Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия динамики кальция в острых срезах ткани поджелудочной железы мыши

Поджелудочная железа млекопитающих представляет собой крупную экзокринную и эндокринную железу. Экзокринная часть составляет 96-99% от общего объема поджелудочной железы и состоит из ацинушек и протоков. Эндокринная часть состоит из большого количества островков Лангерганса, составляющих оставшиеся 1-4% от общего объема поджелудочной железы¹. Экзокринная часть выделяет основные пищеварительные ферменты, которые расщепляют богатые энергией полимеры в пище, а также богатую бикарбонатами жидкость, которая соединяется с другими желудочно-кишечными выделениями, чтобы обеспечить среду, подходящую для действия ферментов. Эндокринная часть выделяет гормоны, которые регулируют постпрандиальное распределение, хранение и межпрандиальное высвобождение богатых энергией питательных веществ. Хотя экзокринная ткань относительно недоразвита, а эндокринная относительно хорошо развита при рождении, первая быстро перерастает вторую при отлучении^от груди ^2,3,4. Ранние исследования функции поджелудочной железы ознаменовали рождение современной физиологии, и за основными методологическими достижениями в этой области последовали крупные научные прорывы⁵. Работа с поджелудочной железой технически сложна из-за сложной структуры железы, но также является большой мотивацией из-за таких заболеваний, как рак поджелудочной железы, панкреатит и диабет, которые представляют серьезную угрозу для общественного здравоохранения и для которых необходимы новые терапевтические подходы.

Изолированные островки⁶, ацины ^7,8 и фрагменты протоков разрабатывались и использовались в течение десятилетий в качестве методов золотого стандарта благодаря их преимуществам по сравнению с клеточными линиями и первичными диспергированными эндокринными, ацинарными и протоковыми клетками ^9,10. Несмотря на заметно улучшенную функцию изолированных клеточных коллективов, эти методы по-прежнему сопряжены со значительным механическим и ферментативным напряжением, изолируют клетки от окружающих тканей и, таким образом, не имеют паракринных взаимодействий и механической поддержки, и, самое главное, сопровождаются значительными изменениями нормальной физиологии ^11,12,13 . Острый срез ткани поджелудочной железы мыши был разработан в 2001 году из предполагаемой необходимости разработки экспериментальной платформы, аналогичной срезам мозга, гипофиза и надпочечников с сохраненными межклеточными контактами, паракринными взаимодействиями, мезенхимой и тканевой архитектурой, а также без некоторых из наиболее важных недостатков метода золотого стандарта в исследовании островков того времени - изолированных островков^{12, 14.} Среди этих недостатков - повреждение самых внешних слоев, отсутствие доступности основных островковых районов и необходимость культивирования, что, возможно, оказывает важное влияние на идентичность и физиологию клеток^12,15. Кроме того, метод среза ткани позволяет проводить исследования на животных моделях с сильно нарушенной архитектурой островков, где невозможно изолировать островки или когда выход островков чрезвычайно низок при традиционной изоляции 16,17,18,19,20,21.

Кроме того, срез больше подходит для изучения морфологических изменений во время развития диабета и панкреатита, например, поскольку он позволяет лучше просматривать всю ткань, а также совместим с изучением региональных различий. Важно отметить, что, несмотря на раннюю ориентацию на эндокринную часть, метод среза ткани по своей сути позволяет изучать экзокринные компоненты ^9,22,23. В течение первого десятилетия после его введения метод использовался для электрофизиологических исследований бета-14,24,25,26,27,28,29 и^{альфа-30,31} клеток^, а также для изучения морфологического и функционального созревания поджелудочной железы ^2,3 . Десять лет спустя, в 2013 году, метод был успешно адаптирован для визуализации кальция в живых клетках островковых клеток с использованием CLSM для характеристики их реакций на глюкозу³², их функциональных паттернов связности³³ и взаимосвязи между мембранным потенциалом и внутриклеточным кальцием путем объединения флуоресцентного красителя кальция с мембранным потенциальным красителем³⁴. Позже в том же году метод был также использован для оценки динамики кальция в ацинарных клетках^22,35. В течение следующих лет срезы ткани поджелудочной железы использовались в ряде различных исследований и успешно адаптировались к тканям свиней и человека ^{9,36,37,38,39,40,41}. Тем не менее, взятые вместе, визуализация кальция - в срезах ткани поджелудочной железы мыши в целом и в островках в частности - по-прежнему в основном выполняется этой группой. Одна из основных причин этого может заключаться в сочетании технически сложной подготовки среза ткани, необходимости конфокального микроскопа и довольно сложного анализа данных. Основная цель настоящего документа состоит в том, чтобы сделать этот мощный метод более доступным для других потенциальных пользователей.

Уже есть несколько отличных методологических статей, подробно посвященных подготовке срезов тканей и использованию срезов для структурных и секреционных исследований, но не для конфокальной визуализации кальция ^9,42,43. Поэтому в данной работе основное внимание уделяется некоторым дополнительным советам и приемам при приготовлении срезов, этапам, критически важным для успешной загрузки красителя, получения изображения, а также основным этапам анализа базовых данных кальция. Поэтому этот вклад следует рассматривать как дополняющий, а не как альтернативу вышеупомянутому методу. Аналогичным образом, визуализация кальция в срезах ткани поджелудочной железы мыши должна рассматриваться как экспериментальный подход, который будет использоваться для ответа на конкретные вопросы, и, таким образом, является дополнением, а не абсолютной альтернативой другим подходам к визуализации кальция в физиологии поджелудочной железы, таким как изолированные протоки или ацины, изолированные островки, органоиды, островки, пересаженные в переднюю камеру глаза, и записи in vivo 11,44,45,46,47,48. Перспективность визуализации кальция в срезах ткани поджелудочной железы мыши, вероятно, лучше всего иллюстрируется недавними успешными записями динамики кальция в островковых мезенхимальных клетках, таких как перициты⁴⁹ и макрофаги⁵⁰, а также в клетках протоков²³.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились в строгом соответствии с институциональными руководящими принципами по уходу и использованию животных в исследованиях. Протокол был одобрен Администрацией Республики Словении по безопасности пищевых продуктов, ветеринарному сектору и защите растений (номер разрешения: 34401-35-2018/2).

1. Подготовка срезов ткани поджелудочной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка острых срезов ткани поджелудочной железы мыши для визуализации кальция с использованием CLSM требует ряда инструментов, различных растворов и протекает в серии критических этапов, которые схематично представлены на рисунке 1 и подробно описаны ниже.

Рисунок 1: Схема рабочего процесса. Схематическое представление всех этапов процесса подготовки среза ткани поджелудочной железы, начиная с введения агарозы в общий желчный проток с последующим извлечением поджелудочной железы и нарезкой. Приготовленные ломтики могут быть использованы для оценки жизнеспособности ткани с помощью набора Live/Dead или окрашены датчиком кальция. После окрашивания они готовы к визуализации. Записи, полученные в процессе визуализации, затем используются для анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Приготовление растворов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы должны быть приготовлены заранее и могут храниться в холодильнике при температуре 4-8 °C до одного месяца. Для приготовления и хранения срезов тканей необходимо приблизительно 0,5 л внеклеточного раствора (ECS) с 6 мМ глюкозы и 0,3 л буфера 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES). Для 1 дня визуализации кальция с перифузионной системой, установленной на скорости потока 1-2 мл / мин, необходимо приблизительно 0,5 л ECS.
   1. Внеклеточный раствор с глюкозой 6 мМ
      1. Готовят 1 л ECS, содержащего 125 мМ NaCl, 26 мМ NaHCO₃, 6 мМ глюкозы, 6 мМ молочной кислоты, 3 мМ мио-инозитола, 2,5 мМ KCl, 2 мМ Na пирувата, 2 мМ CaCl₂, 1,25 мМ₂PO₄, 1 мМ MgCl₂ и 0,5 мМ аскорбиновой кислоты. Тщательно перемешайте, пока все ингредиенты полностью не растворятся. Возьмите 50 мкл ECS в микроцентрифужную трубку объемом 0,5 мл, поместите ее на осмометр в соответствии с инструкциями производителя и проверьте осмолярность.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Осмолярность должна быть 300-320 мОсм. Для стимуляции бета-клеток используют растворы с более высокими концентрациями глюкозы. Чтобы обеспечить физиологическое значение рН 7,4 во время нарезки и экспериментов, постоянно пузырьки ECS с карбогеном (т.е. газовой смесью 95% O₂ и 5% CO₂) при барометрическом давлении. Простая система пузырьков может быть настроена путем присоединения одного конца 5-миллиметровой кремниевой трубки к источнику карбогена (т.е. газовому баллону под давлением), а другой конец трубки помещен непосредственно в баллон, содержащий ECS.
      2. Альтернативно, готовят 10-кратный запас, содержащий 1250 мМ NaCl, 260 мМ NaHCO₃, 30 мМ мио-инозитол, 25 мМ KCl, 20 мМ Na пируват, 12,5 мМ₂PO₄ и 5 мМ аскорбиновой кислоты. При необходимости ЭКС, содержащей 6 мМ глюкозы, смешивают 100 мл бульона с 2 мл 1 М_CaCl2, 1 мл 1 М_МгCl2, 0,455 мл 13,2 мл молочной кислоты и 1,08 г глюкозы и заливают двойной дистиллированной водой до 1 л. При необходимости используйте различные количества глюкозы для получения других концентраций глюкозы.
   2. Буфер HEPES с глюкозой 6 мМ
      1. Готовят 0,5 л HEPES-буферного раствора (HBS), содержащего 150 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, 6 мМ глюкозы, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl₂ и 1 мМ MgCl₂; титровать до рН = 7,4 с 1 М NaOH.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если карбоген недоступен, этот буфер можно использовать для всех этапов вместо ECS.
   3. Агароза (1,9% мас.)
      1. Перед прогревом водяная баня до 40 °C.
      2. Добавьте 0,475 г агарозы с низкой температурой плавления и 25 мл ECS, содержащего 6 мМ глюкозы, в колбу Эрленмейера и поместите колбу в микроволновую печь на максимальной мощности на несколько секунд, пока она не начнет кипеть. Достаньте колбу из духовки и закрутите ее несколько раз, пока агароза не растворится полностью. Переложите колбу с жидкой агарозой на предварительно расплавленную водяную баню при 40 °C, чтобы охладить агарозу до нужной температуры и сохранить ее жидкой до инъекции. Закрепите колбу стабилизирующим свинцовым кольцом.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Агарозу можно приготовить заранее и хранить в холодильнике. Перед использованием разогрейте агарозу в микроволновой печи до тех пор, пока она не разжижится, и переложите колбу Эрленмейера на водяную баню предварительно расплавленной до 40 °C. Агароза может быть повторно использована до 5x. При повторном использовании за пределами 5x он станет плотным и его будет сложнее вводить.
2. Инъекции поджелудочной железы с агарозой
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разделы 1.2 и 1.3 объясняют подготовку срезов ткани, которые могут быть использованы для различных экспериментальных целей, таких как визуализация кальция, электрофизиология, иммуногистохимия, исследования секреции и структурные/микроанатомические исследования.
   1. Заполните шприц объемом 5 мл жидкой агарозой из колбы Эрленмейера на водяной бане с этапа 1.1.3.2, удалите все пузырьки и установите иглу весом 30 г. Защитите иглу колпачком, а наполненный шприц держите обратно на водяной бане иглой, обращенной вниз, и весь объем агарозы ниже поверхности воды. Закрепите шприц стабилизирующим свинцовым кольцом таким образом, чтобы кольцо прижимало шприц к стенке водяной бани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не втолкнуть агарозу в иглу, так как она быстро затвердеет и заблокирует иглу. Если температура в помещении низкая, и если инъекция выполняется менее опытным человеком, увеличьте температуру водяной бани до 42 °C, чтобы получить некоторое дополнительное время для инъекции.
   2. Наполните ведро со льдом и поместите в него бутылку, содержащую ECS. Пузырите ECS постоянно со скоростью 1,5 мл / мин с карбогеном при барометрическом давлении и комнатной температуре, чтобы обеспечить оксигенацию и рН 7,4.
   3. Жертвуйте мышью, вводя высокую концентрацию CO₂ с последующим вывихом шейки матки. Приложите все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.
   4. Работая под стереомикроскопом, получите доступ к брюшной полости с помощью лапаротомии (рисунок 2А). Осторожно переверните кишечник в левую сторону мыши (с анатомической точки зрения мыши), чтобы обнажить общий желчный проток. Используйте щипцы, чтобы слегка приподнять дуоденальную часть, и найти большой дуоденальный сосочек-сосочек Фатера. Зажмите общий желчный проток в дуоденальном сосочке с помощью гемостата (рисунок 2B, C) для предотвращения утечки агарозы из протока в двенадцатиперстную кишку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить утечку агарозы в двенадцатиперстную кишку и далее вверх и вниз в желудочно-кишечном тракте, поместите гемостат таким образом, чтобы он также зажимал двенадцатиперстную кишку как проксимально, так и дистально из сосочков. Лучше всего использовать для этой цели изогнутый гемостат.
   5. Небольшими острыми щипцами доберитесь под общий желчный проток, и разорвите мембрану, которая прикрепляет проток к ткани поджелудочной железы. Для лучшего визуального контроля и более легкой инъекции очистите проток как можно больше жира и соединительной ткани.
   6. Поместите проток перпендикулярно на крупные щипцы (рисунок 2D) и введите подготовленную жидкую агарозу в проксимальную часть общего желчного протока (рисунок 2D). Обязательно сильно сжимайте шприц, так как агароза вязкая. Продолжайте заполнять поджелудочную железу до тех пор, пока она не станет беловатой и слегка растянутой или не менее 20-30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это наиболее важный этап в подготовке среза. Если есть какие-либо перегибы в протоковом дереве поджелудочной железы, осторожно поднимите или оттяните поджелудочную железу от шприца, чтобы выровнять их. Не решайте, когда прекратить инъекцию, основываясь на объеме, вводимом из шприца, поскольку обратный поток в точке инъекции и прямая утечка в двенадцатиперстную кишку обычно намного выше, чем объем, вводимый в протоковое дерево поджелудочной железы. Важно отметить, что успешные инъекции могут быть выполнены при практически незаметных изменениях объема шприца.
   7. Извлеките шприц и медленно вылейте 20 мл пузырькового ледяного ECS при 0-4 °C из бутылки на поджелудочную железу, чтобы охладить ткань и затвердеть агарозу.
   8. Аккуратно извлеките поджелудочную железу с помощью щипцов и тонких ножниц. Поместите извлеченную поджелудочную железу в чашку Петри толщиной 100 мм, содержащую ~ 40 мл ледяного ECS, и осторожно переместите ее, чтобы вымыть. Переведите поджелудочную железу в свежую чашку Петри толщиной 100 мм, содержащую ~40 мл ледяного ECS.
   9. Из хорошо введенной части поджелудочной железы, которая выглядит беловатой (рисунок 3А), разрезают до 6 блоков ткани размером 0,1-0,2^см3 , используя щипцы и жестко разрезанные ножницы. Очистите их от любой соединительной и жировой ткани.
   10. Наполните 35-миллиметровую нелипкую нижнюю чашку Петри примерно 5 мл жидкой агарозы при 40 °C, перенесите в нее тканевые блоки и немедленно положите чашку Петри на лед, чтобы охладить ее и затвердеть агарозу.
       ПРИМЕЧАНИЕ: То, как блоки поджелудочной железы попадают в агарозу, определяет способ их разрезания во время нарезки. Опытные экспериментаторы могут попытаться точно настроить положение блоков в течение нескольких мгновений до того, как агароза затвердеет при размещении на льду.
   11. После того, как агароза с тканевыми блоками затвердеет, переверните чашку Петри вверх дном на плоскую гладкую поверхность, такую как крышка чашки Петри 100 мм, и удалите агарозу, аккуратно разрезав половиной лезвия бритвы в край между боковой стенкой чашки Петри и агарозой. Лезвием бритвы разрезайте отдельные кубики агарозы, каждый из которых содержит один блок ткани, заботясь о том, чтобы каждый блок ткани был окружен агарозой. Приклейте блоки агарозы на образец пластины вибратома цианоакрилатным клеем (рисунок 3B).

Рисунок 2: Инъекция агарозы в общий желчный проток. (А) Открыть брюшную полость, и обнажить органы в брюшной полости. (B) Увеличенная часть области, заключенная прямоугольником в панели А. Белое пятно на двенадцатиперстной кишке (обозначено стрелкой) указывает на ампулу Фатера. Островки Лангерганса обозначаются наконечниками стрел. (C) Зажмите ампулу Фатера изогнутым гемостатом и слегка приподнимите ее, чтобы обнажить и осторожно растянуть общий желчный проток (стрелка). (D) Каннуляция общего желчного протока и инъекция 1,9% раствора агарозы с использованием шприца 5 мл и иглы 30 г. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Разрезание на ломтики
   1. Заполните режущую камеру вибратома ~0,15 л ледяного ECS и постоянно пузырьковайте карбогеном. Окружите режущую камеру льдом и добавьте в режущую камеру 2 кубика льда (~ 10 мл каждый), изготовленных из ECS с 6 мМ глюкозы. Установите лезвие бритвы для резки на вибратом и закрепите на своем месте пластину образца с блоками агарозы.
   2. Установите слайсер для резки блоков агарозы со скоростью от 0,05 до 1 мм/с и 70 Гц на срезы толщиной 140 мкм с площадью поверхности 20-100^мм2. Для настройки среза следуйте инструкциям производителя.
   3. Сразу после каждого этапа резки поставьте на паузу слайсер, аккуратно соберите ломтики тонкой кистью и переложите их в 100-миллиметровую чашку Петри, заполненную 40 мл буфера HEPES с глюкозой 6 мМ при комнатной температуре (рисунок 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы могут храниться в буфере HEPES при комнатной температуре не менее 12 ч, и буфер следует менять каждые 2 ч.

Рисунок 3: Подготовка и нарезка тканей поджелудочной железы. (А) Экстрагируется поджелудочная железа мыши после инъекции агарозы. Белая ткань слева указывает на хорошо введенную часть (дуоденальную часть), в то время как более красноватая часть справа показывает недостаточно введенную часть поджелудочной железы (селезеночная часть). (B) Вибратомная нарезка двух блоков ткани поджелудочной железы, встроенных в агарозу. (C) Острый срез ткани поджелудочной железы с островками Лангерганса, обозначенными наконечниками стрел. Шкала бар = 3000 мкм. (D) Острый срез ткани поджелудочной железы под световым микроскопом с островком Лангерганса, обозначенным наконечником стрелы, звездочкой обозначен проток поджелудочной железы. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Живой / мертвый анализ с использованием LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit для клеток млекопитающих

ПРИМЕЧАНИЕ: Для некоторых экспериментов полезно проверить жизнеспособность клеток в срезах (рисунок 4) с помощью анализа живых/мертвых следующим образом.

1. Следуйте инструкциям производителя по размораживанию флаконов с реагентами LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, и непосредственно перед использованием готовьте рабочие растворы кальцеина AM. Используйте решения в течение одного дня.
2. В центрифужной трубке объемом 15 мл смешайте 5 мкл 4 мМ кальциина AM (компонент A), 20 мкл гомодимера этидия-1 2 мМ (EthD-1, компонент B) и 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (D-PBS) для получения рабочего раствора, содержащего примерно 2 мкМ кальциина AM и 4 мкМ EthD-1. Вихрь основательно.
3. Используя тонкую кисть, аккуратно перенесите кусочки ткани в чашку Петри объемом 3 мл со свежим буфером HEPES, чтобы разбавить активность эстеразы сыворотки. Удалите буфер HEPES и покройте срезы 100-200 мкл (или более, если это необходимо) рабочего раствора с шага 2.2.
4. Инкубировать ломтики в течение 30-45 мин при комнатной температуре в закрытой чашке Петри. Визуализируйте срезы ткани с помощью фильтров возбуждения/излучения в соответствии с рекомендациями производителя.

3. Загрузка кальциевого красителя

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные красители должны быть защищены от светового воздействия в течение всего процесса приготовления и загрузки красителя, а также во время обработки окрашенных срезов ткани. Оловянная фольга может быть использована для покрытия трубок или чашек Петри, содержащих кальциевый краситель.

1. Подготовка красителя
   1. Растворяют содержимое одного флакона (50 мкг) клеточного проницаемого индикаторного красителя Ca²⁺ (возбуждение/излучение 495/523 нм; см. Таблицу материалов), 7,5 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и 2,5 мкл полаксамера (20% раствор в ДМСО; Таблица материалов) в 6,667 мл HBS, содержащего 6 мМ глюкозы в 15 мл завинчивающейся колпачковой трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот конечный раствор содержит 6 мкМ индикаторного красителя Ca²⁺ , 0,11% DMSO и 0,037% полаксамера.
   2. Аспирировать и выталкивать раствор в завинчивающуюся колпачковую трубку многократно пипеткой в течение 20 с; погружают трубку в ультразвуковую камеру ванны на 30 с, а вихрь на 30 с для улучшения солюбилизации. Aliquot 3,333 мл конечного раствора индикаторного красителя Ca²⁺ , приготовленного на этапе 3.1.1 в 5 мл чашки Петри.
2. Загрузка красителя
   1. Переложите подготовленные ломтики ткани из чашки Петри объемом 60 мл с HBS в чашки Петри объемом 5 мл, заполненные раствором красителя, осторожно подняв каждый срез ткани с помощью тонкой, мягкой красящей кисти и поместив его в раствор красителя. Инкубируйте до 10 кусочков ткани на чашку Петри.
   2. Поместите нагруженную кусочками чашку Петри на орбитальный шейкер при комнатной температуре, установленной для орбитального движения со скоростью 40 оборотов в минуту в течение 50 минут. Инкубируют ломтики в растворе красителя, подвергая воздействию окружающего воздуха при комнатной температуре, но защищая от света, накрыв чашку Петри оловянной фольгой.
3. Хранение срезов
   1. Перенесите окрашенные срезы ткани из чашки Петри объемом 5 мл в чашку Петри объемом 60 мл, наполненную HBS без красителя, осторожно подняв их с помощью тонкой, мягкой кисти. Хранить до 20 ломтиков на чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте срезы ткани для визуализации на этом этапе. Срезы ткани будут удерживать индикаторный краситель Ca^{2+ в} течение нескольких часов. Выживание ломтиков и удержание красителя можно улучшить, поместив чашку Петри в изолированный контейнер, окруженный льдом. Это особенно важно, если необходимо транспортировать срезы, загруженные красителем. Кроме того, меняйте HBS каждые 2 часа.

4. Визуализация кальция

1. Настройка конфокального микроскопа
   1. Выберите соответствующее объективное увеличение в зависимости от интереса исследования. Выберите 20x и 25x (числовая диафрагма [NA] 0,77-1,00) для визуализации целого островка, нескольких ацинуров одновременно или более крупных воздуховодов. Выберите более высокие увеличения для изучения внутриклеточной динамики.
   2. Выберите режим съемки для покадровой съемки (например, покадровый, xyt или аналогичный режим). Установите точечное отверстие на 100-200 мкм.
   3. Установите световой тракт для зеленых флуорофоров: возбуждение на 488 нм, и сбор излучения на 500-700 нм. Предпочтительно выбирать детекторы с высокой квантовой эффективностью (например, арсенид галлия фосфид) над фотоумножительными детекторами.
2. Настройка регистрирующей камеры и системы перифузии
   1. Установите камеру записи на регулируемую температуру ступени микроскопа и перифузионной системы (либо с гравитационной подачей, либо на основе перистальтического насоса, объем 1 мл). Расположите входное и выходное отверстие на дальних краях регистрирующей камеры, чтобы избежать извилины перфузата внутри камеры, и установите приток и отток равными значениями (1-2 мл/мин). Избегайте дрейфа высоты жидкого мениска и капель в перифузате.
   2. Установите температурный контроль системы перифузии на 37 °C. Начните перифузию нестимулирующим раствором и приготовьте стимулирующие растворы. Меняйте растворы с помощью моторизованных клапанов или вручную переключая растворы, питающие перифузионную систему.
3. Рекордная динамика кальция
   1. Перенесите один срез ткани в записывающую камеру. Обездвижите срез ткани U-образной платиновой массой с подтянутой нейлоновой сеткой (например, из нейлоновых чулок). Избегайте размещения нейлоновых нитей над интересующей структурой.
   2. Найдите островок/ацинус/канал с помощью опции brightfield. Запустите живую визуализацию, чтобы позиционировать исследуемые структуры в поле зрения и настроить параметры изображения. Оптимизируйте отношение сигнал/шум, регулируя мощность лазера, усиление детектора и усреднение /биннинг линии, чтобы обеспечить визуализацию ячеек при сохранении минимальной мощности лазера.
   3. Отрегулируйте фокальную плоскость записи до ~15 мкм ниже поверхности разреза (рисунок 5), чтобы избежать записи из потенциально поврежденных клеток на поверхности разреза.
   4. Получайте изображения. Установите частоту дискретизации на 1-2 Гц для первоначального обнаружения отдельных колебаний и используйте резонансный сканер, способный к быстрому усреднению линии (8-20) с более высокой скоростью сбора (>10 Гц) для записи внутриклеточной активности Ca²⁺ ([Ca²⁺]_IC). Допускайте интервал (например, 30% от общего времени выборки) между последовательными точечными освещениями для предотвращения фототоксичности. Запишите изображение с высоким разрешением (например, 1024 x 1024 пикселя, усреднение строки > 50) перед получением временных рядов (см. раздел 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дискретизации 1-2 Гц ниже критерия Найквиста для частоты захвата для большинства ячеек, и форма сигнала будет недодискретизирована по умолчанию.
   5. Обратитесь к онлайн-диаграмме, если она доступна в программном обеспечении для визуализации, чтобы получить мгновенную обратную связь о реакции подготовки, чрезмерном освещении, фотоотбеливании и механическом дрейфе. В случае высокой скорости отбеливания во время съемки остановите запись и уменьшите мощность лазера при одновременном увеличении усиления детектора для поддержания отношения сигнал/шум. В случае механического дрейфа проверьте натяжение между трубками/кабелями и ступенью микроскопа, а также утечку жидкости или изменение объема в камере записи. При желании попытайтесь исправить дрейф во время захвата вручную; однако обратите внимание, что это по своей сути даст ограниченные результаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эндокринные клетки очень гетерогенны при околопороговых концентрациях. Достаточная продолжительность стимуляции необходима для выявления диапазона задержек активации/деактивации в отдельных клетках. Это особенно важно для точного обнаружения ответов в соответствии с высокостимулирующими протоколами.
   6. Используйте кальциевую визуализацию для функционального различения эндо- и экзокринных клеток (рисунок 6). Для записи преходящей активности во время активации и деактивации применяйте стимулы, не останавливая запись.
   7. Сохраните данные после окончания экспериментов (рассмотрите возможность использования функции автосохранения). Выделите период охлаждения перед отключением питания лазера, чтобы не повредить лазеры во время процедуры отключения.

5. Анализ данных

1. Визуально проверьте запись качественно, воспроизведя покадровое видео. Проверьте наличие дрейфов ячеек из поля зрения или оптической плоскости. Если произошел дрейф в оптической плоскости, используйте плагин коррекции дрейфа в ImageJ.
2. Выберите интересующие регионы (ROI) с помощью программного обеспечения микроскопа или стороннего программного обеспечения. Используйте изображение с высоким разрешением, максимальную проекцию или среднее значение кадра в качестве ориентира для выбора ROI. Воспроизведите покадровое изображение, чтобы визуализировать ответные ячейки, которые не видны на эталонных изображениях. Расположите ROI таким образом, чтобы выбранная область ROI не перекрывалась с соседними ячейками, чтобы избежать перекрестных помех сигнала между ROI.
3. Экспортируйте данные временных рядов в виде среднего значения ROI на кадр. Экспорт координат ROI.
4. Корректировка данных временных рядов для отбеливания (рисунок 7A) путем использования комбинации экспоненциального и линейного соответствия, как описано
   (1)
   где x(t) обозначает флуоресцентный сигнал в точке времени t; xcorr(t) скорректированный сигнал в соответствующих точках времени; и a, b и c — параметры прилегания, вычисляемые как наименьшая сумма квадратов между corr(t) и x(t).
5. Анализ фазы активации и деактивации ответа (рисунок 7B). Рассчитайте первую производную данных временных рядов и определите зенит и надир производной, соответствующие активации и деактивации соответственно. Кроме того, можно вручную выбрать начало фазового увеличения. Сохраните и экспортируйте время активации/деактивации и соответствующие координаты ячейки.
6. Проанализируйте фазу плато (рисунок 7C). Обнаружение отдельных колебаний путем порогового значения необработанных данных или путем порогового значения первой производной данных временных рядов. Определите начало и конец отдельного колебания как время, соответствующее половинной амплитуде колебания.
   1. Рассчитайте продолжительность и частоту отдельных колебаний для каждой ячейки. Рассчитайте обратное значение интервала между ударами (подходит для регулярных паттернов активности). В качестве альтернативы можно разделить число колебаний на временной интервал записи (подходит для нерегулярных паттернов активности).
   2. Рассчитайте активное время. Выразите активное время как сумму длительностей и разделите это значение на интервал времени. В качестве альтернативы можно умножить частоту и продолжительность, которые соответствуют колебанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Деление суммы длительностей на временной интервал дает надежные результаты, но имеет низкую статистическую дискриминацию, поскольку получается одна точка данных на ячейку. Умножение частоты и длительности колебаний обеспечивает временное разрешение от колебаний к колебаниям.

Инъекция раствора агарозы в проток поджелудочной железы является наиболее важным этапом в подготовке среза ткани поджелудочной железы. Успешную инъекцию можно распознать по отбеливанию ткани поджелудочной железы, как видно на левой стороне рисунка 3А, в то время как неполностью введенная часть поджелудочной железы представлена на правой стороне рисунка 3А. Островки Лангерганса могут быть распознаны невооруженным глазом или под стереомикроскопом, и это помогает в разрезании соответствующих частей поджелудочной железы для последующего встраивания в блоки агарозы (рисунок 3B). В свежесрезанном срезе ткани поджелудочной железы мыши островки Лангерганса можно легко отличить от окружающей экзокринной ткани и мезенхимы в виде белых пятен под стереомикроскопом (рисунок 3C) или в виде коричневатых структур под световым микроскопом (рисунок 3D). Срезы ткани поджелудочной железы могут быть использованы для различных типов экспериментов в течение, по крайней мере, 12 ч после нарезки. В дополнение к грубой морфологической оценке под стереомикроскопом, световым микроскопом и функциональными реакциями клеток во время визуализации кальция может быть оценена жизнеспособность срезов ткани поджелудочной железы (рисунок 4).

Рисунок 4: Жизнеспособность клеток внутри среза ткани. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа Live/Dead. Живые клетки окрашиваются Calcein AM (показаны зеленым цветом), в то время как мертвые клетки окрашиваются гомодимером этидия-1 (показан красным цветом). Желтые линии обозначают положение поперечного сечения X-Y Z-стека, отображаемого внизу и справа. Полная глубина Z-стека составляет 88 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для экспериментов с визуализацией кальция флуоресцентный индикатор кальция должен проникать через несколько слоев клеток. На рисунке 5А показана успешная загрузка клеточно-проницаемого индикаторного красителя Ca2+ в срез ткани поджелудочной железы, в котором могут быть распознаны отдельные островковые и ацинарные клетки. Напротив, срезы на рисунке 5B-D не являются оптимальными из-за неудачного проникновения красителя (рисунок 5B), отсутствия островковых клеток (рисунок 5C) и большого количества некротической ткани на поверхности (рисунок 5D). Такие срезы могут быть выброшены, проверены на наличие дополнительных островков, которые лучше разрезаны или окрашены (см. Таблицу 1 для устранения неполадок), или использованы для записи реакций экзокринных клеток.

Рисунок 5: Примеры пригодных и непригодных для использования препаратов. (А) Пример успешного приготовления среза ткани поджелудочной железы с хорошо окрашенными клетками в островках Лангерганса, а также клетками протоков и окружающей ацинарной тканью. (B) Пример плохо окрашенного среза ткани. (C) Пример островка Лангерганса со структурными разрывами. (D) Пример островка Лангерганса, содержащего много мертвых клеток и много мусора. Таблица подстановки «свечение, свечение» справа отображает интенсивность 0 зеленым цветом и насыщенность синим. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Репрезентативные результаты визуализации кальция с использованием клеточно-проницаемого индикаторного красителя Ca2+ показаны на рисунке 6. На фиг.6А представлено изображение среза ткани поджелудочной железы с высоким разрешением, содержащее островок Лангерганса, ацинарную ткань и проток поджелудочной железы. Для лучшего различения эндокринная, экзокринная и протоковая часть среза ткани поджелудочной железы, представленная на рисунке 6А , окрашена на рисунке 6B. Использование соответствующих стимулов может функционально различать различные островковые клетки или островковые и неостровные клетки51. Бета-клетки обычно реагируют на стимуляцию квадратного импульса глюкозой с переходным увеличением [Ca2+]IC с последующими быстрыми колебаниями кальция на устойчивом плато (рисунок 6C, верхняя панель).

Поскольку все бета-клетки соединены в один большой функциональный синцитий, эти колебания также очень хорошо синхронизированы между различными клетками посредством распространения волн [Ca2+]IC 32,34,52,53,54 (Рисунок 7C). Более медленные [Ca2+]IC колебания с периодом 5-15 минут могут лежать в основе быстрых колебаний или даже быть преобладающим типом ответа55,56. Тот же простой протокол может выявить другие типы ответов, особенно на периферии островков (рисунок 6C, нижняя панель). Поскольку эти клетки не синхронизированы с бета-клетками и реагируют более быстрыми и нерегулярными колебаниями, которые уже присутствуют в условиях низкого уровня глюкозы или со снижением активности, такие ответы очень наводят на мысль о небета-клетках 21,32,57,58. Однако их окончательная функциональная характеристика требует более сложных протоколов с дополнительными шагами стимуляции или альтернативными подходами, которые обсуждаются ниже. Типичные ответы ацинарных и проточных клеток представлены на рисунке 6D и рисунке 6E соответственно. Обратитесь к литературе для получения более подробной информации об ацинарных и протоковых клетках 22,23,35.

Рисунок 6: Репрезентативные результаты динамики кальция в различных типах клеток поджелудочной железы. (A) Изображение островка Лангерганса с высоким разрешением с окружающими тканями. Шкала = 100 мкм. (B) Разграничение отдельных частей ткани поджелудочной железы с ацинарной тканью, показанной желтым цветом, островком Лангерганса, показанным красным, и сегментом протокового дерева синим. Шкала bar = 100 мкм. (C) Типичные следы динамики кальция в бета- и предполагаемых небета-клетках при стимуляции глюкозой 12 мМ; 3 мМ глюкозы использовали для нестимулирующих состояний. Протоколы, которые могут быть использованы для более конкретной дискриминации небета-клеток, описаны в разделе обсуждения. (D) Типичный след кальциевой динамики ацинарных клеток, стимулируемых 25 нМ ацетилхолина. (E) Типичный след динамики кальция проточных клеток, стимулируемых 1 мМ хенодезоксихолевой кислоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

После успешной визуализации кальция данные сначала экспортируются и корректируются для отбеливания комбинацией экспоненциального и линейного соответствия, как описано в разделе протокола. Временные ряды до и после коррекции отбеливания представлены на рисунке 7А. После этого можно проанализировать несколько параметров в фазе активации и деактивации ответа, а также фазе плато. Задержка начала повышения [Ca2+]IC после стимуляции может быть измерена как представленная задержкойA на фиг.7B и неоднородностью задержек между отдельными клетками (задержкаA1). Те же параметры (задержкаD и задержкаD1) могут быть использованы для описания фазы деактивации. После начального переходного [Ca2+]IC повышения фаза плато в большинстве бета-клеток поджелудочной железы в островке характеризуется относительно регулярными высокочастотными [Ca2+]IC колебаниями. Фазу плато можно описать, проанализировав классические функциональные параметры. Схематическое представление длительности колебаний [Ca2+]IC , частоты и процента активного времени представлено на рисунке 7C. В кальциевой визуализации со скоростью захвата выше 10 Гц кальциевые волны, многократно распространяющиеся по островку, также могут быть четко распознаны (рисунок 7C).

Рисунок 7: Анализ данных временных рядов. (A) Коррекция данных временных рядов для фотоотбеливания. (B) Анализ задержек активации после стимуляции и деактивации после прекращения стимуляции 12 мМ глюкозы. Длительность стимуляции обозначается светло-серой, затененной полосой на изображении. (C) Анализ нескольких параметров фазы плато: I) Длительность колебаний, определяемая на половинной высоте, II) частота колебаний, определяемая межколебательными интервалами. III) активное время как произведение частоты и длительности колебаний. I-IV) Задержки между колебаниями в любой данной волне колебаний, которые распространяются по островку Лангерганса, определяются задержками (Δt) во времени, при которых одна клетка достигает половинной высоты колебания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии какого-либо коммерческого или финансового интереса.