Методическая статья

Стандартизированная мышиная модель экстракорпоральной ударно-волновой терапии, индуцированной регенерацией мягких тканей

898 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62338

⸱

28 июня 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department for Cardiac Surgery, Innsbruck Medical University, 2Institute of Clinical and Functional Anatomy, Innsbruck Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описана стандартизированная мышиная модель регенерации тканей с помощью ударно-волновой терапии.

Аннотация

Ударно-волновая терапия (УВТ) демонстрирует многообещающие регенеративные эффекты в нескольких различных тканях. Тем не менее, лежащие в основе молекулярные механизмы плохо изучены. Ангиогенез, процесс образования новых кровеносных сосудов, является ведущим фактором регенерации в более мягких тканях, а также недавно обнаруженным эффектом УВТ. Как механический стимул УВТ индуцирует ангиогенез и регенерацию и какие пути в этом участвуют, до конца не изучено. Для дальнейшего улучшения клинического использования УВТ и получения ценной информации о том, как механическая стимуляция может повлиять на ткани и регенерацию тканей, необходима стандартизированная модель УВТ. Настоящим мы описываем стандартизированную, простую в реализации мышиную модель регенерации, вызванной ударно-волновой терапией, с использованием модели ишемии задних конечностей.

Введение

Ударно-волновая терапия (УВТ) впервые была введена в клиническую практику как средство разрушения камней в почках с помощью экстракорпорального применения. В 1990-х годах случайное обнаружение утолщения гребня подвздошной кости в рентгеновских записях после повторной литотрипсии выявило костный морфогенный эффект SWT1. Это вызвало всплеск новых применений в ортопедии. Таким образом, УВТ превратилась в признанный вариант лечения несращения длинных костей, латерального эпикондилита, а также тендинита ахиллова сухожилия 2,3,4,5. Последние данные в настоящее время снова расширяют спектр приспособлений за пределы ортопедии, охватывая более мягкие ткани и нарушения заживления ран 6,7. Здесь исследования могут показать эффективность УВТ при гетерогенной совокупности состояний, включая, например, эректильную дисфункцию или спастичность после инсульта 8,9,10.

Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе УВТ, до сих пор не до конца поняты и требуют дальнейших исследований. Уделяя особое внимание сердечно-сосудистым заболеваниям, наша предыдущая работа демонстрирует многообещающий эффект УВТ на мышиной модели инфаркта миокарда. Таким образом, было обнаружено, что ангиогенез является основным фактором регенерации миокарда после SWT11.

Ангиогенез описывает развитие новых сосудов путем проращивания и расщепления ранее существовавших сосудов. В случае травмы эти новые сосуды способствуют восстановлению притока крови к поврежденному участку и тем самымрегенерации12.

Таким образом, ангиогенез представляет собой отличительную черту регенерации тканей и потенциальное объяснение эффектов УВТ в более мягких тканях. Тем не менее, регенерация является сложным процессом с многочисленными индукторными и эффекторными механизмами. Несмотря на возможность исследовать их в условиях изолированной клеточной культуры, животные модели лучше всего подходят для имитации этих сложных процессов. Ишемия задних конечностей является хорошо зарекомендовавшей себя моделью для исследования ангиогенеза и регенерации in vivo13. Для поддержки дальнейших исследований регенеративного эффекта УВТ мы представляем осуществимую стандартизированную мышиную модель УВТ при ишемии задних конечностей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты были одобрены комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском университете Инсбрука и Министерством науки Австрии (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Индукция анестезии и постановка операции

  1. Подготовьте подходящую среду для процедур с животными: стерилизуйте оборудование, дезинфицируйте поверхности, используйте одноразовые маски, изоляционные халаты и перчатки.
  2. Усыпляйте мышей в возрасте 18-12 недель (штамм и пол в зависимости от условий эксперимента) в камере, прикрепленной к изофлурановому вапорайзеру в концентрации 4%.
  3. Проверьте достаточную седацию с помощью педали или рефлектора ушной раковины в качестве индикаторов глубокого распознавания боли.
  4. Когда животное будет достаточно седативно, выключите подачу изофлурана и введите анальгезии и анестетики в соответствии с утвержденным протоколом ухода за животными и используйте их, например, кетамина гидрохлорид (80 мг/кг массы тела) в качестве анестетика и ксилазина гидрохлорид (5 мг/кг массы тела) в качестве анальгетика внутрибрюшинно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте шприц с внутрибрюшинным препаратом перед помещением животного в анестезиологическую камеру.
  5. Исследуйте глубину анестезии через 5 мин после инъекции, оценив рефлекс отмены педали.
  6. Нанесите глазную мазь (например, 0,5 г ретинолпальмитата), чтобы избежать повреждения роговицы.
  7. Удаляйте волосы в зоне операции и в непосредственной близости от нее, в частности в левой задней конечности и паху. Крем для депиляции можно использовать вместо бритв или триммеров, чтобы избежать травмирования кожи.
  8. Зафиксируйте животное в лежачем положении с вытянутыми конечностями на нагревательной пластине с помощью скотча.
  9. Продезинфицируйте и очистите область операции 10% повидон-йодом или аналогичным дезинфицирующим средством. Используйте стерильную полевую простыню.

2. Порядок действий

  1. Для проведения операции используйте микроскоп с 10-20-кратным увеличением.
  2. Сделайте разрез кожи (~1,5 см) проксимальнее коленного сустава с помощью хирургических ножниц.
  3. Аккуратно отделите кожу от подлежащих тканей с помощью тупых щипцов.
  4. Определите бедренные сосуды. Аккуратно отделите артерию, вену и нерв с помощью щипцов и ножниц.
  5. Начиная проксимально на уровне паховой связки, осторожно удалите окружающую соединительную ткань до тех пор, пока артерия не будет оптимально отображена. В качестве дистальной конечной точки должно быть видно артериальное ответвление на подкожную и подколенную артерию.
  6. Перевязать проксимальную бедренную артерию на уровне паховой связки с помощью полипропиленового шва 7-0.
  7. Окклюзируйте дистальный конец бедренной артерии проксимальнее разветвления на подкожную и подколенную артерию с помощью полипропиленового шва 7-0.
  8. Иссекаем сегмент бедренной артерии между дистальным и проксимальным узлами с помощью диатермии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также возможно иссечение бедренной артерии путем разрезания хирургическими ножницами. Тем не менее, использование диатермии окклюзирует сосуд в дополнение к шву в случае отказа узлов.
  9. Убедитесь, что бедренная артерия надежно окклюзирована и в области операции не видно кровотечений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать узкое расстояние между кожными швами, чтобы избежать обеззараживания раны ультразвуковым гелем во время нанесения УВТ.
  10. Сшить разрез кожи с помощью 5-0 нерассасывающихся нейлоновых нитей с одиночными узлами.
  11. Продезинфицируйте операционную область ватными палочками.

3. Применение ударно-волновой терапии

  1. Убедитесь, что разрез кожи полностью закрыт.
  2. Определение параметров лечения на ударно-волновом аппарате. В данной экспериментальной установке использовалась плотность потока энергии 0,1 мДж/мм2 с частотой 3 Гц, что в сумме составило 300 импульсов.
    Примечание: Энергетические уровни были взяты из предыдущих результатов14 с использованием сфокусированной экстракорпоральной ударно-волновой терапии.
  3. Нанесите ультразвуковой гель на обрабатываемую область на внутренней стороне бедра для правильного соединения.
  4. Убедитесь, что в геле не задерживаются пузырьки воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное соединение с достаточным количеством геля имеет важное значение для адекватного нанесения УВТ. Мелкие пузырьки воздуха внутри геля поглощают ударные волны и уменьшают их действие.
  5. Нанесите 300 импульсов, нажимая на ножной переключатель и медленно перемещая аппликатор по бедру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если УВТ не применяется сразу после операции, избегайте возможного поглощения энергии ударной волны из-за повторно отросших волос при удалении перед лечением.
  6. После лечения сотрите остатки ультразвукового геля, чтобы предотвратить охлаждение бедра.
  7. Переместите животное в клетку для восстановления, подверженную воздействию нагревательной лампы, чтобы избежать переохлаждения.
  8. Внимательно наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в себя, и введите дозу 0,05 мг/кг массы тела бупренорфина подкожно для адекватной анальгезии.
  9. Ежедневно следите за здоровьем и благополучием животных до полного заживления хирургического разреза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение может быть ограничено одним сеансом или повторяться несколько раз. В этом примере было выполнено одно применение.

4. Измерение кровотока

  1. Выполняйте измерение кровотока сразу после операции и в различные моменты времени после нее в зависимости от условий эксперимента.
  2. Успокоить животное в камере, прикрепленной к изофлурановому вапорайзеру на 4%.
  3. Когда животное получит седативное средство, выключите подачу изофлурана и введите анестетики и анальгетики. В соответствии с утвержденным протоколом ухода за животными и их применения применяют кетамина гидрохлорид (80 мг/кг массы тела) и ксилазина гидрохлорид (5 мг/кг массы тела) внутрибрюшинно.
  4. Исследуйте глубину анестезии через 5 минут после инъекции, оценив рефлекс отмены педали.
  5. Используйте глазную мазь (например, 0,5 г ретинолпальмитата), чтобы избежать повреждения роговицы.
  6. Зафиксируйте животное в лежачем положении с вытянутыми конечностями на нагревательной пластине с помощью скотча.
  7. Тщательно удалите шерсть с обеих задних конечностей.
  8. Измерьте перфузию конечностей с помощью лазерного допплера в соответствии с инструкцией производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве основного параметра следует использовать соотношение ишемизированного кровотока конечности и неишемизированной конечности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя этот протокол, можно наблюдать и контролировать значительные различия в перфузии задних конечностей после вмешательства УВТ. Репрезентативные изображения показывают заметную разницу в конечностях, получавших УВТ (Рисунок 1B), по сравнению с необработанными контрольными конечностями (Рисунок 1A). Здесь перфузия изображается с помощью термического сжигания, при этом холодные цвета представляют низкую перфузию, а теплые ц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ударно-волновая терапия показывает многообещающие результаты в нескольких режимах регенерации мягких тканей. Тем не менее, чтобы еще больше увеличить, улучшить или изолировать эти регенеративные способности, сначала необходимо раскрыть основы регенерации, вызванной УВТ, на молекулярном уровне. Регенерация тканей сложна и включает в себя множество биологических процессов, включая врожденный и приобретенный иммунитет, воспаление, прогрессию клеточного цикла, апоптоз, клеточную дифференциро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Хольфельд Й. и Гримм М. являются акционерами компании Heart Regeneration Technologies GmbH, дочерней компании Медицинского университета Инсбрука, целью которой является продвижение сердечной ударно-волновой терапии (www.heart-regeneration.com). Всем остальным авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано неограниченным исследовательским грантом AUVA для JH и CGT.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% Повидон
5-0 Нейлоновый шовный материалEthicon Inc.
7-0 шелковый шовный материалEthicon Inc.
Крем для прижиганияМартинME-102
депиляцииNivea
Марля Газин
Нагревательная пластина
Кетамина гидрохлориданестезия
Лазерный допплерИнструменты Мур Хирургические
инструментыТонкие Научные инструменты
гидрохлориданестезия
для Ксилазина

Ссылки

  1. Schaden, W., et al. Extracorporeal shockwave therapy (ESWT) - First choice treatment of fracture non-unions. International Journal of Surgery. 24, 179-183 (2015).
  2. Xu, Z. H., et al. Extracorporeal shock wave treatment in nonunions of long bone fractures. International Orthopaedics. 33, 789-793 (2009).
  3. Melegati, G., Tornese, D., Bandi, M., Rubini, M. Comparison of two ultrasonographic localization techniques for the treatment of lateral epicondylitis with extracorporeal shock wave therapy: A randomized study. Clinical Rehabilitation. 18, 366-370 (2004).
  4. Zhang, S., Li, H., Yao, W., Hua, Y., Li, Y. Therapeutic response of extracorporeal shock wave therapy for insertional achilles tendinopathy between sports-active and nonsports-active patients with 5-year follow-up. Orthopedic Journal of Sport Medicine. 8, 1-6 (2020).
  5. Dedes, V., et al. Effectiveness and safety of shockwave therapy in tendinopathies. Materia Socio Medica. 30, 141(2018).
  6. Surace, S. J., Deitch, J., Johnston, R. V., Shock Buchbinder, R. wave therapy for rotator cuff disease with or without calcification. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3 (3), 008962(2020).
  7. Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) for wound healing: Technology, mechanisms, and clinical efficacy. Wound Repair Regeneration. 20, 456-465 (2012).
  8. Fode, M., Hatzichristodoulou, G., Serefoglu, E. C., Verze, P., Albersen, M. Low-intensity shockwave therapy for erectile dysfunction: Is the evidence strong enough. Nature Reviews Urology. 14, 593-606 (2017).
  9. Guo, P., et al. Positive effects of extracorporeal shock wave therapy on spasticity in poststroke patients: a meta-analysis. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 26 (11), 2470-2476 (2017).
  10. Vardi, Y., Appel, B., Jacob, G., Massarwi, O., Gruenwald, I. Can low-intensity extracorporeal shockwave therapy improve erectile function? A 6-month follow-up pilot study in patients with organic erectile dysfunction. European Urology. 58, 243-248 (2010).
  11. Gollmann-Tepeköylü, C., et al. miR-19a-3p containing exosomes improve function of ischaemic myocardium upon shock wave therapy. Cardiovascular Research. 116 (6), 1226-1236 (2019).
  12. Otrock, Z. K., Mahfouz, R. A. R., Makarem, J. A., Shamseddine, A. I. Understanding the biology of angiogenesis: Review of the most important molecular mechanisms. Blood Cells, Molecules and Diseases. 39, 212-220 (2007).
  13. Ahn, H., et al. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Physiology and Behavior. 176, 139-148 (2017).
  14. Pölzl, L., et al. Defining a therapeutic range for regeneration of ischemic myocardium via shock waves. Science Reports. , 409(2021).
  15. Holfeld, J., et al. Low energy shock wave therapy induces angiogenesis in acute hind-limb ischemia via VEGF receptor 2 phosphorylation. PLoS One. 9, 1-7 (2014).
  16. Theurl, M., et al. The neuropeptide catestatin acts as a novel angiogenic cytokine via a basic fibroblast growth factor-dependent mechanism. Circulation Research. 107 (11), 1326-1335 (2010).
  17. Noonan, D. M., De Lerma Barbaro, A., Vannini, N., Mortara, L., Albini, A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: Decisions and indecisions. Cancer Metastasis Reviews. 27, 31-40 (2008).
  18. Aurora, A. B., Olson, E. N. Immune modulation of stem cells and regeneration. Cell Stem Cell. 15, 14-25 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи