий тремор должен наблюдаться в течение нескольких секунд.
    ВНИМАНИЕ: 4% PFA может раздражать глаза и дыхательные пути, а также может спровоцировать аллергические реакции. Этот шаг следует делать в проветриваемых местах, а оператор должен быть одет в защитные очки и маски для лица.
  6. С помощью хирургических ножниц отрежьте голову, а затем аккуратно удалите черепную коробку, используйте рассекающие щипцы и извлеките мозг. Затем погрузите мозг в 4 мл 4% PFA в пластиковую пробирку объемом 5 мл на 12-24 часа при 4 °C.

2. Встраивание и криосекция

  1. После фиксации в 4% PFA перенесите мозг в 4 мл 15% сахарозы в пластиковой пробирке объемом 5 мл при температуре 4 °C. Через 12-24 ч мозг должен опуститься на дно.
  2. Перенесите мозг в 4 мл 30% сахарозы в пластиковую пробирку объемом 5 мл при температуре 4 °C в течение 12-24 часов. Затем мозг готов к встраиванию. Целью ступенчатого замачивания 15% и 30% сахарозы является обезвоживание мозга, что позволяет избежать образования кристаллов льда внутри клеток во время встраивания и криосекции. Обезвоженный мозг может храниться при температуре 4°C в течение одной недели.
  3. Оставьте примерно 1 мл сахарозы вместе с мозгом в трубке. Затем добавьте в трубку такой же объем состава оптимальной температуры резки (OCT) и хорошенько перемешайте. Это помогает ОКТ-соединению более адекватно оборачивать мозг.
  4. Нанесите толстый слой ОКТ-соединения на поверхность ручки и заморозьте при -21 °C перед криосекцией. Разрежьте мозг сагиттально от середины; Используйте обе половины для разрезания в криостате.
  5. После того как ОКТ-соединение застынет, установите ручку на головку образца и вдавите ее в поверхность платформы. Положите одну половину мозга на обрезанную поверхность средней стороной вниз.
  6. Наденьте кольцо из фольги вокруг мозга, чтобы избежать утечки соединения ОКТ, а затем заполните кольцо соединением ОКТ до тех пор, пока мозг не будет погружен в воду. Когда закладка OCT компаунда затвердевает, она готова к резке.
  7. Установите толщину сечения равной 20 мкм. Установите температуру камеры на -21 °C, а температуру головки образца на -19 °C. Разрез мозга от рострального конца до каудального конца.
  8. Нанесите немного PBS на предметные стекла. Предварительно покройте стекла полилизином, чтобы предотвратить отслаивание секций. Прикрепите секцию к предметному стеклу. Если секция сложена, используйте мягкую щетку, чтобы развернуть секции с помощью PBS.
  9. Просушите срезы в течение ночи при комнатной температуре и храните при температуре -20 °C. Срезы можно хранить при температуре -20 °C в течение одного месяца до окрашивания Aβ.

3. Процедура окрашивания Aβ

  1. Прогрейте срезы при комнатной температуре, высушите поверхность предметного стекла и с помощью гидрофобной ручки нарисуйте круг вокруг среза для инкубации антител.
  2. Замочите предметное стекло в PBS в пластиковой коробке для окрашивания объемом 30 мл, чтобы смыть ОКТ-соединение. Используйте не менее 20 мл PBS.
  3. Добавьте на предметное стекло 100 мкл 1x раствора для извлечения антигена для замороженных срезов. Выдерживать 5 минут при комнатной температуре.
  4. Промыть раствор для извлечения не менее чем 20 мл PBS комнатной температуры 3 раза (по 5 минут на каждый).
  5. Разбавленное первичное антитело (6E10) добавить на срезы и инкубировать при 4 °C в течение 16-24 ч во влажном темном боксе (раствор для разведения первичного антитела: 1% BSA, 0,3% Triton X-100, 0,01% азид натрия в PBS, разведение 1:500). BSA функционирует как блокирующий агент.
  6. Промойте секции PBS 3 раза, каждый раз по 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте шаги 3.7, 3.8 и 3.9 в темном месте.
  7. Инкубируйте срезы во вторичном растворе антител (Goat anti-Mouse IgG (H+L) Alexa Flour 594, разбавленном PBS 1:200) в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной темной коробке.
  8. Смойте вторичное антитело со срезов не менее чем 20 мл PBS в течение 3 раз, каждый раз по 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не наливайте PBS на секции во время стирки, чтобы предотвратить отклеивание секций. Следите за тем, чтобы секции были влажными.
  9. Впитайте жидкость вокруг секций и добавьте каплю монтажного материала на каждую секцию. Загерметизируйте секции покровным стеклом, не допуская образования пузырей.
  10. Рассмотрите окрашенные срезы с помощью флуоресцентного микроскопа. Поддерживайте неизменность параметров изображения, чтобы избежать деривации. Храните предметные стекла при температуре 4°C в темном месте. Анализируйте срезы в течение одной недели, так как окрашивание со временем потускнеет.

4. Визуализация и количественная оценка накопления Aβ с помощью ImageJ

  1. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа, подключенного к цифровой камере и программному обеспечению для обработки изображений. Мы использовали программное обеспечение Image Pro Plus, и параметр визуализации был установлен следующим образом: Exp Pvw: 450 мс, Exp Acq: 450 мс; Pvw: 1 × 1, Acq: 1 × 1; Разрешение Pvw: ширина 1 × высота 1, разрешение acq: ширина 1 × высота 1; Глубина захвата: 8-битное моно; Усиление: Pvw: 13, Acq: 13, Gamma: Pvw: 1, ACQ: 1, Offse: Pvw: -700, ACQ: -700.
  2. В ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji) выберите Плагины | Сшивание | MosaicJ в меню. Затем выберите Файлы | Откройте Image Sequence , чтобы открыть изображения, которые нужно сшить (Рисунок 1A).
  3. Все выбранные изображения будут отображаться внизу. После сшивания изображений вручную выберите Файл | Создайте мозаику (рисунок 1B, C, D).
  4. Выбрать изображение | Настройка | Яркость/Контрастность ..., и отрегулируйте яркость и контрастность изображения (рис. 3A). После этого изображение можно сохранить (рис. 1E).
  5. Чтобы количественно оценить накопление Aβ, откройте изображение через Файл | Открытый... в меню (рисунок 2A).
  6. Выбрать изображение | Тип | 8-бит для настройки изображения до 8-бит. Затем выберите область, которую необходимо подсчитать, с помощью выделения полигона (Рисунок 2B).
  7. Выбрать изображение | Настройка | Threshold для выбора правильного порога сигналов. Порог можно настроить с помощью перетаскивания полос прокрутки или изменить числа непосредственно в текстовом поле (максимум: 255, минимум: 0). Когда все сигналы Aβ в разделе стали красными, порог подходит для измерения (Рисунок 2C). Убедитесь, что установлен флажок «Темный фон».
  8. Выбор команды «Анализ» | Установите мерку... В меню выбрать параметры, которые будут отображаться в результатах. Убедитесь, что выбраны параметры Интегрированная плотность и предел порогового значения . Целью измерения является интегральная плотность (общая интенсивность) (рисунок 2D).
  9. Выберите «Анализ» | Измерьте , чтобы получить результаты. Результаты будут отображены и готовы к статистическому анализу (Рисунок 2E).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью описанных выше процедур иммунофлуоресцентного окрашивания мы исследовали отложение накопления Aβ у мышей разного возраста с 5×FAD. На рисунке 3 представлены типичные и неоптимальные результаты с использованием нашего протокола. Срезы мозга 5×месячных и 8-месячных гетерозиготных трансгенных мышей 5FAD и 4-6-месячного контроля дикого типа окрашивали антителами 6E10 и детектировали под флуоресцентным микроскопом. На рисунке 3А показано накопление Aβ в бля...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием антител 6E10 может специфически обнаруживать накопление Aβ в мозге, которое легко количественно определить с помощью изображения J. Стоит отметить, что некоторые важные шаги в этом протоколе могут повлиять на результаты.

Чтобы предотвратить отслаивание или поломку срезов, показанных на рисунке 3C, следует обратить внимание на несколько ключевых моментов. Перфузия должна протекать б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано общим проектом Фонда естественных наук Китая (номер гранта: 81974157) от Фонда естественных наук Китая, специальной назначенной профессорской должностью Цзянсу (до C.L.) от Департамента образования Цзянсу, программой инновационных и предпринимательских команд провинции Цзянсу (для H.Z., A. L., W.W., C.L. и Y.S.), стартовым грантом для выдающихся талантов (D2019025) и Программой обучения инновациям и предпринимательству (201910313038Z до Z.S., Y.X., M.Z. и J.D.) в Медицинском университете Сюйчжоу. Это исследование также было поддержано Национальным демонстрационным центром экспериментального базового медицинского образования (Медицинский университет Сюйчжоу).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильный>Анестетия
Инъекционный шприцKLMEDICAL1 мл
Пентобарбитуал натрияSigma-AldrichP37611% в физрастворе для внутривенного введения
<сильная>Торакотомия:
IRIS-Fine Прямые ножницы радужной оболочки глаза (~11,5 см)RWDS12010-11
Острые изогнутые хирургические ножницы (11,5 см)RWDS14016-11
Прямые рассекающие щипцы (~10,5 см)RWDF12010
Perfusion
центробежная трубка (5 мл)для
KLMEDICAL20 мл
ПараформальдегидVicmedVIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) порошокVicmedVC2001PДобавить деионизированную воду для приготовления раствора
Fixation, Dehydration and Cryosectionation
адгезионные предметные стекла микроскопаCITOTEST18810576,2 мм × 25,4 мм
Microtome CryostatLEICACM1950
Компаунд оптимальной температуры резки (ОКТ)Sakura Finetek4583
СахарозаVETECV900116
<сильный>Иммунофлуоресцентное окрашивание
флуоресцентный микроскопOLYMPUSIX-81
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11005200X
Image-Pro Plus 7.0CMedia КибернетикаНаучное программное обеспечение для построения графиков и анализа данных
Иммуногистохимический влажный бокс (черный)SinylabCustom300 мм × 100 мм × 38 мм, глубина канавки 27 мм, может содержать 10 стандартных наконечников
Неплохое предложение
Пластиковая коробка для окрашиванияSinylabCustom30 мл, может содержать 5 стандартных слайдов
Первичный буфер для разведения антителсделанный в нашей лаборатории1% BSA 1 г, 0,3% Triton X-100 300 мкл, 0,01% азид натрия 10 мг в 100 мл PBS
Очищенный антибета-амилоид, 1-16 антитело (6E10)BiolegendSIG-39320500X
Быстрое извлечение антигена для замороженных РазделыKeyGEN BioTECHKGIHC0055X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1GraphpadПрограммное обеспечение для медицинского картографирования
Image J Fiji 2.0.0Национальный институт здравоохраненияПрограммное обеспечение для научного построения графиков и анализа данных
Шприц инъекций Biosharp для пипетки Pipet Thermo Scientific ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burns, A., Iliffe, S. Alzheimer's disease. BMJ. 338, 158(2009).
  2. Leong, Y. Q., Ng, K. Y., Chye, S. M., Ling, A. P. K., Koh, R. Y. Mechanisms of action of amyloid-beta and its precursor protein in neuronal cell death. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 11-30 (2020).
  3. Tiwari, S., Atluri, V., Kaushik, A., Yndart, A., Nair, M. Alzheimer's disease: pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. International Journal of Nanomedicine. 14, 5541-5554 (2019).
  4. Murphy, M. P., LeVine, H. Alzheimer's disease and the amyloid-beta peptide. Journal of Alzheimer's Disease. 19 (1), 311-323 (2010).
  5. Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256 (5054), 184-185 (1992).
  6. Reitz, C. Alzheimer's disease and the amyloid cascade hypothesis: a critical review. International Journal of Alzheimer's Disease. 2012, 369808(2012).
  7. Bozyczko-Coyne, D., et al. CEP-1347/KT-7515, an inhibitor of SAPK/JNK pathway activation, promotes survival and blocks multiple events associated with Abeta-induced cortical neuron apoptosis. Journal of Neurochemistry. 77 (3), 849-863 (2001).
  8. Canevari, L., Abramov, A. Y., Duchen, M. R. Toxicity of amyloid beta peptide: tales of calcium, mitochondria, and oxidative stress. Neurochemical Research. 29 (3), 637-650 (2004).
  9. Zhu, X., et al. Oxidative stress signalling in Alzheimer's disease. Brain Research. 1000 (1-2), 32-39 (2004).
  10. Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  12. An, S., et al. Medial septum glutamatergic neurons control wakefulness through a septo-hypothalamic circuit. Current Biology. , (2021).
  13. Cao, J. L., et al. Activation of peripheral ephrinBs/EphBs signaling induces hyperalgesia through a MAPKs-mediated mechanism in mice. Pain. 139 (3), 617-631 (2008).
  14. Ly, P. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. Journal of Visualized Experiments. (53), e2831(2011).
  15. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
  16. Hatami, A., Albay, R., Monjazeb, S., Milton, S., Glabe, C. Monoclonal antibodies against Abeta42 fibrils distinguish multiple aggregation state polymorphisms in vitro and in Alzheimer disease brain. Journal of Biological Chemistry. 289 (46), 32131-32143 (2014).
  17. Shi, X. Z., Wei, X., Sha, L. Z., Xu, Q. Comparison of beta-Amyloid Plaque Labeling Methods: Antibody Staining, Gallyas Silver Staining, and Thioflavin-S Staining. Chinese Medical Sciences Journal. 33 (3), 167-173 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

5xFAD
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи