Методическая статья

Двухэтапные протоколы капельной цифровой ПЦР с обратной транскрипцией для обнаружения и количественного определения SARS-CoV-2

5.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62295

⸱

31 марта 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2International College, University of Chinese Academy of Sciences, 3Sino-Africa Joint Research Center, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 5Center for Infectious and Parasitic Diseases Control Research, Kenya Medical Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

В этой работе обобщены шаги по разработке различных анализов для обнаружения SARS-CoV-2 с использованием двухцветной системы ddPCR. Шаги проработаны, и были включены примечания о том, как улучшить анализы и результаты экспериментов. Эти анализы могут использоваться для нескольких приложений SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Аннотация

Диагностика продолжающейся пандемии SARS-CoV-2 является приоритетом для всех стран мира. В настоящее время количественная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) является золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2, поскольку постоянного решения нет. Каким бы эффективным ни был этот метод, появились исследования, показывающие его ограничения в обнаружении и диагностике, особенно когда речь идет о малораспространенных мишенях. Напротив, было показано, что капельная цифровая ПЦР (ddPCR), недавно появившаяся технология с превосходными преимуществами по сравнению с кПЦР, преодолевает проблемы ОТ-кПЦР в диагностике SARS-CoV-2 из малораспространенных целевых образцов. В перспективе в этой статье возможности ОТ-дПЦР еще больше расширяются за счет демонстрации шагов по разработке симплексных, дуплексных, триплексных зондовых смесей и квадруплексных анализов с использованием двухцветной системы детектирования. Показано, что разработка этих анализов возможна с использованием праймеров и зондов, нацеленных на определенные участки генома SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 и RBD2). Кроме того, предоставляются пошаговые подробные протоколы, примечания и предложения о том, как улучшить рабочий процесс анализа и анализа данных. Адаптация этого рабочего процесса в будущих работах обеспечит возможность чувствительного обнаружения максимального количества целей в небольшой выборке, что значительно снизит стоимость и пропускную способность выборки.

Введение

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), хорошо известная методика, с момента своего появления претерпела несколько трансформаций и стала мощным методом, способным дать ответы на исследования нуклеиновых кислот. Эти преобразования были постоянным совершенствованием старой техники. Эти преобразования можно свести к тремпоколениям1. Первое поколение - это обычная ПЦР, которая основана на гель-электрофорезе для количественной оценки и обнаружения амплифицированных мишеней. Второе поколение — это количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР), которая может обнаруживать образцы в режиме реального времени и полагаться на стандартную кривую для прямого количественного определения целей в образце. Третье поколение, цифровая ПЦР (дПЦР), может выполнять как обнаружение, так и абсолютное количественное определение мишеней нуклеиновых кислот без необходимости стандартной кривой. дПЦР также была усовершенствована за счет того, что реакционные камеры были разделены скважинами стенки на эмульсии нефти, воды и стабилизирующих химических веществ в той же лунке, что и при цифровой ПЦР2 на основе капель. При капельной цифровой ПЦР (ddPCR) образец разбивается на тысячи капель нанолитрового размера, содержащих отдельные мишени, которые позже будут количественно определены с использованием статистики Пуассона 2,3,4. Этот метод дает ddPCR преимущество в количественной оценке малораспространенных мишеней по сравнению с другими поколениями ПЦР.

В последнее время во многих приложениях подчеркивается превосходство ddPCR над широко используемой qPCR при обнаружении и количественной оценке малораспространенных мишеней 1,5,6. SARS-CoV-2 не является исключением из этих приложений 7,8,9,10,11,12. С момента вспышки SARS-CoV-2 ученые работали на всех фронтах, чтобы найти решения о том, как диагностировать вирус и эффективно его обнаруживать. Нынешним золотым стандартом по-прежнему остается qPCR13. Однако было показано, что ОТ-дПЦР более точна при обнаружении малораспространенных мишеней SARS-CoV-2 как из экологических, так и из клинических образцов по сравнению с ОТ-кПЦР 7,8,9,10,11,12. Большинство опубликованных работ по ddPCR SARS-CoV-2 основаны на симплексных анализах, а мультиплексные - на коммерческих анализах. Следовательно, необходимо сделать больше, чтобы объяснить, как разрабатывать мультиплексные анализы ОТ-дПЦР для обнаружения SARS-CoV-2.

При правильном дизайне анализа мультиплексирование может быть использовано для экономии затрат, увеличения пропускной способности образца и максимизации количества мишеней, которые могут быть чувствительно обнаружены в небольшом образце. При мультиплексировании с помощью ddPCR необходимо учитывать, сколько флуорофоров может быть обнаружено в конкретной системе. Некоторые платформы ddPCR могут поддерживать до трех каналов, в то время как другие поддерживают только два канала. Следовательно, при мультиплексировании с двумя каналами приходится использовать разные подходы, в том числе мультиплексирование более высокого порядка для обнаружения более двух целей14,15,16. В этой работе двухцветная система обнаружения ddPCR используется для демонстрации шагов по разработке различных анализов SARS-CoV-2 RT-ddPCR, которые можно адаптировать для различных исследовательских приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этическое заявление
Уханьский институт вирусологии (WHIOV) входит в число лабораторий и институтов, одобренных Китайским центром по контролю и профилактике заболеваний города Ухань для проведения исследований SARS-CoV-2 и выявления COVID-19 в клинических образцах. Исследования по разработке новых методов диагностики COVID-19 с использованием клинических образцов также были одобрены этическим комитетом Уханьского института вирусологии (2020FCA001).

1. Рабочий процесс обработки образцов (рис. 1A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Во всем протоколе важно использовать отдельные помещения со специальными пипетками для обработки образцов (экстракция и хранение), подготовки и хранения реагентов/мастермиксов, подготовки реакционных смесей (образец плюс мастермикс) и обнаружения, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Разрабатываемые анализы могут быть использованы при обнаружении клинических образцов или исследовательских образцов. Со всеми образцами следует обращаться так, как будто они могут передавать инфекционные агенты, даже при использовании безопасных лабораторных процедур. Этапы обработки проб должны выполняться в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2) в соответствии со строгими правилами BSL-2, включая ношение соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ).

  1. Пример инактивации
    1. Отнесите 1 мл образца SARS-CoV-2 в лабораторию BSL-2. Инактивируйте образцы при 65 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут поступать из разных источников, поэтому следует убедиться, что инактивируемый объем достаточен для обеспечения последующей экстракции РНК. Большинство наборов для экстракции требуют небольшого объема образца до 200 мкл, следовательно, объема образца около 1 мл будет достаточно для инактивации. Поверхностно-активные вещества, наборы и буферы для лизиса также могут использоваться для прямой инактивации и экстракции РНК в соответствии с собственной СОП лабораторий.
    2. Отнесите пробы в шкаф биобезопасности (BSC) и дайте им постоять при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы потенциальные аэрозоли осели. Храните образцы при температуре 4 °C до 24 часов, если их не обработать немедленно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для хранения образцов не требуется специальный контейнер. Образцы можно хранить в пробирках или контейнерах, используемых во время инактивации. Для этой работы большинство образцов хранились в пробирках с вирусными транспортными средами (VTM) или пробирках объемом 1,5 мл.
  2. Выделение РНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие инструменты и наборы для выделения РНК со специальными протоколами доступны для готового использования. Здесь представлена автоматизированная процедура в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Выньте предварительно заполненную диафрагму колодца глубиной 96; Аккуратно переверните его вверх дном, чтобы перемешать магнитные шарики. После смешивания аккуратно встряхните пластину на плоской поверхности, чтобы сконцентрировать реагент и магнитные шарики, которые могут находиться на стене, на дне пластины.
    2. Осторожно оторвите уплотнительную пленку из алюминиевой фольги, чтобы избежать вибрации пластины и пролития жидкости. Добавьте 20 мкл протеиназы К и 200 мкл образца на лунку в ряды 2 и 8 96-луночного планшета. Затем поместите 96-луночную пластину на основание 32-канального автоматического прибора для экстракции нуклеиновых кислот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запустите программу на компьютере в течение 1 часа после добавления примера.
    3. Вставьте втулку магнитного стержня в слот для карты 32-канального автоматического прибора для извлечения нуклеиновых кислот. Выберите программу GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (быстрая версия) и запустите ее.
    4. После завершения экстракции вынимают образцы нуклеиновых кислот в рядах 6 и 12 (около 100 мкл / образец) и распределяют в чистой 96-луночной пластине без нуклеазы. Храните образцы при температуре 4 °C до 24 часов до использования или при температуре -20 °C в течение более длительного времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать многоканальную пипетку объемом 100 мкл для переноса образцов в новую пластину объемом 100-200 мкл, поскольку она может напрямую совпадать с колонками пластины для образцов.
  3. Генерация кДНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, хранящихся в течение длительного времени, избегайте нескольких циклов замораживания/оттаивания. Выполните генерацию кДНК с помощью набора кДНК, следуя инструкциям производителя.
    1. В ПЦР-пробирку объемом 100 или 200 мкл, помещенную на блок льда/охлаждения, добавьте 2 мкл 5-кратной основной смеси RT (например, Perfect Real Time), 5 мкл образца РНК и 3 мкл свободного от РНКазы ddH2O на реакцию (общий объем 10 мкл).
    2. Поместите ПЦР-пробирку в термоциклер, настроенный на работу при температуре 37 °C в течение 15 мин (обратная транскрипция), 85 °C в течение 5 с (тепловая инактивация обратной транскриптазы) и 4 °C в течение бесконечного времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно обработайте образцы или храните при температуре 4 °C до 24 часов до использования или при -20 °C до 6 месяцев.

2. Оптимизация анализа ddPCR и рабочего процесса

ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте анализы до/после считывания капель. В зависимости от результатов, они могут быть оптимизированы на любом этапе работы для достижения лучших результатов. Ниже приведены некоторые общие факторы, которые следует учитывать при оптимизации экспериментов ddPCR.

  1. Проверьте праймеры и зонды ddPCR (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры ORF1ab и N были адаптированы из China CDC17, эндогенный контрольный ген человека (RPP30) из Lu et al.18 и RBD2 из Nyaruaba et al.13. Все праймеры и зонды, кроме RBD2, уже были протестированы ddPCR и оптимизированы 7,8,18.
  2. Запустите контрольные образцы тестов ddPCR, включающие положительный контроль (образец со всеми четырьмя целями), элемент управления без шаблона (NTC; Вода без нуклеазы или образец без мишеней) и экстракция / отрицательный контроль (общая нуклеиновая кислота, извлеченная из неинфекционной культивируемой клетки человека или объединенных образцов от добровольцев в области здравоохранения).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтение отдается стандартным контрольным образцам с известными копиями генов-мишеней. Однако при отсутствии стандартов используйте имеющиеся образцы для определения их элементов управления или матрицы выборок. Запустите элементы управления вместе с тестовыми образцами.
  3. Оптимизируйте температуру отжига (рис. 2D), вставив градиент температуры от 55 °C до 65 °C на этапе отжига ПЦР (этап 3.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация температуры отжига помогает найти наилучшую температуру, при которой отделение капель является максимальным (легкая идентификация цели) с минимальным дождем. После получения результатов сузьте температурный диапазон для лучшей оптимизации, например, от 55 °C до 60 °C.
  4. Оптимизируйте концентрацию праймера и зонда. Если в анализах не достигается оптимальное разделение между положительными и отрицательными каплями, варьируйте концентрацию праймера (300-900 нМ) и/или зонда (100-400 нМ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение концентрации праймера/зонда приводит к снижению амплитуды капель мишени, а ее увеличение также увеличивает амплитуду мишени. Это может быть полезно при амплитудном мультиплексировании.
  5. Проверьте аналитическую чувствительность с учетом различных параметров, включая предел пустоты (LoB), предел обнаружения (LoD), специфичность и чувствительность, используя как стандартные, так и тестовые образцы, по желанию.

3. Рабочий процесс ddPCR (рис. 1B) и разработка анализа (табл. 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Как и другие системы обнаружения ddPCR, этот рабочий процесс также состоит из четырех этапов (рис. 1B), включая подготовку реакционной смеси, генерацию капель, амплификацию ПЦР и считывание капель.

  1. Приготовление реакционной смеси
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все анализы в чистом отдельном помещении и внутри BSC. Соблюдайте стандартные меры предосторожности, включая использование чистых перчаток, чистых пипеток, воды без нуклеаз и дезинфицирующих средств. Аликвотные реагенты в отдельных пробирках и хранят при температуре -20 °C, чтобы избежать повторных циклов замораживания и оттаивания. Подготовьте анализы, как показано в таблице 2. Растворы праймера и зонда следует хранить в высоких концентрациях 100 мкМ. Рабочие растворы можно хранить в аликвотах 20-40 мкМ (разбавленных в безнуклеазной воде).
    1. Общие этапы во всех анализах
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед подготовкой анализов рассчитайте общий объем необходимого мастермикса на основе количества образцов. Здесь объем каждого компонента мастермикса был умножен на 1,05, чтобы учесть любые ошибки пипетирования.
      1. Разморозьте и уравновесьте реакционные материалы до комнатной температуры. Кратковременно встряхните компоненты реакций (30 с) для обеспечения однородности и кратковременно центрифугу для сбора содержимого на дне пробирки.
      2. Приготовьте смесь праймер-зонд (ПП) для каждого анализа, смешивая конкретные объемы реакции, как указано в таблице 2 , из рабочих растворов.
      3. Приготовьте мастер-микс путем смешивания 11 мкл (1x) 2x суперсмеси ddPCR для зондов (без dUTP), смеси PP (в зависимости от анализа, как показано в таблице 2 рабочего раствора) и воды, свободной от нуклеаз, до конечного объема 19,8 мкл на лунку. Распределите мастермикс в лунки безнуклеазной 96-луночной планшета ddPCR в зависимости от количества образцов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для пробоотборника убедитесь, что все 8 скважин в одной колонне имеют раствор. Если используется только несколько лунок, например, 5 образцов, заполните остальные 3 лунки 22 мкл воды, не содержащей нуклеаз, или контрольного буфера каждая.
      4. Чтобы получить окончательный объем реакционной смеси (22 мкл), добавьте 2,2 мкл образца кДНК на лунку, содержащую мастермикс. Запечатайте пластину одноразовым запайщиком пластин для ПЦР.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните добавление образцов в специально отведенном для этого помещении. Включите элементы управления, т. е. положительные, NTC и извлечение. Кроме того, если образцы РНК имеют низкую концентрацию, уменьшите объем воды в мастермиксе и соответственно увеличьте объем образца до 5,5 мкл.
      5. После того, как реакционная смесь распределена по лунке, кратковременно встряхните (15-30 с) и центрифугу (10-15 с), чтобы собрать содержимое на дне пластины. Приступайте к генерации капель.
  2. Автоматическая генерация капель (дополнительный рисунок 1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать различные генераторы капель; однако это исследование было выполнено с помощью автоматизированного генератора капель (AutoDG). Чтобы избежать загрязнения ампликоном, убедитесь, что генератор капель и считыватели имеют выделенное место в отдельных областях. При загрузке расходных материалов рекомендуется начинать загрузку с задней части прибора, работающей спереди, чтобы избежать перемещения рук над расходными материалами во избежание перекрестного загрязнения.
    1. Приобретите все расходные материалы, необходимые для настройки AutoDG, включая масло AutoDG для зондов, картриджи DG32, наконечники для пипеток, блок охлаждения, планшет для образцов, планшет для капель (новая чистая пластина ddPCR) и мусорный бак.
    2. На сенсорном экране AutoDG нажмите Configure Sample Plate, выберите столбцы, в которых находятся образцы на образце, и нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экран станет желтым, указывая на LOAD, где должны быть загружены расходные материалы.
    3. Откройте дверцу AutoDG и загрузите расходные материалы на соответствующие места.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие места, где должны быть загружены расходные материалы, будут иметь желтый индикатор, который позже станет зеленым, если расходные материалы будут загружены. Это похоже на сенсорный экран.
    4. Загрузите пластину для образцов и пластину для генерации капель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина для генерации капель должна быть размещена на охлаждающем блоке. Убедитесь, что охлаждающий блок фиолетовый (готов к использованию), а не розовый (его следует хранить в морозильной камере, пока цвет не станет фиолетовым).
    5. Закройте дверцу AutoDG, убедитесь, что экран горит зеленым цветом (расходные материалы загружены), и выберите/убедитесь, что тип масла — «Масло для зондов », прежде чем нажимать кнопку «Начать генерацию капель».
    6. Подождите, пока капли не сгенерируются. Откройте дверцу, как только на экране появится надпись «Капли готовы », и извлеките пластину, содержащую капли.
    7. Запечатайте пластину с помощью прокалываемой фольги с помощью запайщика пластин, настроенного на работу при 185 °C в течение 5 с. Приступают к ПЦР-амплификации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР-амплификацию следует начинать в течение 30 минут после генерации капель.
  3. ПЦР-амплификация
    1. Вставьте герметичную пластину с каплями в термоциклер глубиной 96 скважин, установите объем образца на 40 мкл и температуру крышки на 105 °C.
    2. ПЦР амплифицирует капли с помощью программы: 95 °C в течение 10 мин (активация фермента), 40 циклов денатурации при 94 °C в течение 30 с и 1 мин отжиг/удлинение при 57 °C, дезактивация фермента при 98 °C в течение 10 мин и стадия выдержки при 4 °C в течение неопределенного времени. После ПЦР считайте капли или храните при температуре 4 °C до 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте скорость нарастания 2 °C / с на всех этапах, так как скорость нарастания может отличаться для разных термоциклеров. Держите пластину не менее 30 минут при температуре 4 °C, чтобы обеспечить стабилизацию капель перед считыванием капель.
  4. Считывание капель
    1. Перенесите термоциклированную 96-луночную пластину в считыватель капель и на компьютере, подключенном к считывателю капель, откройте/запустите прилагаемое программное обеспечение.
    2. В режиме настройки выберите « Создать », а затем дважды щелкните любую скважину, чтобы открыть диалоговое окно «Редактор скважин ». Выберите скважины для считывания и выберите Эксперимент: ABS, Супермикс: ddPCR Супермикс для зондов (без dUTP), Тип цели 1: Ch1 Неизвестно, Тип цели 2: Ch2 Неизвестен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный, пустой, NTC или положительный результат можно выбрать в раскрывающемся меню целевого типа 1/2 для контрольных образцов.
    3. Назначьте целевое имя или имя образца на основе макета пластины и нажмите кнопку Применить. Когда закончите, нажмите кнопку ОК и сохраните созданный шаблон. Нажмите « Выполнить» и при появлении запроса выберите правильный цвет (FAM/HEX).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед первым запуском рекомендуется заправить систему перед первым запуском дня. Кроме того, проверьте, все ли индикаторы в считывателе горят зеленым цветом, и если нет, следуйте рекомендациям по применению в состоянии всплывающей подсказки.
    4. После завершения сбора данных снимите пластину со считывателя. Анализируйте данные по мере необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку предварительные результаты можно увидеть на экране, запуск положительных проб в первых скважинах можно использовать для проверки качества в режиме реального времени.

4. Анализ данных (дополнительные рисунки 2 и 3)

  1. Проверьте данные из всех лунок на общее количество капель. Если количество капель составляет < 10 000, то откажитесь от результатов и повторите анализ. Установите отсечку, чтобы принять положительные и отрицательные результаты. Например, количество капель до 3 или более положительных капель можно рассматривать как порог для положительных результатов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные для всех анализов, включая симплексные, дуплексные, триплексные зондовые и квадруплексные анализы, генерируются с помощью прилагаемого программного обеспечения. Однако это программное обеспечение подходит только для симплексных и дуплексных анализов. Для мультиплексных анализов высокого порядка (>3 мишени) требуется внешнее программное обеспечение.
  2. Симплексные и дуплексные анализы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внешнее программное обеспечение также может анализировать симплексные и дуплексные данные. Тем не менее, использование сопутствующего программного обеспечения проще для этих анализов, поэтому они используются в этой статье.
    1. Дважды щелкните файл .qlp, который нужно проанализировать, чтобы открыть его, и выберите «Анализировать».
    2. Используйте пороговые инструменты в 1D Amplitude и 2D Amplitude, чтобы различать положительные и отрицательные капли для каждой лунки в правильном канале. NTC и положительные контрольные образцы могут быть использованы в качестве руководства для установки пороговых значений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты FAM видны на канале 1, а HEX/VIC - на канале 2.
    3. После установки порогового значения результаты могут быть экспортированы в виде файла .csv и дополнительно проанализированы в Excel или записаны путем чтения непосредственно в окне результатов.
  3. Смесь триплексных зондов (дополнительный рисунок 2) и квадруплексные анализы (дополнительный рисунок 2)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед анализом смеси триплексных зондов и квадруплексного анализа загрузите внешнее программное обеспечение. Перед установкой ознакомьтесь с минимальными системными требованиями.
    1. Откройте файл .qlp, щелкнув его правой кнопкой мыши и выбрав « Открыть с помощью внешнего программного обеспечения», или открыв внешнее программное обеспечение и щелкнув параметр « Обзор », чтобы найти файл .qlp в своей папке, или просто перетащив файл .qlp и поместив его в уже открытое внешнее программное обеспечение.
    2. На вкладке редактора пластин выберите скважины для анализа в правой части вкладки.
      1. Для смеси триплексных зондов выберите Direct Quantification (DQ) в качестве типа эксперимента, выберите Probe Mix Triplex в качестве информации об анализе и введите соответствующие имена целей, а затем нажмите «Применить».
      2. Для квадруплекса выберите « Прямое количественное определение» (DQ) в качестве типа эксперимента, выберите «Амплитудный мультиплекс » в качестве информации анализа и введите соответствующие имена целей, а затем нажмите « Применить».
    3. В левой части вкладки «2D-амплитуда» используйте инструменты «График », чтобы назначить определенные цвета различным целевым кластерам, следуя всплывающим предложениям окна « Выбор для назначения кластера ».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительный режим кластера может быть применен в зависимости от предпочтений пользователей.
    4. После того, как целевые цвета назначены, данные количественной оценки можно прочитать в окне «Скважинные данные» в правом нижнем углу. Экспортируйте данные в Excel/csv для дальнейшего анализа с помощью значка с тремя полосами в правом верхнем углу таблицы скважинных данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В экспериментальном исследовании аналитическая эффективность мультиплексных анализов была протестирована на клинических и исследовательских образцах19. Эффективность мультиплексных анализов была выше, чем у ОТ-ПЦР19. Поскольку низкое количество капель может указывать на проблему во время генерации капель, в этой статье на основе эмпирических данных было установлено пороговое значение в 10 000 капель на лунку.

Хорошее разделение между положительны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует мало ресурсов о том, как разрабатывать анализы RT-ddPCR для обнаружения SARS-CoV-2. Хотя стандартные образцы с известными копиями не используются в этой статье, они могут быть использованы для разработки и оптимизации анализов. Однако в этой работе образцы SARS-CoV-2, выращенные в клетках Vero-E6, были добавлены в фон геномной РНК человека и использовались в качестве стандартных образцов для разработки анализов. Правильные последовательности праймера и зонда имеют важное значение при разработке анализов. Поско...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов для раскрытия.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Мегапроектом по борьбе с инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения Китая, номер гранта 2017ZX10302301-005 и Китайско-африканским совместным исследовательским центром, номер гранта SAJC201605.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
32-канальный полностью автоматический экстрактор нуклеиновых кислот Очиститель 32Genfine BiotechFHT101-32Автоматизированный экстрактор для РНК
AutoDG Масло для зондовBioRad12003017QX200 AutoDG расходные
материалы ddPCR 96-луночные планшетыBioRad12003185
ddPCR Supermix для зондов (без dUTP)BioRad1863024Создание мастермикса для анализа ddPCR
Картриджи DG32AutoDG BioRad1864108QX200 Расходные материалы AutoDG
Электронная термостатическая баня для водыChangfeng Instrument and Meter CompanyXMTD-8000Тепловая инактивация образцов Набор для экстракции
ДНК/РНК вируса FineMag Rapid Bead Virus Набор для экстракции ДНК/РНКGenfine BiotechFMY502T5Экстракция магнитными шариками из образцов инактивированной РНК
Термосвариваемостьиз фольгиBioRad1814040
Наконечники для пипеток AutoDGBioRad1864120QX200 Расходные
контейнеры для отходов с наконечником для пипеток AutoDGBioRad1864125QX200 AutoDG
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)TaKaRaRR036AcDNA generation
PX1 PCR Plate SealerBioRad1814000Запечатайте капельную пластину от AutoDG
QuantaSoft 1.7 Программное обеспечениеBioRad10026368Сбор и анализ данных
QuantaSoft Analysis Pro 1.0BioRadN/A Анализданных
QX200 Автоматический герератор капель (AutoDG)BioRad1864101QX200 Расходные материалы AutoDG
Считыватель капель QX200BioRad1864003Считывание капель и сбор данных
T100 ТермоамплификаторBioRad1861096амплификацию мишеней по каплям (ПЦР) и генерацию кДНК
Beijing

Ссылки

  1. Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
  2. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
  3. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), Basel, Switzerland. 1271(2018).
  4. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236(1999).
  5. Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621(2017).
  6. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  7. Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
  8. Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
  9. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
  10. Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370(2020).
  11. Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
  12. Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302(2020).
  13. Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
  14. Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
  15. Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451(2016).
  16. Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701(2020).
  17. VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
  18. Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
  19. Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ddPCRRT ddPCR

Похожие статьи