Методическая статья

Выделение коричневых адипоцитов из мышиной межлопаточной коричневой жировой ткани для анализа экспрессии генов и белков

DOI:

10.3791/62332

⸱

12 марта 2021 г.

 ,  , 
1Masonic Medical Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование описывает новый метод выделения мышиных коричневых адипоцитов для анализа экспрессии генов и белков.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коричневая жировая ткань (BAT) отвечает за недрожащий термогенез у млекопитающих, а коричневые адипоциты (BA) являются функциональными единицами BAT. БА содержат как мультилокулярные липидные капли, так и обильные митохондрии, и они экспрессируют разъединяющий белок 1 (UCP1). БА подразделяются на два подтипа в зависимости от их происхождения: классические БА, полученные из эмбриона (цБА), и БА, полученные из белых адипоцитов. Из-за их относительно низкой плотности БА не могут быть выделены из НИМ традиционным методом центрифугирования. В этом исследовании был разработан новый метод выделения БА от мышей для анализа экспрессии генов и белков. В этом протоколе межлопаточный BAT у взрослых мышей переваривали раствором коллагеназы и диспазы, а диссоциированные БА обогащали 6% раствором йодиксанола. Затем выделенные БА лизировали реагентом тризол для одновременного выделения РНК, ДНК и белка. После выделения РНК органическая фаза лизата использовалась для экстракции белка. Наши данные показали, что 6% раствор йодиксанола эффективно обогащал БА, не вмешиваясь в последующие исследования экспрессии генов и белков. Тромбоцитарный фактор роста (PDGF) является фактором роста, который регулирует рост и пролиферацию мезенхимальных клеток. По сравнению с коричневой жировой тканью, изолированные БА имели значительно более высокую экспрессию Pdgfa. Таким образом, этот новый метод обеспечивает платформу для изучения биологии коричневых адипоцитов на уровне одного клеточного типа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как мыши, так и люди имеют два типа жировых тканей: белая жировая ткань (WAT) и коричневая жировая ткань (BAT)1. WAT хранит энергию в виде триглицеридов в белых адипоцитах, а коричневые адипоциты (BA) BAT рассеивают химическую энергию в виде тепла2. Основываясь на своем происхождении развития, БА далее классифицируются на классические БА (цБА), которые образовались во время развития эмбриона, и белые адипоциты, полученные из БА (бежевые / бритовые клетки, преобразованные из белых адипоцитов в условиях стресса)3. БА являются многолокулярными и экспрессируют термогенный белок, разъединяющий белок 1 (UCP1)4. Депо межлопастных BAT (iBAT) является одним из основных депо cBA у мелких млекопитающих5, тогда как бежевые клетки диспергированы внутри WAT6.

Из-за своей природы рассеивания энергии, БА получили большое внимание в качестве терапевтической мишени для снижения ожирения7. Чтобы использовать БА для лечения ожирения, важно понимать молекулярные механизмы, которые контролируют функцию, выживание и рекрутирование БА. Жировые ткани, включая BAT и WAT, неоднородны. За исключением адипоцитов, жировые ткани содержат много других типов клеток, таких как эндотелиальные клетки, мезенхимальные стволовые клетки и макрофаги8. Хотя доступны генетические инструменты для конкретного истощения генов-кандидатов у мышей, такие как UCP1: Cre line9, методы очистки БА от BAT или WAT ограничены, что затрудняет изучение БА на уровне одноклеточного типа. Кроме того, без получения чистых БА отношения между БА и не-БА не будут четко очерчены. Например, рецептор фактора роста тромбоцитов альфа (PDGFRα) был использован в качестве маркера для недифференцированных мезенхимальных клеток, и он экспрессируется в эндотелиальных и интерстициальных клетках BAT. При холодном стрессе BAT PDGFRα положительные клетки-предшественники дают начало новым BA10. PDGFRα активируется его лигандом PDGF, фактором роста, который регулирует рост и пролиферацию мезенхимальных клеток11; однако неясно, влияют ли БА на поведение PDGFRα-положительных клеток-предшественников путем секреции PDGF.

Недавно был опубликован протокол изоляции БА, который основан на флуоресцентно-активированной сортировке клеток (FACS)12. В этом протоколе 3% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) использовался для отделения БА от не-БА, а обогащенные БА дополнительно очищались FACS. Применение этого протокола ограничено требованием процесса СУИМ, который опирается как на оборудование, так и на опыт работы СУИМ. В этом исследовании был разработан новый протокол изоляции БА от НИМ. БА, выделенные этим протоколом, могут быть непосредственно использованы для исследований экспрессии генов и белков. Кроме того, данные этого исследования свидетельствуют о том, что БА являются основным ресурсом PDGF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все мыши содержались в условиях, свободных от патогенов, и все процедуры были одобрены Масонским медицинским исследовательским Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC). UCP1::Cre9 и Rosa 26tdTomato мыши линии13 были зарегистрированы ранее. Всех мышей держали при комнатной температуре с циклом 12 ч света/темноты.

1. Приготовление растворов и коричневой жировой ткани (НДТ)

  1. Приготовьте раствор для пищеварения и разделительный раствор в центрифужных пробирках по 15 мл.
  2. 10 мл раствора BAT Digestion: До 10 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), добавьте 3,5 мг/ мл диспазы II, 1 мг / мл коллагеназы II и 10 мМ CaCl2 для приготовления раствора для пищеварения BAT.
  3. 10 мл 12% раствора йодиксанола (разделительный раствор): Смешать 1 мл 10x PBS, 2 мл 60% йодиксанола, 0,01 мл 1 M MgCl2, 0,025 мл 1 M KCl, 0,1 мл 0,2 M этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 6,865 мл ddH2Oдля получения 12% йодиксанола.
  4. Усыпить одну взрослую мышь с передозировкой CO2 . Вкратце, заполните клетку мыши 100% CO2 со скоростью смещения 10-30% объема клетки в мин. через 5 мин, подтвердите смерть, проверив на отсутствие видимого дыхания.
  5. Рассекните животное и соберите межлопаточные НДТ. Удалите WAT и мышечные слои под стереомикроскопом.
  6. Для достаточного переваривания разрежьте каждую долю BAT на ~ 3 мм3 части и поместите их в чистую колбу объемом 50 мл с металлическим перемешивателем и 5 мл раствора для сбраживания. Перед началом пищеварения дайте колбе, содержащей BAT и буфер пищеварения, постоять на льду в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На следующих этапах около 80 мг BAT использовалось для выделения коричневых адипоцитов.

2. Процедура изоляции БА

  1. Поместите колбу на магнитную мешалку, которая заключена в инкубатор. Установите скорость перемешивания на уровне 60 об/мин и температуру инкубатора на уровне 35 °C соответственно. Пищеварение будет длиться около 30 минут. Если ломтики BAT образуют сгустки вокруг мешалки во время пищеварения, используйте наконечник пипетки 1 мл, чтобы разрушить агрегированные ткани.
  2. Поместите фильтр сетчатого фильтра 70 мкм поверх чистой центрифужной трубки объемом 50 мл. Пипетка около 4 мл клеточной суспензии через ситечко. Промыть ситечко 4 мл 12% раствора йодиксанола. Пипетка вверх и вниз для смешивания клеток и раствора йодиксанола. Переложите клеточную смесь в две прозрачные пробирки из полистирола по 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце пищеварения раствор для пищеварения должен быть мутным, что указывает на достаточное пищеварение. Используйте свежий раствор для пищеварения каждый раз. После приготовления раствор для пищеварения следует использовать в течение 2 ч.
  3. Повторите шаги 2.2 и 2.3 еще раз, если пищеварение недостаточно.
  4. Оставьте прозрачные полистирольные трубки, содержащие разделительный раствор и БА, на льду на 1 ч. БА образуют слой сверху.
  5. Выньте 20 мкл изолированных БА для исследования в микроскоп.

3. Выделение РНК и белка из БА

  1. Пипетка слоя БА на две микроцентрифужные трубки объемом 1,7 мл для выделения РНК и белка. Осторожно удалите избыточный раствор йодиксанола, не нарушая слой БА.
  2. Добавьте 1 мл тризола для одновременного выделения РНК, ДНК и белка в клеточном растворе. Смешайте достаточно, чтобы щелкнуть клетки.
  3. Добавьте 200 мкл хлороформа, чтобы разделить фазы.
  4. Центрифугируйте трубку по 9,981 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  5. После центрифугирования используют водную фазу для выделения РНК. В этом исследовании общая РНК использовалась для обратной транскрипции, а количественная ОТ-ПЦР проводилась с помощью ПЦР в реальном времени. Последовательности грунтовок перечислены в Таблице материалов.
  6. Перенесите 300 мкл органической фазы в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл.
  7. К органической фазе добавляют 2,5 объема 100% этанола и вихрь в течение 10 с.
  8. Добавьте 200 мкл 1-бром-3-хлорпропана и вихрь в течение 10 с.
  9. Добавьте 600 мкл двойной дистиллированной воды и вихрь в течение 10 с.
  10. Дайте смешанному раствору постоять 10 мин при комнатной температуре.
  11. Центрифуга при 9,981 х г в течение 10 мин при 4 °C. На этом этапе фазы будут разделены. Белковая фаза локализуется в среднем слое.
  12. Сверху удалить водный раствор. Добавьте 1 мл 100% этанола в оставшийся раствор.
  13. Центрифуга в течение 10 мин, 9,981 x g, 4 °C. После центрифугирования образуется белковая гранула. Выбросьте супернатант.
  14. Промыть гранулу 1 мл 100% этанола.
  15. Центрифуга в течение 10 мин, 9981 х г, 4 °C. Сохраните гранулу и выбросьте супернатант.
  16. Высушите гранулы на воздухе в течение 10 мин при комнатной температуре.
  17. Измерьте вес мокрой гранулы. Добавьте 1% раствор SDS в соотношении 20 мкл/мг гранулы.
  18. Растворите гранулу, поместив трубку в нагретый шейкер. Установите температуру на уровне 55 °C, а скорость на 11 x g. Обычно требуется 5-10 минут, чтобы полностью растворить белковую гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация растворенного белка может быть измерена с помощью анализа BCA14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Препарат интеракапулярного НИМ для выделения коричневых адипоцитов
Процесс выделения коричневых адипоцитов (БА) изображен на рисунке 1А. Весь процесс, от приготовления НИМ и растворов для сбраживания/разделения до получения изолированных БА, займет около 4 ч.

У взрослых мышей обильный BAT существует в межлопаточной области. Этот межлопастной BAT (iBAT) покрыт мышечными слоями и WAT (рисунок 1B). Перед началом проце...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании был разработан новый метод выделения БА для анализа экспрессии генов и белков.

В опубликованном протоколе изоляции БА для обогащения БА12 использовался 3% раствор BSA. Тем не менее, обогащенные БА, достигнутые этим опубликованным протоколом, не могут быть непосредственно использованы для анализа экспрессии белка. Это связано с тем, что концентрированный BSA, существующий в растворе BA, препятствует последующей экстракции белка. Когда БА, обогащенные ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z. Lin был поддержан фондами Национального института здравоохранения HL138454-01 и Масонского медицинского научно-исследовательского института.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Antibodies
AntigenCompanyCatalog
PPARγLSBioLs-C368478
PDGFRaСанта-Крузsc-398206
UCP1R& D системаIC6158P
<стронг>Химический и растворы
коллагеназа, тип IIThermo Fisher Scientific17101015
1-бромо-3-хлорпропанSigma-AldrichB62404
Бычья сыворотка альбумин (БСА) GoldbioA-421-10
Хлорид кальцияBio BasicCT1330
ХлороформIBI ScientificIB05040
Dispase II, протеазаSigma-AldrichD5693
EDTABio BasicEB0107
ЭтанолIBI ScientificIB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master MixLifeSctLS01131905Y
гексагидрат хлорида магнияBoston BioProductsP-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMixABMG454
OptiPrep (Iodixanol)Cosmo Bio СШАAXS-1114542
PBS (10x)Caisson LabsPBL07
PBS (1x)Caisson LabsPBL06
Набор для анализа белка Pierce BCAThermo Fisher Scientific23227
Хлорид калияBoston BioProductsP-1435
SimplyBlue безопасный StainInvitrogenLC6060
Додецилсульфат натрия (SDS)Sigma-Aldrich75746
Реагент тризолТехнологии жизни15596018
Primers
Название гена (Вид) Прямойобратный
pdgfra (мышь)CTCAGCTGTCTCCTCACAgGCAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (мышь)TGTGCCCATTCGCAGGAAGAGTTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)TGCTGAACATCTCTCCCCCTTCTCTCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1ACTGCCACACCTCCAGTCATTCTTTGCCTCACTCAGGATTGG
strong>Equipment
Name<strong>CompanyApplication
Keyence BZ-X700KeyenceImaging коричневые адипоциты
Магнитная мешалкаVWRDissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Система ПЦР в реальном времениприменяется БиосистемаКоличественная ПЦР
Система визуализации Odyssey FcLI-CORВестерн-блоттинг
<

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
  2. Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).
  3. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
  4. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  5. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
  6. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
  8. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  9. Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
  10. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
  11. Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
  12. Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
  13. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
  14. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  15. Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
  16. Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
  17. Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674(2019).
  18. Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
  19. Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
  20. Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
  21. Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDS1

Похожие статьи