Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Идентификация связывающих белков малых лигандов с дифференциальным радиальным капиллярным действием лигандного анализа (DRaCALA)

3.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62331

⸱

19 марта 2021 г.

 ,  , 
1Department of Biology, University of Copenhagen

В этой статье

Краткое содержание

Дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа (DRaCALA) может быть использовано для идентификации малых лигандсвязывающих белков организма с помощью библиотеки ORFeome.

Аннотация

За последнее десятилетие был достигнут огромный прогресс в понимании малых сигнальных молекул в бактериальной физиологии. В частности, целевые белки нескольких вторичных мессенджеров (NSM), полученных из нуклеотидов, были систематически идентифицированы и изучены в модельных организмах. Эти достижения в основном связаны с разработкой нескольких новых методов, включая метод захвата соединений и дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа (DRaCALA), которые использовались для систематической идентификации целевых белков этих малых молекул. В данной работе описывается использование NSM, гуанозин пента- и тетрафосфатов (p)ppGpp, в качестве примера и видеодемонстрации метода DRaCALA. Используя DRaCALA, 9 из 20 известных и 12 новых целевых белков (p)ppGpp были идентифицированы в модельном организме Escherichia coli K-12, демонстрируя силу этого анализа. В принципе, DRaCALA может быть использован для изучения небольших лигандов, которые могут быть помечены радиоактивными изотопами или флуоресцентными красителями. Здесь обсуждаются критические шаги, плюсы и минусы DRaCALA для дальнейшего применения этой техники.

Введение

Бактерии используют несколько небольших сигнальных молекул для адаптации к постоянно меняющимся средам1,2. Например, аутоиндукруторы, N-ацилгомосериновые лактоны и их модифицированные олигопептиды, опосредовывают межклеточную связь между бактериями для координации поведения популяции, явление, известное как ощущение кворума2. Другой группой малых сигнальных молекул является NSM, включая широко изученный циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), циклический ди-АМФ, циклический ди-гуанозинмонофосфат (циклический ди-GMP) и гуанозин пента- и тетрафосфаты (p)ppGpp1. Бактерии производят эти NSM в ответ на множество различных стрессовых состояний. После производства эти молекулы связываются со своими белками-мишенями и регулируют несколько различных физиологических и метаболических путей, чтобы справиться с возникающими стрессами и повысить выживаемость бактерий. Поэтому идентификация белков-мишеней является неизбежной предпосылкой для расшифровки молекулярных функций этих малых молекул.

Последнее десятилетие стало свидетелем бума знаний об этих небольших сигнальных молекулах, в основном благодаря нескольким техническим инновациям, которые раскрыли целевые белки этих малых молекул. К ним относятся метод захвата соединения3,4,5и дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа (DRaCALA)6, которые будут обсуждаться в этой статье.

Изобретенный Винсентом Ли и его коллегами в 2011году 6,DRaCALA использует способность нитроцеллюлозной мембраны дифференциально секвестрировать свободные и связанные с белком лиганды. Молекулы, такие как белки, не могут диффундировать на нитроцеллюлозной мембране, в то время как небольшие лиганды, такие как NSM, способны. Смешивая NSM(например,ppGpp) с тестируемым белком и обличивая их на мембране, можно ожидать двух сценариев(рисунок 1):Если (p)ppGpp связывается с белком, радиомаркированный (p)ppGpp будет удерживаться в центре пятна белком и не будет диффундировать наружу, давая интенсивную маленькую точку(т.е., сильный радиоактивный сигнал) под фосфоритатором. Однако, если (p)ppGpp не связывается с белком, он будет свободно диффундировать наружу, производя большое пятно с однородным фоновым радиоактивным сигналом.

Кроме того, DRaCALA может обнаружить взаимодействие между небольшой молекулой и неочищенным белком в цельном клеточном лизате, если белок присутствует в достаточном количестве. Эта простота позволяет использовать DRaCALA для быстрой идентификации белковых мишеней с помощью библиотеки экспрессии ORFeome. Действительно, целевые белки цАМФ7,циклический ди-АМФ8,циклический ди-GMP9,10и (p)ppGpp11,12,13 были систематически идентифицированы с помощью DRaCALA. В этой видеостатье используется (p)ppGpp в качестве примера для демонстрации и описания критических шагов и соображений при успешном проведении скрининга DRaCALA. Следует отметить, что более подробное описание DRaCALA14 настоятельно рекомендуется прочитать в сочетании с этой статьей перед выполнением DRaCALA.

figure-introduction-1
Рисунок 1:Принцип DRaCALA. (A) Схема анализа DRaCALA. Подробности см. в тексте. (B)Количественная оценка и расчет фракции связывания. Подробности см. в тексте. Вкратце, пятна DRaCALA будут проанализированы путем рисования двух кругов, которые ограничивают все пятно и внутреннюю темную точку(т. Е.Сохраненный (p)ppGpp из-за связывания тестируемого белка). Специфическим связывающим сигналом является радиоактивный сигнал внутреннего круга (S1) после вычитания неспецифического фонового сигнала (вычисляется по A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). Фракция связывания представляет специфический сигнал связывания, деленный на общий радиоактивный сигнал (S2). Сокращения: DRaCALA = дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа; (p)ppGpp = гуанозин пента- и тетрафосфаты; RT = комнатная температура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление цельноклеточных лизатов

  1. Инокулируют E. coli K-12 ASKA ORFeome сборные штаммы15 в 1,5 мл лизогенезного бульона (LB), содержащий 25 мкг/мл хлорамфеникола, в 96-скважинных глубоких скважинных пластинах. Расти в течение ночи (O/N) в течение 18 ч при 30 °C с встряхиванием при 160 об/мин. На следующий день добавляют изопропил β-d-1-тиогалакопиранозид (IPTG) (конечные 0,5 мМ) в культуры O/N, чтобы индуцировать экспрессию белка при 30 °C в течение 6 ч.
  2. Грануляционные ячейки по 500 х г в течение 10 мин. Заморозьте гранулы при -80 °C до использования. Чтобы лизировать клетки, добавляют 150 мкл лизисного буфера L1 (40 мМ Tris pH 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2,дополненного 2 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 40 мкг/мл ДНКазы 1 и 0,5 мг/мл лизоцима) для повторного суспендирования гранулы.
  3. Заморозьте ячейки при -80 °C в течение 30 мин, а затем разморозьте при 37 °C в течение 20 мин. Повторите этот цикл три раза, чтобы лизеть клетки. Перед использованием храните лизаты при -80 °C.

2. Очистка Relseq и GppA

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантные белки Relseq из Streptococcus equisimilis и GppA из E. coli K-12 используются для синтеза радиомаркированных pppGpp и ppGpp соответственно.

  1. Выращивайте и собирайте клетки, сверхэкспрессиивируя каждый белок.
    1. Вырастите штамм E. coli BL21 DE3 до экспоненциальной фазы (оптическая плотность (OD) ~ 0,3-0,4) в бульоне LB и открутите 1 мл культуры при 6000 х г в течение 5 мин. Декантирует супернатант и повторно суспендирует клетки 100 мкл ледяного бульона TSB (бульон LB, дополненный 0,1 г/мл PEG3350, 0,05 мл/мл диметилсульфоксида, 20 мМMgCl2).
    2. Смешайте плазмиды, несущие помеченные гистидином relseq и gppA,каждые по 100 нг, с вышеуказанными клеточными суспензиями в TSB, и инкубировать на льду в течение 30 мин. Тепловой удар по ячейкам при 42 °C в течение 40 с. Поместите смесь на лед на 2 мин и добавьте 1 мл бульона LB при комнатной температуре, чтобы ячейки могли восстановиться в течение 1 ч при 37 °C с перемешиванием при 160 об/мин.
    3. Пластинчатые восстановленные клетки на пластинах агара LB, дополненные соответствующими антибиотиками (Relseq:100 мкг / мл ампициллина; GppA: 30 мкг/мл канамицина). На следующий день прививайте колонии в бульоне LB, чтобы начать O/N прекультуры обоих штаммов при 37 °C.
    4. Через 18 ч прививать 500 мл LB-среды 10 мл O/N культур и соответствующими антибиотиками. Выращивайте культуры, встряхивая при 160 об/мин при 37 °C. Когда OD600 нм достигает 0,5-0,7, индуцируют экспрессию белка путем добавления 0,5 мМ IPTG и растут в течение 3 ч при 30 °C с встряхиванием при 160 об/мин.
    5. Соберите клетки, вращаясь при 6084 х г в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендировать гранулу в 20 мл ледяного холодного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и повторно центрифугировать при 1912 х г в течение 20 мин при 4 °C. Перед использованием наложить на него попувержитель и заморозить гранулы при -20 °C.
  2. Никель-нитрилотриацетиновая кислота (Ni-NTA) аффинная очистка
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента убедитесь, что образцы холодные.
    1. Добавьте 40 мл ледяного лизисного буфера L2 (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, имидазола 10 мМ, 10 мМ β-меркаптоэтанола, дополненного ингибиторами протеазы (таблетка без ЭДТА; см. Таблицу материалов)для повторного суспендирования гранулы. Различают клетки с помощью ультразвука (амплитуда 60%, 2 с ON / 4 s OFF в течение 8 мин ON). Очистите лисат, вращая при 23 426 х г в течение 40 мин при 4 °C, и продолжайте с супернатантом для очистки.
    2. Во время вышеуказанной центрифугирования приготовьте смолу Ni-NTA.
      1. Переложите 500 мкл гомогенизированной Смолы Ni-NTA в стоячую полипропиленовую хроматографическую колонку и дайте ей осесть в течение 15 минут, а раствор для хранения просеет. Дважды промыть смолу 15 мл сверхчистой воды, а затем промыть столб 15 мл лизисного буфера L2.
    3. Загрузите очищенный супернатант клеточного лисата с шага 1 на столбец и дайте ему течь. Промыть колонну 30 мл промывочного буфера (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% глицерин, 20 мМ имидазол).
    4. Элюируют белки с помощью 400 мкл буфера элюдения (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, 500 мМ имидазола) трижды. Затем повторите элюнение еще 300 мкл буфера элюции. Соедините элюированные белки до конечного объема 700 мкл.
  3. Гелевая фильтрация
    1. Готовят гель-фильтрационный буфер (50 мМ Tris, рН 7,5; 200 мМ NaCl; 5% глицерин). Промыть колонку исключения размеров одним объемом колонки (25 мл) гелевого фильтрующего буфера.
    2. Загрузите образец объемом 700 мкл с помощью петли объемом 500 мкл, выполните со скоростью 0,5 мл / мин и соберите 2-3 фракции, каждая объемом 0,5 мл, содержащую соответствующие белки.
    3. Объедините и сконцентрируйте фракции, содержащие каждый из белков, используя спиновую колонку, и измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.

3. Синтез 32P-меченых pppGpp и ppGpp

  1. Соберите мелкомасштабную реакцию Relseq в трубку с винтовой крышкой (см. Таблицу 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с радиоактивными реагентами только в лицензированном месте и со средствами индивидуальной защиты.
Объем (мкл)
Малый масштабКрупномасштабных
Сверхчистая вода
10x Relseq буфер*250
ATP (финал 8 мМ)
Relseq (4 μM финал)
32 32 P-α-гуанозинтрифосфат (GTP) (конечный 120 нМ) (ОСТОРОЖНО)0.25
итог20500

Таблица 1: Сбор информации для мелко- и крупномасштабных реакций синтеза 32P-меченых pppGpp. *10x Relseq буфер содержит 250 мМ Tris-HCl, pH 8,6; 1М НаКл; 80 мМ MgCl2. Аббревиатура: pppGpp = гуанозинпентафосфат.

  1. Инкубировать пробирку при 37 °С в термомиксе в течение 1 ч, затем при 95 °С в течение 5 мин, и поместить на лед на 5 мин. Раскрутите осажденный белок при 15 700 х г в течение 5 мин и перенесите супернатант (синтезированный 32P-pppGpp) в новую трубку с винтовой крышкой.
  2. Чтобы синтезировать 32P-ppGpp из 32P-pppGpp, перенесите половину продукта 32p-pppGpp в новую трубку с винтовой крышкой и добавьте 1 мкМ GppA. Инкубировать пробирку при 37 °C в течение 10 мин, при 95 °C в течение 5 мин, а затем поместить на лед на 5 мин.
  3. Раскрутите осажденный белок при 15 700 х г в течение 5 мин и перенесите супернатант (синтезированный 32P-ppGpp) в новую трубку с винтовой крышкой.
  4. Проанализируйте 32P-pppGpp и 32P-ppGpp, запустив 1 мкл образцов на тонкослойной хроматографической пластине (TLC) (полиэтиленимин-модифицированные целлюлозные TLC пластины) с использованием 1,5 M KH2PO4,pH 3,4 в качестве подвижной фазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйтеα-32P-меченый гуанозин 5'-трифосфат(32P-α-GTP) в качестве контроля.
  5. Полностью высушите пластину TLC, поместите ее между прозрачной пластиковой папкой и подвергайте ее люминофорной ширме в течение 5 минут. Визуализируйте и количественно оцените сигналы с помощью фосфоритатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда соотношения 32P-pppGpp и 32P-ppGpp превышают 85%, крупномасштабная реакция (500 мкл, достаточная для скрининга 20 пластин 96 скважин) может быть собрана и синтезирована с использованием таблицы 1.

4. Скрининг DRaCALA белков-мишеней (p)ppGpp

  1. Оттаить и перенести 20 мкл лизатов целых клеток на 96-скважинную V-донную микротитерную пластину. Добавьте 2,5 ЕД/гольцо эндонуклеазы из Serratia marcescensи инкубируют при 37 °C в течение 15 мин для снижения вязкости лизата. Поместите лизаты на лед на 20 минут.
  2. Смешайте 32P-pppGpp и 32P-ppGpp в соотношении 1:1 и добавьте 1x лизисный буфер L1, чтобы конечная концентрация (p)ppGpp была равна 4 нМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая химическое сходство между pppGpp и ppGpp, сочетание обоих химических веществ упростит процесс скрининга.
  3. Используйте многоканальную пипетку и фильтрованные наконечники пипеток, чтобы добавить и смешать 10 мкл смеси (p)ppGpp с клеточным лизатом. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
  4. Промыть инструмент 96 x pin, поместив в 0,01% раствор неионного моющего средства на 30 с, и высушить на папиросной бумаге в течение 30 с. Повторите промывку штифтового инструмента 3x.
  5. Поместите штифтовый инструмент в вышеуказанные 96-скважинные пробные пластины и подождите 30 с. Поднимите штифт инструмент прямо вверх и поместите его прямо вниз на нитроцеллюлозную мембрану на 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пятно отсутствует, спотыкайте 2 мкл соответствующих образцов с помощью пипетки и отфильтрованных наконечников. Желательно сделать дублирование места того же образца, как указано ниже.
  6. Высушите мембрану в течение 5 мин на RT. Поместите мембрану между прозрачной пластиковой папкой и подвергайте ее люминофорной ширме в течение 5 мин. Визуализация с помощью люминофорифровывателя.

5. Количественная оценка и идентификация потенциальных белков-мишеней

  1. Используйте программное обеспечение для анализа, связанное с фосфоригателем, чтобы открыть файл .gel визуализированных пластин. Используйте функцию анализа массива для определения 96 мест, настроив сетку из 12 столбцов x 8 строк.
  2. Определите большие круги, чтобы ограничить внешний край целых пятен (см. Рисунок 1B). Экспортируйте Объем+Фон и Область определенных больших кругов и сохраните в электронной таблице.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости переставьте каждый отдельный круг, чтобы он идеально перекрывался с пятнами, и изместите размер каждого отдельного круга, чтобы сделать его немного больше, чем фактическое пятно.
  3. Размер определенных кругов, чтобы ограничить маленькие внутренние точки. Экспортируйте Объем+Фони Область определенных маленьких кругов и сохраните в электронной таблице.
  4. Рассчитайте связующие дроби в электронной таблице, используя уравнение на рисунке 1B,и постройте график данных. Определите потенциальные связывающие белки в скважинах, которые показывают высокие фракции связывания по сравнению с большинством других скважин.

figure-protocol-1
Рисунок 2:Общий рабочий процесс процесса скрининга DRaCALA. Производство белка из коллекции Escherichia coli ASKA индуцируется, и клетки лизируются. Между тем, рекомбинантные белки Relseq-His и GppA-His очищаются и используются для синтеза 32P-меченых pppGpp и ppGpp из 32P-α-GTP. Затем радиоактивно меченые молекулы (p)ppGpp смешивают с лизатами, и 96-контактный инструмент используется для обнаружения смесей на нитроцеллюлозной мембране для последующего воздействия на экран хранения люминофора, визуализации и количественной оценки радиоактивных сигналов. Сокращения: DRaCALA = дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа; (p)ppGpp = гуанозин пента- и тетрафосфаты; RT = комнатная температура; IPTG = изопропил β-d-1-тиогалакопиранозид; ГТФ = гуанозин 5'-трифосфат; SDS-PAGE = электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия; TLC = тонкослойная хроматография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следование описанному выше протоколу обычно дает два типа результатов(рисунок 3).

На фиг.3А показана пластина с относительно низкими фоновыми сигналами связывания (фракции связывания < 0,025) из большинства скважин. Положительный сигнал связывания от скважины H3 дает фракцию связывания ~0,35, что намного выше, чем наблюдаемая для других скважин. Даже без количественной оценки, скважина H3 примечательна, предполагая, что целевой бел...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Одним из важнейших шагов в выполнении скрининга DRaCALA является получение хороших целоклеточных лизатов. Во-первых, испытуемые белки должны вырабатываться в больших количествах и в растворимых формах. Во-вторых, лизис клеток должен быть полным, а вязкость лизата должна быть минимальной. Включения лизоцима и использования трех циклов замораживания-оттаивания часто бывает достаточно, чтобы полностью лизировать клетки. Однако высвобождаемая хромосомная ДНК делает лизат вязким и генерирует высокий фоновый сигнал связывания,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Работа поддерживается грантом проекта NNF (NNF19OC0058331) для YEZ и исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри (Nº 801199) для MLS.

figure-acknowledgements-1

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
32P-α-GTPPerkinelmerBLU006X250UC
96 x штифтовый инструментV& P ScientificVP 40496 Болтовый репликатор, на центрах 9 мм, диаметр болта 4,2 мм, длина 24 мм
96-луночный микротитратор с V-образным дномСтерилинMIC9004Стерилин Микропланшет V Лунка 611V96
АгарOXOID - Thermo FisherLP0011Агар No 1
Сбор ASKA штаммNBRP, SHIGEN, ЯПОНИЯСсылка: DNA Research, том 12, выпуск 5, 2005, страницы 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
БензоназаSIGMAE1014-25KUгенетически модифицированная эндонуклеаза из Serratia marcescens
Bradford Protein Assay DyeBio-Rad5000006концентрат реагента
DMSOSIGMAD8418≥ 99,9%
ДНКаза 1SIGMADN25-1G
гель фильтрация10x300 колонкаGE Healthcare28990944содержит 20% этанола в качестве консерванта
ГлицеринPanReac AppliChem122329.1214Глицерин 87% для анализа
ГиперкассетаAmershamRPN 1164720 x 40 см
ИмидазолSIGMA56750puriss. p.a., ≥ 99,5% (GC)
IP Накопительный люминофорный экранFUJIFILM28956474BAS-MS 2040 20x 40 см
Изопропил &бета;-d-1-тиогалактопиранизид (IPTG)SIGMAI6758Изопропил &бета;-D-тиогалактозид
Лизогеновый бульон (LB)Инвитроген - Thermo Fisher12795027Miller's LB Бульонное основание
лизоцимSIGMAL4949из белка куриного яйца; BioUltra, лиофилизированный порошок, ≥ 98%
MgCl2 (хлорид магния)SIGMA208337
MilliQ водасверхчистая вода
многоканальная пипеткаThermo Scientific4661110F1 - Clip Tip; 1-10 мкл, 8 x каналов
NaClVWR Chemicals27810AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA AgaroseQiagen30230
Нитроцеллюлозная промокательная мембранаAmersham Protran10600003Premium 0,45 мкм 300 мм x 4 м
PBSOXOID - Thermo FisherBR0014GФосфат буферизованный физиологический раствор (Дульбекко А), таблетки
PEG3350 (Полиэтиленгликоль 3350)SIGMA202444
фенилметилсульфонилфторид (PMSF)SIGMA93482Фенилметансульфонилфторид раствор - 0,1 М в этаноле (T)
Люминофор-имиджерGE Healthcare28955809Typhoon FLA-7000 Люминофор-имиджер
Наконечники для пипеток, фильтрованныеThermo Scientific94410040ClipTip 12,5 μ l нестерильная
поли-преп хроматографическая колонкаBio-Rad7311550полипропиленовая хроматографическая колонка
ингибитор протеазы MiniPierceA32955Таблетки,
пробирка с завинчивающейся крышкойThermo Scientific3488Microcentifuge Tubes, 2,0 мл с завинчивающейся крышкой, нестерильные
SLS 96-deep Луночные пластиныGreiner780285MASTERBLOCK, 2 МЛ, ПП, V-образное дно, Натуральная
спиновая колонкаMilliporeUFC500396Amicon Ultra -0,5 мл Центробежные фильтры
ТермомиксерEppendorf5382000015Термомиксер C
пластина TLC (PEI-целлюлоза F TLC пластины)Merck Millipore105579DC PEI-целлюлоза F (20 x 20 см)
TrisSIGMABP152Tris Base for Molecular Biology
Tween 20SIGMAP1379вязкий неионогенный моющий
&бета;-меркаптоэтанолSIGMAM314899% (ГХ/титрование)
без ЭДТА

Ссылки

  1. Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
  2. Camilli, A., Bassler, B. L. Bacterial small-molecule signaling pathways. Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).
  3. Luo, Y., et al. The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).
  4. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).
  5. Laventie, B. J., et al. Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins. Journal of Visual Experiments. (97), e51404(2015).
  6. Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).
  7. Zhang, Y., et al. Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).
  8. Corrigan, R. M., et al. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).
  9. Roelofs, K. G., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems. PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232(2015).
  10. Fang, X., et al. GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria. Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).
  11. Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).
  12. Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli. Mbio. 9 (2), 02188(2018).
  13. Yang, J., et al. The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp. Nature Communications. 11 (1), 5388(2020).
  14. Orr, M. W., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria. Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).
  15. Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research. DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).
  16. Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate. Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).
  17. Zhang, Y. E., et al. p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch. Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).
  18. Wang, B., et al. Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp. Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

DRaCALA
Идентификация связывающих белков малых лигандов с дифференциальным радиальным капиллярным действием лигандного анализа (DRaCALA)
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.