Method Article

Эффективный по времени анализ на основе флуоресцентной спектроскопии для оценки статуса полимеризации актина в тканях мозга грызунов и человека

DOI:

10.3791/62268

⸱

June 3rd, 2021

 , 
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сообщаем о простом, эффективном по времени и высокопроизводительном флуоресцентном спектроскопии анализе для количественной оценки актиновых нитей в биологических образцах ex vivo из тканей мозга грызунов и людей.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Актин, основной компонент цитоскелета, играет решающую роль в поддержании структуры и функции нейронов. При физиологических состояниях актин возникает в равновесии в двух его формах: мономерной глобулярной (G-актин) и полимеризованной нитевидной (F-актин). На синаптических терминалях актиновый цитоскелет образует основу для критических пре- и постсинаптических функций. Кроме того, динамические изменения в статусе полимеризации актина (взаимопревращение между глобулярной и нитевидной формами актина) тесно связаны с пластичными изменениями в синаптической структуре и функции. Здесь мы сообщаем о модифицированной методологии на основе флуоресценции для оценки статуса полимеризации актина в условиях ex vivo. В анализе используется флуоресцентно меченый фаллоидин, фаллотоксин, который специфически связывается с актиновыми нитями (F-актин), обеспечивая прямую меру полимеризованного нитевидного актина. В качестве принципиального доказательства мы предоставляем доказательства пригодности анализа как у грызунов, так и у гомогенатов ткани мозга человека. Используя латрункулин А (препарат, который деполимеризует актиновые нити), мы подтверждаем полезность анализа для мониторинга изменений уровня F-актина. Далее мы распространяем анализ на биохимические фракции изолированных синаптических терминалей, в которых мы подтверждаем повышенную полимеризацию актина при стимуляции деполяризацией с высоким внеклеточнымK+.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Актин цитоскелетного белка участвует в нескольких клеточных функциях, включая структурную поддержку, клеточный транспорт, подвижность и деление клеток. Актин встречается в равновесии в двух формах: мономерный глобулярный актин (G-актин) и полимеризованный нитевидный актин (F-актин). Быстрые изменения в статусе полимеризации актина (взаимоконверсия между его G- и F-формами) приводят к быстрой сборке и разборке нитей и лежат в основе его регуляторных ролей в клеточной физиологии. Актин образует основной компонент нейрональной цитоскелетной структуры и влияет на широкий спектр нейронных функций1,2. Следует отметить, что актин цитоскелет является неотъемлемой частью структурной платформы синаптических терминалей. Таким образом, он является основным детерминантом синаптического морфогенеза и физиологии и играет фундаментальную роль в контроле размера, количества и морфологии синапсов3,4,5. В частности, динамическая полимеризация-деполимеризация актина является ключевым фактором, определяющим синаптическое ремоделирование, связанное с синаптической пластичностью, лежащей в основе процессов памяти и обучения. Действительно, как пресинаптические (такие как высвобождение нейромедиаторов6,7,8,9,10),так и постсинаптические функции (пластичность, связанная с динамическим ремоделированием11,12,13,14)критически полагаются на динамические изменения статуса полимеризации актинового цитоскелета.

В физиологических условиях уровни F-актина динамически и жестко регулируются через мультимодальный путь, включающий посттрансляционную модификацию4,15,16, а также актин-связывающие белки (ABP)4,17. ABP могут влиять на динамику актина на нескольких уровнях (таких как инициирование или ингибирование полимеризации, индуцирование ветвления нити, разрыв нитей на более мелкие кусочки, содействие деполимеризации и защита от деполимеризации) и, в свою очередь, находятся под строгим модулирующим контролем, чувствительным к различным вне- и внутриклеточным сигналам18,19,20. Такие регуляторные проверки на нескольких уровнях диктуют строгую регуляцию динамики актина в синаптическом цитоскелете, тонкую настройку пред- и постсинаптических аспектов физиологии нейронов как в базальном, так и в индуцированном активностью состояниях.

Учитывая важную роль актина в физиологии нейронов, неудивительно, что несколько исследований предоставили доказательства изменений в динамике актина как критических патогенных событий, связанных с широким спектром неврологических расстройств, включая нейродегенерацию, психологические заболевания, а также заболевания нервного развития3,21,22,23,24,25,26,27. Однако, несмотря на богатство исследовательских данных, указывающих на ключевую роль актина в физиологии нейронов и патофизиологии, в понимании динамики актина, особенно в синаптическом цитоскелете, все еще остаются значительные пробелы. Необходимы дополнительные исследования, чтобы лучше постить нейрональный актин и его изменения в патологических условиях. Одним из основных направлений деятельности в этом контексте является оценка статуса полимеризации актина. Существуют коммерческие наборы на основе вестерн-блоттинга (биохимический набор для анализа G-Actin/F-Actin in vivo; Цитоскелет SKU BK03728,29) и самодельные анализы для оценки уровня F-актина6. Однако, поскольку они требуют биохимической изоляции F-актина и G-актина и поскольку их последующая количественная оценка основана на протоколах иммуноблоттинга, они могут занять много времени. Здесь мы сообщаем об анализе на основе флуоресцентной спектроскопии, адаптированном из предыдущего исследования30 с модификациями, которые могут быть использованы для оценки как базальных уровней F-актина, так и динамических изменений в его сборке-разборке. Примечательно, что мы эффективно модифицировали оригинальный протокол, который требует образцов, подходящих для кюветы 1 мл, в текущем формате пластины с 96 скважинами. Таким образом, модифицированный протокол значительно уменьшил количество ткани/ образца, необходимое для анализа. Кроме того, мы предоставляем доказательства того, что протокол подходит не только для гомогенатов мозговой ткани, но и для субклеточных фракций, таких как изолированные синаптические терминали (синаптосомы и синаптоневросомы). Наконец, анализ может быть использован для свежепропарированных тканей мозга грызунов и длительно хранящихся посмертных образцов человеческого мозга. Следует отметить, что, хотя анализ представлен в нейронном контексте, он может быть соответствующим образом распространен на другие типы клеток и физиологические процессы, связанные с ними.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с регламентом Комитета по этике в уходе за лабораторными животными и их использовании Университетом Отаго (Ethics Protocol No. AUP95/18 и AUP80/17) и законодательный орган Новой Зеландии. Ткани головного мозга человека были получены из Банка неврологических тканей больницы Clínic-IDIBAPS BioBank в Барселоне, Испания. Все протоколы сбора тканей были одобрены Комитетом по этике больницы Клиник, Барселона, и было получено информированное согласие от семей.

1. Подготовка буферов и реагентов

  1. Подготовьте следующие буферы для гомогенизации мозговой ткани и получения обогащенной фракции синаптических терминалей:
    Буфер гомогенизации: 5 мМ HEPES, рН 7,4 с добавлением 0,32 М сахарозы
    Буфер ресуспенсии: 5 мМ Трис, рН 7,4 с добавлением 0,32 М сахарозы
    Буфер для стирки: 5 мМ Tris, pH 8,1
    1,2 млн сахарозы
    1,0 М сахарозы
    0,85 М сахарозы
  2. Добавьте домашнюю или коммерческую смесь ингибиторов протеазы и фосфатазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали без ЭДТА версию смеси complete Protease Inhibitor (1 таблетка на буфер 10 мл) и коктейль ингибитора фосфатазы IV (1:100; объем: объем).
  3. Подготовьте следующие буферы и реагенты для фиксации, пермеабилизации и связывания фаллоидина:
    Буфер Кребса: 118,5 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ MgCl2,2 мМ CaCl2,0,1 мМ KH2PO4,5 мМ NaHCO3,10 мМ глюкозы, 20 мМ HEPES, рН 7,4
    1 млн кКл
    25% глутаровый альдегид (стоковый раствор)
    Буфер Кребса, содержащий 0,1 % тритона X-100 и 1 мг/мл NaBH4
    400x Alexa Fluor 647 Фаллоидин в DMSO
    Буфер Кребса, содержащий 0,32 М сахарозы
    50 мкМ латрункулина А в ДМСО (стоковый раствор)
    1 M KCl (стоковое решение)
    ВНИМАНИЕ: Фаллоидин токсичен (LD50 = 2 мг/кг) и с ним следует обращаться осторожно. Вдыхание глутарового альдегида токсично, и его следует обрабатывать в вытяжном капюшоне.
  4. Хранить буферы при 4 °C и фаллоидин и латрункулин A при -20 °C для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное хранение буферов не рекомендуется. Здесь протокол можно приостановить.

2. Гомогенизация мозговой ткани

  1. Гомогенизируйте криоконсервированную или свежерассеченную ткань мозга крысы в 10 объемах буфера гомогенизации в стекляннойтрубке Potter-Elvehjem и пестике на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная гомогенизация достигается 15-20 ударами пестиком вручную по тканям головного мозга. Успешная гомогенизация может быть подтверждена плавным протекания суспензии через стеклянную трубку. Здесь протокол можно приостановить.
  2. Определить концентрацию белка в гомогенате с помощью брэдфордского анализа31.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут использоваться альтернативные домашние или коммерческие анализы для оценки белка.
  3. Разбавляют гомогенатные образцы в буфере Кребса в концентрации 2-3 мг белка/мл в объеме 50 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых наших экспериментах мы инкубируем гомогенаты с 2 мкМ латрункулина А или ДМСО (контроль) при 37 °C в течение 1 ч. Для этого гомогенаты повторно суспендируют в 48 мкл буфера Кребса и добавляют 2 мкл 50 мкМ латрункулина А или 2 мкл ДМСО. Далее для иммуноблоттинга после инкубации собирают небольшое количество образца (10 мкг).
  4. Зафиксируйте однородные образцы (раздел 5).

3. Подготовка изолированных нервных терминалей

  1. Препарат синаптосом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также могутбытьиспользованы альтернативные протоколы32, 33 для синаптосом.
    1. Центрифуга мозга гомогенатная при 1,200 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    2. Выбросьте гранулу, которая является сырой ядерной фракцией.
    3. Далее центрифугируют супернатант (S1), полученный на этапе 3.1.1 при 12 000 х г в течение 15 мин при 4°С.
    4. Удалите супернатант (S2), который является растворимой цитозольной фракцией.
    5. Повторное суспендирование гранулы (Р2), полученной на этапе 3.1.3, которая представляет собой сырую синаптосомальную фракцию в буфере ресуспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера повторного суспензии зависит от количества исходной ткани и количества полученной гранулы. Например, при запуске со 150-300 мг тканей головного мозга полученную гранулу можно повторно суспендовать в 200 мкл буфера повторного суспензии.
    6. Загрузите повторно суспендированные сырые синаптосомы на прерывистый градиент сахарозы равных объемов 0,85-1,0-1,2 М сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используем по 1 мл каждого раствора сахарозы (для ткани 150-300 мг). Это может быть изменено в соответствии с большим количеством тканей. Прерывистые градиенты могут быть сделаны с помощью шприца 25G, прижатого к внутренней стенке ультрацентрифужной трубки и мягкого наслоения слоев сахарозы.
    7. Центрифуга при 85 000 х г в течение 2 ч при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой скорости центрифугирования требуется ультрацентрифуга, способная создавать вакуум для уменьшения нагрева.
    8. Соберите синаптосомальную фракцию на границе раздела между 1,0 и 1,2 М сахарозы с помощью наконечника пипетки 200 мкл.
    9. Промыть синаптосомальную фракцию ледяным моющим буфером центрифугированием при 18 000 х г в течение 10 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для промывки синаптосомальную фракцию, полученную на границе раздела 1,0 и 1,2 М сахарозы, собирают в свежей пробирке объемом 1,5 мл, и добавляют равный объем промывного буфера, обеспечивающего удаление высокого сахарозы из среды.
    10. Снова промыть синаптосомальную гранулу с буфером гомогенизации ледяного холода при 12 000 г в течение 10 минут при 4 °C.
    11. Повторное суспендирование синаптосом в буфере гомогенизации на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно ненадолго приостановить.
    12. Определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
    13. Повторное суспендировать синаптосомы в буфере Кребса в концентрации 2-3 мг белка/мл в объеме 50 мкл (47,5 мкл, если синаптосомы должны быть деполяризованы KCl; см. раздел 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для повторного суспензии синаптосомальную фракцию сначала прячат при 12 000 х г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют супернатант (буфер). Затем синаптосомальная гранула повторно суспендируется в буфере Кребса путем бережного пипетирования с использованием наконечника пипетки 200 мкл.
    14. Приступайте к деполяризации (раздел 4).
  2. Препарат синаптоневросом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также могутбытьиспользованы альтернативные протоколы34, 35 для синаптоневросом.
    1. Пропустите гомогенат мозга через предварительно смаченный чистый фильтр размером пор 100 мкм в фильтродержатель с помощью шприца объемом 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное смачивание всех фильтров важно для предотвращения потери образца и должно осуществляться с использованием буфера гомогенизации. Для этого буфер гомогенизации пропускают через фильтры в фильтродержателе с помощью шприца 1 мл до тех пор, пока буфер не вытечет наружу.
    2. Соберите фильтрат (F1) в предварительно охлажденный 1,5 мл пробирку на льду.
    3. Повторите процесс (этапы 3.2.1 и 3.2.2) для фракции F1 для получения второго фильтрата (F2).
    4. Пропустите фильтрат F2 через чистый фильтр размером пор 5 мкм.
    5. Соберите фильтрат (F3) в предварительно охлажденный на льду пробирку размером 1,5 мл.
    6. Фильтрат центрифуги F3 при 1 500 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    7. Повторно суспендировать гранулы (синаптоневосомы) в буфере Кребса на льду в концентрации 2-3 мг белка/мл в объеме 50 мкл (47,5 мкл, если синаптосомы должны быть деполяризованы KCl; см. раздел 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно ненадолго приостановить.
    8. Оцените концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
    9. Приступайте к деполяризации (раздел 4).

4. KCl-опосредовленная деполяризация изолированных синаптических терминалей

  1. Уравновешивают синаптосомы/синаптоневросомы при 37 °C в течение 5-10 мин.
  2. Стимулируют синаптосомы/синаптоневросомы путем добавления KCl для увеличения внеклеточногоK+ до 50 мМ в течение 30 с при 37 °C и добавления равного объема буфера Кребса к соответствующему нестимулированному контрольному набору.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, добавить 2,5 мкл 1 МКл к синаптосомам, повторно суспендированным в 47,5 мкл буфера Кребса; и добавить 2,5 мкл буфера Кребса к соответствующей нестимулированной контрольной синаптосоме. Для экспериментов, в которых задействовано большое количество образцов, приступайте к не более чем 2 образцам одновременно, чтобы время деполяризации не превышало 30 с.
  3. Прекратить стимуляцию добавлением глутаральдегида (раздел 5).

5. Фиксация и окрашивание фаллоидином образцов

  1. Добавляют глутаровый альдегид в гомогенатные/синаптосомальные/синаптоневосомные образцы до конечной концентрации 2,5% в течение 2-3 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы добавили 6 мкл 25% раствора глутаральдегида таким образом, чтобы конечная концентрация глутарового альдегида в образцах 50 мкл (гомогенаты/синаптосомы/синаптоневросомы) составляла около 2,5%. Фиксация имеет решающее значение и должна быть быстрой и, следовательно, сразу после добавления глутарового альдегида образец должен быть энергично вихрево.
  2. Отстой образцы по 20 000 х г в течение 5 мин.
  3. Удалите супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбросьте супернатант в вытяжку, так как глутаровый альдегид токсичен.
  4. Пермеабилизируют гранулы путем ресуспенсии в 100 мкл буфера Кребса, содержащего 0,1% тритона Х-100 и 1 мг/мл NaHB4 в течение 2-3 мин при комнатной температуре.
  5. Отстой образцы по 20 000 х г в течение 5 мин.
  6. Удалите буфер пермеабилизации.
  7. Промыть гранулу 200 мкл буфера Кребса центрифугированием при 20 000 х г в течение 5 мин.
  8. Повторно суспендировать и окрасить гранулу 1x фаллоидином Alexa Fluor 647 (соответствующим 500 мкЕД) в 100 мкл буфера Кребса в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие разновидности флуоресцентных аналогов фаллоидина коммерчески доступны и могут быть заменены для анализа. Концентрация фаллоидина и общий объем образца инкубации, возможно, должны быть изменены в соответствии с количеством и типом тестируемой ткани/образца, и оптимальные условия должны быть соответствующим образом стандартизированными.
  9. Центрифугировать окрашенные образцы при 20 000 х г в течение 5 мин.
  10. Удалить несвязанный фаллоидин (супернатант).
  11. Промыть образец 200 мкл буфера Кребса центрифугированием при 20 000 х г в течение 5 мин.
  12. Ресуспенд в 200 мкл буфера Кребса, содержащего 0,32 М сахарозы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно ненадолго приостановить.

6. Флуорометрический анализ и рассеяние света

  1. Дозировать образцы Alexa Fluor 647, окрашенные фаллоидином, в черную 96-колодезную пластину.
  2. Измерьте интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 645 нм и длине волны излучения 670 нм в пластинчатом считывателе при комнатной температуре.
  3. Перенесите образцы с черной 96-скважинной пластины на прозрачную 96-скважинную пластину с помощью наконечников пипетки 200 мкл.
  4. Измерьте рассеяние света при 540 нм, чтобы скорректировать любые потери, которые могли произойти на предыдущих этапах фиксации, пермеабилизации и окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различия в биологическом материале, сохраняемом в окрашенных образцах, могут быть более заметными для меньших количеств исходного материала (см. Обсуждение).
  5. Включите набор фаллоидина Alexa Fluor 647 в буфер Кребса в различных концентрациях (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x и 1x, соответствующих 25, 50, 125, 175, 250, 375 и 500 мкУ) для каждой партии анализа в качестве стандартной кривой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный шаг и не влияет на результаты анализа, особенно когда уровни F-актина выражаются относительным образом (раздел 7). Здесь протокол можно приостановить.

7. Анализ данных

  1. Количество F-актина в образцах прямо пропорционально интенсивности флуоресценции связанного фаллоидина. Экспресс в абсолютном выражении единицы связанного фаллоидина, вычисляемого из линейной кривой помеченного стандарта фаллоидина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера см. рисунки 2A-B, 3A, 4A-B и дополнительный рисунок 2.
  2. Экспресс-уровни F-актина в виде доли контрольных образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера см. рисунки 5A-B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Линейность анализа для оценки уровней F-актина
Сначала была установлена стандартная кривая линейного увеличения флуоресценции фаллоидина Alexa Fluor 647, которая повторялась для каждой области экспериментов(рисунок 1). Для исследования линейного диапазона анализа были обработаны различные количества гомогенатов мозга от грызунов(рисунки 2A и 2B)и посмертных людей(рисунок 3A и 3B). Анализ оказ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ, описанный здесь, по существу адаптированный из предыдущего исследования30 с модификациями, использует фаллотоксин, фаллоидин, помеченный флуоресцентной меткой. Флуоресцентные аналоги фаллоидина считаются золотым стандартом окрашивания актиновых нитей в фиксированных тканях47,48,49. Фактически, они являются старейшими инструментами для конкретной идентификации актиновыхнитей 50

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Неврологическим фондом Новой Зеландии (1835-PG), Новозеландским советом по исследованиям в области здравоохранения (#16-597) и кафедрой анатомии Университета Отаго, Новая Зеландия. Мы в долгу перед Банком неврологических тканей HCB-IDIBAPS BioBank (Испания) для тканей головного мозга человека. Мы благодарим Цзясянь Чжан за помощь в записи и редактировании видео.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3,5 мл, толстостенная поликарбонатная трубка с открытым верхомBeckman Coulter349622Для градиентного центрифугирования (подготовка синаптосом)
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287F-актин специфический лиганд
Антитела против   b-актинSanta CruzBiotechnology Sc-47778Для оценки общего уровня актина с помощью иммуноблоттинга
Антитела против GAPDHAbcamAb181602Для оценки уровня GAPDH с помощью иммуноблоттинга
Bio-Rad Protein Analysis, концентрат красителяBio-Rad5000006оценка белка на основе Брэдфорда
Дигидрат хлорида кальция (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC3306Krebs буферный компонент
cOmplete, Mini, коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАSigma-Aldrich4693159001Для ингибирования активности эндогенной протеазы во время пробоподготовки
Corning 96-луночный прозрачный полистирол с плоским дномCorning3596Для измерений светорассеяния
D-(+)-глюкозаSigma-AldrichG8270Krebs буферный компонент
ДиметилсульфоксидSigma-AldrichD5879Растворитель для фаллоидина и латрункулина
Флуоресцентный планшетный сканер (инфракрасный сканер Odyssey)Li-Cor BiosciencesДля обнаружения иммунореактивных сигналов на иммуноблотах
Раствор глутаральдегида (25% в воде) Grade IISigma-AldrichG6257Фиксатор
HEPESSigma-AldrichH3375Буферный ингредиент для пробоподготовки и буферный компонент Krebs
Латрункулин АSigma-AldrichL5163Деполимеризатор актиновых нитей
Гексагидрат хлорида магния (MgCl2· 6H2O)Sigma-AldrichM2670Krebs буферный компонент
Микропластины
Mitex мембранный фильтр 5 ммMilliporeLSWP01300Препарат синаптонейросом
Nunc F96 MicroWell Black PlateThermo Fisher Scientific237105Для флуориметрических измерений
Фильтр нейлоновая сетка 100 ммMilliporeNY1H02500Приготовление синаптоневрозом
Ингибитор фосфатазы Коктейль IVAbcamab201115Для ингибирования активности эндогенной фосфатазы во время пробоподготовки
Хлорид калия (KCl)Sigma-AldrichP9541Буферный компонент Кребса и для деполяризации синаптических окончаний
Фосфат калия одноосновной ((KH2PO4 )Sigma-AldrichP9791Компонент буфера Кребса
борогидрид натрия (NaBH4)Sigma-Aldrich71320Компонент буфера пермеабилизации
хлорид натрия (NaCl)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944Компонент буфера Кребса
гидрокарбонат натрия (NaHCO3)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL900Буферный компонент Кребса
SpectraMax i3xМолекулярные приборыДля флуориметрических измерений
СахарозаFisher ChemicalS/8600/60Буферный ингредиент для пробоподготовки
Swimnex Держатель фильтраMilliporeSx0001300Препарат синаптонейросом
Измельчитель тканей 5 мл Potter-ElvehjemDuran Wheaton Kimble358034Для гомогенизации тканей
Triton X-100Sigma-AldrichX100Компонент буфера для пермеабилизации
База TrizmaSigma-AldrichT6066Буферный ингредиент для пробоподготовки

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381(2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908(2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992(2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647(2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009(2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119(2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492(2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118(2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin PolymerizationFluorescence SpectroscopyF Actin QuantificationBrain Tissue AssayPhalloidin StainingSynaptic TerminalsSynaptosome PreparationLatrunculin AHigh Throughput Assay96 Well Plate

Related Articles