Method Article

Микрокристаллическая дифракция электронов малых молекул

DOI:

10.3791/62313

⸱

March 15th, 2021

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем разработанные в нашей лаборатории процедуры получения порошков низкомолекулярных кристаллов для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан подробный протокол подготовки образцов малых молекул для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED). MicroED был разработан для решения структур белков и малых молекул с использованием стандартного оборудования электронной криомикроскопии (крио-ЭМ). Таким образом, небольшие молекулы, пептиды, растворимые белки и мембранные белки недавно были определены с высоким разрешением. Представлены протоколы подготовки сеток низкомолекулярных лекарственных препаратов на примере препарата карбамазепин. Представлены протоколы скрининга и сбора данных. Дополнительные этапы общего процесса, такие как интеграция данных, определение структуры и уточнение, представлены в другом разделе. Время, необходимое для подготовки низкомолекулярных сеток, оценивается менее чем в 30 минут.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микрокристаллическая дифракция электронов (MicroED) - это метод электронной криомикроскопии (крио-ЭМ) для определения структур атомного разрешения из кристаллов субмикрометрового размера 1,2. Кристаллы наносятся на сетки стандартного просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) и замораживаются путем погружения в жидкий этан или жидкий азот. Затем решетки загружаются в ПЭМ, работающую при криогенных температурах. Кристаллы располагаются на сетке и экранируются на начальное дифракционное качество. Данные MicroED непрерывного вращения собираются из подмножества экранированных кристаллов, где данные сохраняются ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка образцов малых молекул

  1. Переведите небольшое количество (0,01 - 1 мг) порошка, жидкости или твердых веществ в небольшой флакон или пробирку.
  2. Для образцов, уже находящихся в виде порошка, запечатайте пробирку с помощью колпачка до тех пор, пока образец не понадобится. Высушите жидкие образцы в порошки перед попытками метода 1 (шаг 3) или 2 (шаг 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, растворенных в жидкости, можно использовать метод 3 (5.X), приведенный ниже

2. Подготовка сеток ТЕА

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые ТЕА с системами автоматического заряжания требуют, чтобы решетки обрезались и поме....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroED - это метод криоЭМ, который использует сильные взаимодействия между электронами и веществом, что позволяет исследовать исчезающе малые кристаллы12,13. Ожидается, что после этих этапов будет получен дифракционный фильм в кристаллографическом формате, собранный из микрокристаллов (ролик 1). Здесь методика демонстрируется с использованием карбамазепина12. Результаты показывают набор данных MicroED непрерывного вращени.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пробоподготовка обычно представляет собой итеративный процесс, при котором оптимизация производится после сеансов скрининга и сбора данных. Для низкомолекулярных образцов часто целесообразно сначала попытаться получить решетку без тлеющей разрядки решеток, поскольку многие фармацевтические препараты имеют тенденцию быть гидрофобными10,11. Если в сетках слишком мало нанокристаллических отложений, рекомендуется повторить попытку после первого тлеющего разряда решет.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лаборатория Гонена поддерживается средствами Медицинского института Говарда Хьюза. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения P41GM136508.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-1,5 мл Eppendorf tubesFisher Scientific14-282-300Подойдет любой флакон или тюбик.
Зажимы AutogridThermo-Fisher1036173Clipped не требуются для MicroED. Они необходимы для ПЭМ Thermo-Fisher, оснащенных системой автозаряжания.
Авторешетка С-образные кольцаThermo-Fisher1036171
карбамазапинSigmaC4024-1GДля этих экспериментов будет достаточно любого количества
на основе CMOS детектораThermo-FisherCetaD 16MМы использовали CetaD 16M, но приемлем любой детектор с режимом скользящего затвора или достаточно быстрым считыванием.
Программное обеспечение DelphiThermo-FisherN/AПрограммное обеспечение на системах Thermo-Fisher TEM, позволяющее вручную вращать предметный столик
EPU-D программное обеспечениеThermo-FisherN/AКоммерческое программное обеспечение для сбора данных MicroED
Предметные стекла для стеклянной крышкиHamptonHR3-231
Разрядниксвечения PelcoeasyGlow
High PrecisionTweezersEMS78325-ACЛюбой высокоточный пинцет подойдет
для сосуда с жидким азотомSpear LabFD-800Стандартный пенопластовый сосуд для обработки образцов под жидким азотом - 800mL
Программное обеспечение SerialEMUC BoulderN/AБесплатное программное обеспечение, распространяемое D. Mastronarde. На кафедре молекулярной, клеточной биологии и биологии развития
сетки TEMQuantifoil/EMSQ310CMAMulti-A 300 меш, но подойдут любые тонкие углеродные сетки. Для этих малых молекул мы предлагаем начать с непрерывного углерода.
просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ)Thermo-FisherTalos Arctica
Millipore-SigmaWHA100109090 мм или больше
были использованы ватман круглая фильтровальная бумага

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).
  2. Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microcrystal Electron DiffractionSmall Molecule StructureMicroED ProtocolElectron Cryo MicroscopyTEM Grid PreparationHigh Resolution StructureDiffraction Data CollectionCrystallographic SoftwareSample PreparationAtomic Resolution

Related Articles