Покадровая визуализация арборизации нейронов с использованием разреженной аденоассоциированной вирусной маркировки генетически целевых популяций клеток сетчатки

Дендриты нейронов сетчатки образуют сложные, но специфические паттерны, которые влияют на их функцию в нейронных цепях. В сетчатке позвоночных различные типы ганглиозных клеток сетчатки (RGC) и интернейроны амакриновых клеток имеют уникальную дендритную морфологию, которая отличается размером беседки, расположением, длиной ветвей и ^{плотностью1}. Во время постнатального развития RGC и амакриновые клетки распространяют обильные дендритные процессы в нейропил, называемый внутренним плексиформным слоем (IPL), где они получают биполярные клеточные входы, передающие сигналы фоторецепторов2. С учетом покадровой визуализации флуоресцентно меченых популяций сетчатки у личинок цыплят или рыбок данио, морфогенез дендритов очень динамичен3,4,5. В течение нескольких дней дендритные беседки расширяются, реконструируются и разветвляются до узких подслоев IPL, где они синапсируются с избранными партнерами. Беседки демонстрируют различную структурную динамику над развитием, с изменениями относительных скоростей добавления ветвей, втягивания и стабилизации. Дендриты амакрина и RGC также демонстрируют различное поведение роста и ремоделирования, которое может отражать типоспецифическую арборизацию. Тем не менее, эти исследования отслеживали широкие популяции амакрина или RGC и были сосредоточены на ламинарном нацеливании, которое является лишь одним из аспектов морфологии.

Механизмы, которые производят огромное морфологическое разнообразие, наблюдаемое среди подтипов сетчатки, плохо изучены. Целью этой группы была разработка метода захвата динамики дендритов и ремоделирования беседки определенных подтипов сетчатки у мышей. Идентификация специфических для типа клеток механизмов дендритового паттерна требует методов визуализации и измерения дендритового поведения интересующих клеток. Органотипические культуры сетчатки мышей хорошо подходят для исследований изображений живых клеток с использованием конфокальной или многофотонной микроскопии. Развивающиеся сетчатки рассекаются и монтируются в плоскую эксплант, которая может быть изображена в течение нескольких часов в записывающей камере или культивирована в течение нескольких дней с ограниченным воздействием на ^{схему6,7}. Живые нейроны сетчатки могут быть помечены различными методами, включая заполнение красителем электродами, электропорацию, биолистическую доставку частиц, покрытых липофильными красителями или плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки (например, Gene Gun), а также генетически закодированные клеточные метки7,8,9,10 . Однако эти подходы неэффективны для визуализации динамики дендритов конкретных подтипов сетчатки. Например, методы наполнения красителем имеют низкую пропускную способность и требуют электрофизиологического аппарата и дополнительных генетических меток для надежного нацеливания на интересующие клетки. Кроме того, сильные флуоресцентные сигналы в соме могут скрывать близлежащие дендриты.

Биолистические методы доставки генов могут одновременно маркировать десятки клеток, но этапы, включающие доставку частиц высокого давления и ночную инкубацию изолированной сетчатки, могут поставить под угрозу физиологию клеток и дендритный рост. В этой статье предполагается, что последние генетические инструменты могут быть использованы для захвата ранней динамики дендритов с типом клеток и структурным разрешением, учитывая следующие экспериментальные критерии. Во-первых, чтобы разрешить тонкие ветви и филоподии, которые доминируют над развивающимися беседками, метод должен маркировать нейроны яркими, флуоресцентными белками, которые заполняют процессы во всей беседке. Флуоресцентная маркировка не должна исчезать из-за фотоотбеливания в течение периода визуализации. Различные варианты флуоресцентных белков были сгенерированы и сравнены на предмет пригодности для визуализации in vivo/ex ^vivo11 на основе яркости и фотостабильности. Во-вторых, флуоресцентные белки (XFP) должны быть выражены на достаточно высоких уровнях на самой ранней стадии морфогенеза дендритов, чтобы не пропустить узкое окно развития. При анализе статических временных точек в сетчатке мыши развитие дендрита происходит в течение первой постнатальной недели и включает фазы роста, ремоделирования и стабилизации10,12,13,14,15. В-третьих, метод должен привести к селективной маркировке или к повышенной вероятности маркировки интересующей нейронной субпопуляции. В-четвертых, маркировка целевой субпопуляции должна быть достаточно разреженной, чтобы можно было идентифицировать и проследить всю нейрональную беседку. Хотя подтипы RGC и amacrine можно отличить по их зрелым морфологическим характеристикам и моделям стратификации IPL16,17,18,19,20, задача состоит в том, чтобы идентифицировать подтипы во время развития на основе незрелых структур. Этой задаче способствует расширение трансгенных инструментов для маркировки конкретных типов клеток сетчатки во время развития.

Трансгенные и мышиные линии, в которых клеточная и временная экспрессия флуоресцентных белков или Cre определяется регуляторными элементами генов, широко используются для изучения типов клеток сетчатки13,21,22,23. Основные наблюдения за субтип-специфическими паттернами развития дендритов были получены из исследований трансгенных сетчаток мыши в статических точках времени10,14,24,25. Система Cre-Lox, в частности, позволяет осуществлять изысканные манипуляции с генами и мониторинг подтипов с использованием различных рекомбиназозависимых репортеров, датчиков и оптогенетических активаторов. Эти инструменты привели к открытию подтип-специфических молекулярных программ и функциональных свойств, которые лежат в основе сборки схем сетчатки26,27,28,29,30. Тем не менее, их еще предстоит использовать для изучения подтип-специфической динамики дендритов в сетчатке мыши. Маркировка низкой плотности может быть достигнута путем объединения линий мыши Cre с трансгенами, введенными электропорацией или рекомбинантными AAV. При наличии также могут быть использованы тамоксифен-индуцируемые линии Cre или интерсекциональные генетические стратегии. Наконец, клетка должна быть помечена минимально инвазивным способом и визуализирована с использованием параметров приобретения, чтобы не компрометировать ткань или не вмешиваться в клеточную функцию, необходимую для морфогенеза дендрита.

Здесь представлен метод применения трансгенных инструментов и конфокальной микроскопии для исследования динамики дендритов в живых эксплантах сетчатки живых мышей. Трансгенные линии мыши Cre были объединены с векторами AAV, которые экспрессируют флуоресцентные белки при рекомбинации Cre, что позволяет разреженно маркировать интересующие клетки сетчатки. Коммерчески доступные AAV доставляются в неонатальную сетчатку с помощью интравитреальных инъекций. В этой статье показано, что AAV производят значительно высокую и специфическую для типа клеток флуоресцентную экспрессию на 4 dpi, что позволяет получить доступ к постнатальным временным точкам. Чтобы проиллюстрировать этот подход, холинергический «звездообразующий» интернейрон амакрина был помечен путем доставки Brainbow AAV у неонатальных мышей, экспрессирующих холинацетилтрансферазу (ChAT)-внутренний сайт входа рибосомы (IRES)-Трансген Cre, который активен в ранней постнатальной сетчатке31,32. Звездообразующие амакриновые клетки развивают стереотипную и радиальную морфологию беседки, которая формируется дендрритным самоизбытием, опосредованным кластеризованными протокадгеринами33,34. В данной работе показано, что разрешение звездообразования дендритов и филоподий значительно улучшается XFP к плазматической мембране с добавлением мотива CAAX, который подвергается фарнезилированию, как это используется для Brainbow ^AAVs31. Наконец, были определены протоколы покадровой визуализации и постобработки, которые дают высококачественные изображения, поддающиеся реконструкции дендритов и морфометрической количественной оценке. Этот протокол может быть использован для идентификации факторов, контролирующих морфогенез дендритов, и для захвата нескольких клеточных поведений в интактной сетчатке.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол охватывает 2 дня с минимальным периодом 4-5 дней для вирусной трансдукции между экспериментальными днями (рисунок 1A). Эксперименты на животных проводятся в соответствии с Руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными для использования животных в исследованиях и уходе за лабораторными животными в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по использованию и уходу за животными Лаборатории по обслуживанию животных при Больнице для больных детей (Торонто, Канада).

1. Подготовка к неонатальным инъекциям AAV и эксперименты по визуализации

1. Выберите линию мыши Cre, чтобы пометить интересующие популяции клеток сетчатки. Подтвердить экспрессию рекомбиназы Cre во время инъекций AAV путем скрещивания с трансгенным репортером Cre или путем иммуноокраширования антителом Cre.
2. Разводите трансгенных мышей Cre (8-16 недель) для получения Cre-положительных неонатальных животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой демонстрации мыши ChAT-IRES-Cre использовались для нацеливания на холинергические амакриновые клетки Starburst.
3. Получить рекомбиназно-зависимый вирус AAV, кодирующий флуоресцентный белок (белки). Для оптимальной маркировки тонких процессов выбирайте векторы, которые выражают модифицированные XFP, нацеленные на плазматическую мембрану.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались вирус Brainbow (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY и AAV9-EF1a-BbChT (см. Таблицу материалов), которые предоставляют возможность для многоцветной маркировки (рисунок 1B). Фарнезилированный улучшенный желтый флуоресцентный белок (eYFP) и мономерная экспрессия Cherry (mCherry) произвели самые сильные флуоресцентные сигналы для живой визуализации. Один BBV может быть использован для изображения отдельных беседок, в то время как совместная инъекция BBV может быть использована для маркировки большего количества клеток или соседних беседок с отчетливыми флуорофорами. При использовании нескольких флуоресцентных белков обеспечьте минимальное перекрытие спектра излучения (рисунок 1С). Параметры захвата микроскопа должны быть скорректированы для захвата различных сигналов XFP.
4. Подготовьте ∼3-5 мкл аликвот ААВ в отдельных низкосвязывающих трубках для одноразовых запасов, чтобы избежать циклов замораживания/оттаивания. Хранить при температуре -80 °C.
5. Приготовьте боросиликатные стеклянные микропипетты с очень тонкими наконечниками с помощью съемника микропипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки съемника варьируются в зависимости от используемой нити накала и съемника; Окончательный размер и форму наконечника см. на рисунке 2A . Типичный диаметр капель составляет 600 мкм.
6. Получите систему микроинъекции и связанные с ней трубки. Подключите микроинжектор к воздушному порту под давлением.

Рисунок 1: Экспериментальный обзор. (A) Этот протокол охватывает 2 дня экспериментов с минимальным 4-5-дневным периодом заражения между экспериментальными днями. Внутриглазные инъекции выполняются неонатальным мышам не старше 3-го дня. Затем сетчатка рассекается, устанавливается плоско и в реальном времени, чтобы захватить желаемое окно развития. Меченые клетки могут быть визуализированы в любое время после требуемых 4-5 дней, необходимых для экспрессии вируса, поскольку нет никаких видимых эффектов длительной экспрессии AAV на морфологию дендрита. (B) Крезависимые векторы Brainbow AAV (BBV) вводят животным, экспрессирующим ^Cre31. В этом исследовании мыши ChAT-Cre использовались для рекомбинации Cre в звездообразующих амакриновых клетках. Два BBV кодируют модифицированный eYFP или tagBFP, или mCherry и mTFP, которые заканчиваются мотивом CAAX , который последовательно фарнезилируется для локализации мембраны. Локсские участки изображены треугольниками. Векторы экспрессируют фарнезилированные XFP стохастическим и комбинаторным способом, зависящим от рекомбинации Cre. Промотор EF1α включает регуляторные элементы из гена фактора удлинения 1α. W представляет собой элементы из посттранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита Вудчака, а pA указывает на последовательность полиаденилирования. (C) Спектры возбуждения и излучения mCherry и eYFP, флуорофоров BBV, изображенных в этом исследовании. При визуализации в реальном времени нескольких флуоресцентных белков параметры обнаружения должны быть организованы таким образом, чтобы адекватно разделять спектры излучения на отдельные каналы. Сокращения: AAV = аденоассоциированный вирус; BBV = Brainbow AAV; ChAT = холин ацетилтрансфераза; iRES = внутренний сайт входа рибосомы; eYFP = усиленный желтый флуоресцентный белок; iTR = инвертированный терминальный повтор; tagBP = бирка синего флуоресцентного белка; m Вишня = мономерная вишня; mTFP = флуоресцентный белок чирка; XFP = любой флуоресцентный белок; EF1α= коэффициент удлинения 1 альфа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Интравитреальные инъекции AAV у мышей-новорожденных

1. Разморозьте аликвоту AAV на льду. Приготовьте разбавление ~1:4 AAV с использованием стерильного физиологического раствора или фосфатно-буферного физиологического раствора. Приготовьте ~ 0,5 мкл разведения AAV на животное (~ 0,25 мкл на глаз) на случай, если микропипетка сломается, и новая пипетка должна быть заполнена. Храните оставшийся неразбавленный AAV при 4 °C и используйте в течение 2 недель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте концентрация AAV поставщика составляла ~1-2 × ¹⁰¹³ содержанием генома (GC)/мл и разбавлялась до конечной концентрации 4 × ¹⁰¹² ГК/мл. Оптимизировать концентрацию вируса для получения желаемой плотности маркировки.
2. Для визуализации инъекций добавляют примерно 1 мкл 0,02% раствора красителя Fast Green FCF на каждые 15 мкл разведения AAV, чтобы окрасить раствор в синий цвет.
3. Перенесите клетку для мыши с дамбой и пометом новорожденных (послеродовой день (P) 0,5-3) в процедурный кабинет с оборудованием для микроинъекций. Держите животных в одной клетке с гнездами и подстилкой, чтобы свести к минимуму материнский стресс и отторжение детенышей.
4. Стерилизуйте область инъекции 70% этанолом и поместите стерильные прокладки для подгузников на поверхности скамейки. Подготовьте теплую платформу (например, грелку) для восстановления после анестезии, вызванной гипотермией.
5. Засыпьте микропипетку разбавлением AAV с помощью микрошприца. Под стереомикроскопом разбейте наконечник микропипетки иглой весом 30 Г, чтобы распечатать наконечник.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2А показан задний заполненный наконечник - как герметичный (сверху), так и незапечатанный (посередине).
6. Обезболивать неонатальных мышей путем переохлаждения, помещая на лед 1-2 животных. Поместите животных на латексную перчатку, чтобы защитить кожу от прямого контакта со льдом. Как только животное перестанет двигаться в ответ на ущемление лапы (~2 мин), поместите животное под стереомикроскоп. При желании татуируйте подушечки лап чернилами для татуировок и иглой 30 г, а также собирайте обрезки хвоста для выделения ДНК, чтобы идентифицировать животных путем генотипирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий мониторинг глубины анестезии должен происходить на протяжении всей процедуры.
7. Смажьте кожу, покрывающую глаза, 70% этанолом. Используйте иглу весом 30 г, чтобы открыть сросшееся веко (рисунок 2B). Приложите легкое давление пальцами, чтобы открыть глаз, и проткните небольшое отверстие через роговицу в соединении роговица-склера (рисунок 2C).
8. Вставьте стеклянную микропипетку в отверстие и нажмите на ножную педаль микроинжектора 2-4 раза, чтобы ввести AAV в интравитреальное пространство. Медленно извлеките микропипетку и подтвердите инъекцию AAV, визуализируя синий краситель через зрачок (рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При давлении выброса 6-8 фунтов на квадратный дюйм и времени импульса 600-800 мс выбрасывается капля диаметром 600 мкм (рисунок 2A, внизу). Приблизительно 0,23-0,45 мкл раствора AAV вводится на глаз. Синий раствор снаружи глаза указывает на то, что AAV не был введен в глаз. Утечка синего раствора из места инъекции указывает на то, что AAV, возможно, просочился наружу, снижая эффективность трансфекции.
9. Осторожно прижмите веки друг к другу, чтобы снова запечатать, и поместите щенка на грелую прокладку. Как только животные восстановятся в розоватом цвете и будут реагировать, осторожно перенесите их обратно в клетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что приняты соответствующие меры предосторожности, чтобы избежать слишком быстрого повторного нагрева щенков.
10. Повторите процедуру инъекции для оставшихся животных в помете. Оставьте минимум 4-5 дней для вирусной трансдукции, прежде чем визуализировать сетчатку.

Рисунок 2: Внутриглазные инъекции новорожденным. (А) Микропипетка с обратным заполнением показывает форму кончика пипетки при герметизации (сверху) и после того, как наконечник расстегнут (внизу, слева). Пико-давление впрыска 6-8 фунтов на квадратный дюйм и время импульса 600-800 мс производят каплю диаметром 600 мкм (внизу, справа). Шкала стержня = 1 мм.(B) Обезболенный щенок P0 при 16-кратном увеличении. Сросшееся соединение век (белое) разрезается с помощью острой иглы 30 G. Шкала стержня = 2 мм. (C) Легкое давление, приложенное к глазу, обнажает роговицу; шкала стержня = 2 мм. Увеличенный участок (красный) показывает небольшое отверстие на стыке роговицы и склеры (желтое), созданное иглой 30 G; шкала стержня = 0,5 мм. (D) Снятие наконечника пипетки после впрыска (слева). Быстрый зеленый краситель в растворе AAV проявляется как сине-серый через зрачок (средний), по сравнению со светлым цветом зрачка до инъекции (справа). Шкала стержня = 1 мм. (E) Через 4 дня веко зажило и срослось (слева); шкала стержня = 2 мм. При энуклеации видно зажившее место инъекции (желтый); шкала = 1 мм. Обратите внимание на расположение места инъекции на границе между роговицей и склерой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Рассечение сетчатки для визуализационного эксперимента

1. Готовят сетчатку aCSF (119 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,3 мМ _MgCl2·_6H2O, 2,5 мМ _CaCl2·_2H2O, 1 мМ _NaH2PO4, 11 мМ глюкозы и 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES free acid)³⁵. При желании приготовьте и заморозьте 10-кратный раствор; разморозить и разбавить до 1 раза по мере необходимости.
2. Насыщают оксигеном aCSF сетчатки, пузыря с карбогеном (95% _O2, 5% _CO2) в течение минимум 15 мин. Отрегулируйте pH до 7,4. Хранить в герметичном контейнере до использования, чтобы гарантировать, что aCSF остается насыщенным кислородом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатке требуется высокая концентрация _O2. Важно поддерживать оксигенацию aCSF на протяжении всего эксперимента.
3. Вставьте чашку Петри диаметром 60 мм в лоток для льда (сделайте лоток для льда из лабораторного пластика, например, крышку коробки для пипетки) и поместите ее под стереомикроскоп. Наполните чашку Петри насыщенным кислородом сетчаткой aCSF.
4. Усыпляют мышей P9 и моложе путем обезглавливания. Эвтаназия мышей P10 и старше путем индукции изофлурана или альтернативным методом, одобренным в соответствии с протоколом животных, с последующим обезглавливанием.
5. Если веки запечатаны, обрежьте лоскут века, чтобы обнажить глаз. Используйте щипцы для энуклеации глаз и переведите их в холодную сетчатку aCSF с шага 3.3.
6. Чтобы рассечь чашечку сетчатки под стереомикроскопом (увеличение 25x), стабилизируйте глаз, обхватив зрительный нерв с помощью щипца Дюмона No 5 (рисунок 3A).
7. Проткните отверстие в центре роговицы иглой 30 Г, а затем вставьте один кончик микросубчиков в отверстие, чтобы сделать разрез от отверстия до конца роговицы. Повторите, чтобы сделать 4 среза по сторонам света, создав 4 «лоскута» (рисунок 3A).
8. С помощью двух щипцов Дюмона No 5 схватите и раздвиньте два соседних лоскута, осторожно отшелушивая склеру от сетчатки. Повторите с оставшимися лоскутами роговицы и удалите склеру из сетчатки (рисунок 3B).
9. Снимите хрусталик с чашечки сетчатки с помощью щипцов. С помощью микросублиц, сделайте 4 радиальных разреза от края сетчатки в сторону зрительного нерва, создав 4 равных лепестка (рисунок 3B). Повторите шаги 3.4-3.7 для второго глаза.

4. Подготовка к плоскому креплению сетчатки

1. Подготовьте серые мембранные фильтрующие диски из эфира целлюлозы (MCE) для монтажа. При использовании мембранных фильтров MCE большого диаметра разрежьте диск на квадранты (примерно 1 см в поперечнике). Поместите диск MCE в центр большой белой фильтровальной бумаги (рисунок 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтры MCE также доступны в дисках диаметром 1 см. Фильтрующий диск MCE должен быть достаточно большим, чтобы вместить 1-2 сетчатки, но достаточно маленьким, чтобы поместиться в камере визуализации. Поскольку мембраны MCE удерживают статический заряд, минимизируйте контакт и обработку мембраны MCE.
2. Обрабатывая сетчатку с помощью двух кистей размера 3/0, переверните одну чашку сетчатки на кисть с ганглиозной клеткой сетчатки стороной вниз. Осторожно поднимите сетчатку из aCSF, убедившись, что натяжение воды не разрывает сетчатку (рисунок 3C).
3. Все еще держа кисть с сетчаткой, используйте переносную пипетку, чтобы поместить каплю aCSF в центр фильтровальной бумаги MCE (рисунок 3C, справа). Поместите сетчатку в каплю aCSF, созданную поверхностным натяжением. Используйте кисти, чтобы расположить RGC сетчатки стороной вверх внутри капли и развернуть четыре лепестка.
4. После позиционирования создайте водный мост между кистью и белой фильтровальной бумагой, чтобы разрушить поверхностное натяжение капли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда aCSF удаляется, сетчатка будет прилипать к фильтровальной бумаге MCE (рисунок 3D, E). Плоские сетчатки можно обрабатывать, захватывая диск MCE щипцами. Если капля aCSF быстро оттекает до формирования водного моста, это может указывать на то, что мембрана MCE не заряжена. Используйте свежую мембрану MCE и минимизируйте время между энуклеацией и визуализацией путем рассечения и плоского монтажа сетчатки непосредственно перед перемещением сетчатки в камеру визуализации.

Рисунок 3: Рассечение сетчатки и плоское крепление на смешанных мембранах фильтрующего эфира целлюлозы. (А) Слева энуклеированный глаз стабилизируется путем захвата зрительного нерва щипцами Дюмона No 5 (слева). Небольшое отверстие создается в центре роговицы с помощью иглы 30 г (в центре). Микродиссекционные ножницы используются для разрезания роговицы на 4 равных лоскута (справа). Шкала стержня = 1 мм. (B) Рассеченная сетчатка со склерой, отслоенной с помощью двух щипцов Дюмона #5 (слева) и со снятой линзой (в центре). Сетчатка с 4 равными разрезами на полпути в сетчатку (справа). Шкала = 1 мм. (C) Обработка сетчатки двумя тонкими кистями (размер 3/0, слева). Сетчатка перевернулась с ганглиозными клетками сетчатки стороной вниз на кисть (в центре) и поднялась из aCSF, убедившись, что натяжение воды не разрывает сетчатку (справа). Шкала = 2 мм. (D) Серый мембранный диск MCE помещен на белую фильтровальную бумагу (слева). Капля aCSF на диске MCE (справа). Шкала = 1 см. (E) После плавания сетчатки в каплю и их позиционирования создайте водный мост с белой фильтровальной бумагой, чтобы вместить aCSF, потянув сетчатку на заряженную бумагу MCE (слева); шкала = 1 см. Увеличенное изображение мембраны MCE (красный) показывает 2 сетчатки, установленные с ганглиозными клетками сетчатки, стороной вверх (справа); шкала стержня = 2 мм. Одна сетчатка очерчена белым цветом. Сокращения: MCE = смешанный эфир целлюлозы; aCSF = искусственная спинномозговая жидкость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Покадровая конфокальная визуализация живых препаратов сетчатки с цельным креплением

1. Соберите инкубационную камеру с живой визуализацией для вертикального конфокального микроскопа, как показано на рисунке 4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для перевернутых конфокальных систем плоские крепления размещаются стороной RGC вниз непосредственно на стеклянном нижнем крышке инкубационной камеры. Как только сетчатка вступает в контакт с покровом, их нельзя перемещать.
2. Наполните камеру насыщенным кислородом aCSF, включите насос и регулятор температуры (температура 32-34 °C, расход 1 мл/мин). Не допускайте повышения температуры выше 34 °C.
3. Чтобы перенести плоское крепление сетчатки в перфузионную камеру, остановите насос и удалите aCSF, который находится в камере. Поместите диск MCE с плоским креплением сетчатки в (пустую) инкубационную камеру.
4. Поместите вес образца на плоское крепление; предварительно смажьте вес, чтобы нарушить поверхностное натяжение. Наполните камеру нагретым aCSF и циркулируйте aCSF со скоростью ~1 мл/мин.
5. Поместите носовую часть с 25-кратным водоопускательным объективом (числовая диафрагма 0,95) в камеру визуализации. Экран для меченых клеток, представляющих интерес, с использованием эпифлуоресцентного света (рисунок 4C).
6. Отрегулируйте объем изображения, чтобы захватить интересующие дендритные особенности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование зафиксировало полную дендритную беседку при 1024 x 1024 пикселях на кадр, z-шаг 1 мкм и частоту кадров 2 мин между каждым z-стеком. Окончательные размеры изображения ~ 100 мкм x 100 мкм x 20 мкм.
7. Чтобы настроить мощность лазера на оптимальную настройку, используйте таблицу поиска, которая идентифицирует как перенасыщенные, так и недонасыщенные пиксели. Во время сканирования отрегулируйте мощность лазера таким образом, чтобы ни один пиксель не был перенасыщен (т.е. с интенсивностью 255 или выше). Продолжайте визуализацию до тех пор, пока это необходимо, или до тех пор, пока не произойдет значительного и обнаруживаемого снижения флуоресцентного сигнала и увеличения шума (обычно 2-4 ч).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется уменьшить мощность лазера, так как алгоритмы деконволюции работают оптимально, когда пиксели распределены по всему динамическому диапазону. Интенсивность пикселей не должна превышать 254; Эмпирический анализ нейритов показал, что значения пикселей ниже 170 идеально подходят для деконволюции. Высокая скорость сканирования (400-600 Гц) с усреднением строк (2-3) предпочтительнее одиночного, более медленного сканирования с тем же общим временем ожидания пикселя. Область длительной визуализации часто имеет фотоблоки, но другие эксплантные участки остаются жизнеспособными. Несколько областей в плоском креплении могут быть сфотографированы, каждая в течение 2-4 ч, с общим временем инкубации 6 часов. Сеансы визуализации после 6 ч не подвергались систематическому тестированию. Деградация нейритов и блеббинг являются признаками того, что жизнеспособность экспланта снижается.
8. После визуализации зафиксируйте плоские крепления сетчатки и мембранный фильтр холодным 4% параформальдегидом в течение 1-2 ч при 4 °C. Усиливайте флуоресцентные метки в фиксированных сетчатках с помощью иммуногистохимии для дальнейших анализов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поствизуальная фиксация невозможна при использовании перевернутого конфокала; сетчатки не удаляются без разрушения тканей.

Рисунок 4: Установка инкубационной камеры визуализации живых клеток. (A) Инкубационное устройство с живой визуализацией, показывающее компоненты нагрева, раствора и визуализации. Двойной нагреватель включает в себя платформу с подогревом инкубационной камеры (задний круг с синими соединительными электродами) и встроенный нагреватель раствора. (B) Принципиальная схема 4A. Плоское крепление сетчатки (красное) на мембране MCE (серое) помещается в инкубационную камеру. Встроенный нагреватель раствора соединен с насосом раствора (не изображен на рисунке 4А). Размеры камеры визуализации обеспечивают хорошую рабочую зону для опускающегося объективного носа. (C) 25-кратный вид эксплантата сетчатки, вводимого с 0,23-0,45 мкл 4 × ¹⁰¹² ГК/мл разбавления AAV; шкала бар = 100 мкм. Плотная маркировка клеток часто окружает головку зрительного нерва (пунктирная линия, внизу справа); шкала шкалы = 50 мкм. Сокращения: MCE = смешанный эфир целлюлозы; GC = копии генома; m Вишня = мономерная вишня; eYFP = усиленный желтый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Деконволюция и постобработка изображений в ImageJ

1. Импортируйте серию изображений, разделите серию по времени и цвету, если это многоцветное изображение. Убедитесь, что все временные точки для одного цвета содержатся в одной папке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Импорт биоформатов при использовании ImageJ (биоформаты автоматически включаются в FIJI).
2. Создайте теоретическую функцию точечного разброса (PSF) с помощью плагина ImageJ, Diffraction PSF 3D.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый канал визуализации требует своего собственного PSF, поскольку длина волны флуоресцентного излучения белка влияет на PSF.
3. Использование плагинов | Макросы | Запустите для выполнения пакетной параллельной итеративной деконволюции для всех временных точек с помощью предоставленного макроса (дополнительный файл 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот макрос выполняет 25 итераций итеративного алгоритма Landweber (WPL) wiener Filter Preconditioned Landweber (WPL). Каждый цветовой канал должен быть деконволюцией отдельно.
4. Объедините цветовые каналы и скомпилируйте все временные точки в Гиперстек (Image | Гиперстеки | Стеки в Гиперстек). Исправьте 3D-дрейф с помощью плагинов | Регистрационный | Правильный 3D дрифт.
5. Возврат изображения в обычный стек (Image | Гиперстеки | Hyperstack to Stack) и разделение временных точек (Image | Стеки | Инструменты | Сплиттер стека). Используйте пакетную обработку для создания максимальной проекции для всех временных точек (Process | Пакетная | Макро | run("Z Project...", "projection=[Max Intensity]"); ).
6. Импорт последовательности покадровых изображений (файл | Импорт | Последовательность изображений). Используйте обычные инструменты ImageJ для желаемого анализа деконволюционного и постобработанного двумерного (2D) видео.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Четырехмерные (3D + время) деконволюционные и дрифт-скорректированные видео можно рассматривать как гиперстек. Опустите предыдущий шаг, чтобы сохранить 3D-точки времени.

Используя вышеуказанный протокол, было получено, деконволюционное и скорректировано для 3D-дрейфа 3D-видео с высоким разрешением разработки дендритов звездообразующих клеток. Максимальные проекции Z-плоскости были созданы для создания 2D-видео для анализа (Дополнительное видео 1, рисунок 5A). 3D-деконволюция каждой точки времени увеличивала разрешение проекций тонкой филоподии (рисунок 5B,C). Тонкие протрузии филоподии являются особенностью развития дендритов сетчатки36 и должны быть видны во время визуализации. Трансфекция AAV будет производить изменчивость плотности маркировки клеток и интенсивности флуоресценции. Таким образом, скрининг меченой ткани для выбора клеток с высокими флуоресцентными сигналами для визуализации и получения высококачественных видео. Увеличение мощности лазера для обнаружения тускло меченых ячеек не рекомендуется, так как это может привести к быстрому фотоотбеливанию и ввести высокий шум по сравнению с сигналом. Достаточно яркие клетки видны в пределах 5 dpi. К 12 dpi и выше длительные периоды заражения AAV не обязательно приводят к повышенной флуоресценции меченых клеток (рисунок 5D).

Чрезмерная флуоресценция и скученность нейритов от плотной маркировки клеток влияют на качество изображения и могут препятствовать одноклеточным реконструкциям. Оптимизация разбавления и объема AAV требуется для достижения желаемой степени изолированных и флуоресцентно меченых беседок, которые отделимы от остальной части популяции клеток-мишеней. Здесь 9,2 × 108-1,8 × 109 вирусных ГК были введены на глаз для нацеливания на звездообразующие амакриновые клетки (0,23-0,45 мкл AAV с титром 4 × 1012 GC / mL). Отсутствие флуоресцентного сигнала может отражать неэффективный метод впрыска. Во время инъекции утечка синего раствора AAV из места инъекции указывает на то, что вирус не доставляется в сетчатку или что объем или давление инъекции слишком высоки. Избыточный объем инъекции или давление могут вызвать отслоение сетчатки и / или потерю глазного давления, повреждая клетки сетчатки и снижая эффективность маркировки клеток. Оба вопроса могут быть решены с помощью практики и оптимизации техники инъекций. Другие потенциальные причины отсутствия сигнала включают деградацию AAV из-за неправильного хранения или недостаточной экспрессии Cre, поскольку трансген Cre не активен в период трансфекции AAV.

После того, как видео деконволюционны, можно выполнить динамический анализ, такой как расчет скорости сложения ветвей, втягивания или стабилизации. Кроме того, обычный статический анализ может быть выполнен на каждом таймфрейме, включая реконструкцию нейронов и морфометрические количественные оценки, такие как общая длина ветви, углы ветвления, порядок ветвей или количество конечных точек ветвления. Результатом этого протокола является временный ряд стеков 3D-изображений с высоким разрешением. Большинство динамических 3D-нейритных видео вручную количественно определяются как максимальная проекция с использованием программного обеспечения для визуализации изображений с открытым исходным кодом, такого как ImageJ37. Другой инструмент с открытым исходным кодом, Vaa3D38, был разработан специально для визуализации больших объемов. Если видео должно быть проанализировано в 3D, рекомендуется использовать 3D + визуализатор времени, такой как Vaa3D. ImageJ и Vaa3D обеспечивают прямой доступ к пикселям или вокселям на изображении, но часто реконструкции нейронов создаются путем преобразования пиксельных данных в скелетонизированные реконструкции дерева. Автоматическая или полуавтоматическая реконструкция нейронов для одиночных временных точек может быть выполнена с открытым исходным кодом39,40,41 и проприетарным программным обеспечением. Для анализа покадровых реконструкций каждая точка реконструкции должна быть связана с предыдущими и последующими временными точками. Выравнивание сложных дендритных морфологий с течением времени, которые могут быть закодированы более чем 500 точками данных, остается сложной проблемой. Доступно множество инструментов с различными сильными сторонами и ограничениями, и они должны быть выбраны в соответствии с анализами, необходимыми для исследования.

Рисунок 5: Репрезентативные результаты после неонатальной внутриглазной инъекции, покадровой визуализации и деконволюции. (A) Максимальные проекции деконволюционной серии покадровых изображений (h:min) звездообразующей амакриновой клетки P6 через 5 дней после инъекции AAV. Тонкую динамику филоподии теперь можно анализировать с помощью обычных инструментов ImageJ. Подсвечивается область дендритной утонченности (красная рамка) и область дендритного роста (зеленая рамка). (В, С) Одна звездообразующая амакриновая клетка P6, меченая мембранной маркировкой eYFP через 5 дней после инъекции AAV (dpi), показывает яркую одноклеточную маркировку. Шкала для верхних панелей = 50 мкм; шкала стержней для нижних панелей = 25 мкм. До (A) и после (B) деконволюции с ImageJ. Вставки (красный) показывают размах в результате успешной деконволюции. (D) Амакриновая ячейка P6 5dpi (слева) по сравнению с ячейкой звездообразования P12 11 dpi показывает аналогичные уровни экспрессии флуоресцентного белка. Увеличение времени инкубации AAV не увеличивает флуоресцентный сигнал. Флуоресцентные сигналы не снижаются при более длительных периодах заражения AAV. К обоим изображениям были применены идентичные параметры захвата и постобработки. Увеличенная толщина ветвей и варикозное расширение вен, наблюдаемое при P12, являются нормальными особенностями созревания звездообразования, а не артефактом маркировки или визуализации. Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: AAV = аденоассоциированный вирус; eYFP = усиленный желтый флуоресцентный белок; dpi = дни после заражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Рекомендации по выбору линии Cre и локализации флуоресцентного белка.

(А-Д) Живые ганглиозные клетки сетчатки P11, изображенные при 9 dpi BBV, введенного мышам Vglut2-iRES-Cre, у которых Cre избирательно экспрессируется в популяции RGC. (A) JAM-B RGC идентифицируется по характерной асимметричной морфологии24. (Б-Д) Различные подтипы RGC, которые различаются по своим моделям стратификации дендритов. (E) Изображение живой звездообразующей амакриновой клетки P11, биолистически трансфектированной цитозольной mCherry и захваченной вращающимся диском конфокальной при 512 x 512 пикселях. Цитозольный XFP приводит к высокому флуоресцентному сигналу в соме относительно тонких дендритных выступов. Нефокусированный свет от сомы вызывает высокую фоновую флуоресценцию при визуализации небольших проксимальных выступов (вставка в красном поле выше показана ниже). (F) Изображение живой звездообразующей амакриновой клетки P11, трансфектированной мембранно-нацеленной eYFP и захваченной конфокальным лазерным сканированием при 1024 x 1024 пикселях. Обратите внимание на флуоресцентное мембранное кольцо вокруг сомы, улучшенное отношение сигнал/шум и качество тонких проекций, близких к соме, которые производятся мембранно-целевыми флуоресцентными белками (вставка). Шкала стержней = 50 мкм, а для нижних панелей E и F = 5 мкм. Сокращения: IRES = внутренний сайт входа рибосомы; BBV = мозговая аденоассоциированная вирус; Vglut2 = везикулярный транспортер глутамата 2; XFP = любой флуоресцентный белок; eYFP = усиленный желтый флуоресцентный белок; m Вишня = мономерная вишня; RGC = ганглиозные клетки сетчатки; JAM-B = молекула адгезии перехода B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительное видео 1: Покадровое видео P6, развивающего звездообразующие амакриновые дендриты, через 5 дней после инъекции. Время-шаг видео 2 мин. Деконволюция и коррекция 3D-дрейфа применялись с помощью ImageJ. Верхние желтые поля выделяют области роста, а нижняя коробка очерчивает область переходного роста филоподии, самоконтакта и втягивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительный файл 1: Макрос ImageJ для пакетной параллельной итеративной деконволюции. Макрос выполняет 25 итераций итеративного алгоритма Wener Filter Preconditioned Landweber (WPL). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторам нечего раскрывать.