Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Одновременная визуализация кальция и стимуляция глюкозы у живых рыбок данио для исследования функции β-клеток in vivo

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62347

⸱

21 сентября 2021 г.

 ,  ,  , 
1Centre for Regenerative Therapies TU Dresden, 2German Center for Diabetes Research (DZD e.V.), Paul Langerhans Institute Dresden of the Helmholtz Center Munich at the University Hospital Carl Gustav Carus of TU Dresden

В этой статье

Краткое содержание

В исследовании представлен протокол визуализации кальция и стимуляции глюкозой β-клеток поджелудочной железы рыбок данио-рерио in vivo.

Аннотация

β-клетки поджелудочной железы поддерживают системный гомеостаз глюкозы, вырабатывая и выделяя инсулин в соответствии с уровнем глюкозы в крови. Дефекты функции β-клеток связаны с гипергликемией, которая может привести к диабету. В процессе секреции инсулина β-клетки испытывают приток Са2+. Таким образом, визуализация стимулированного глюкозой притока Ca2+ с использованием генетически кодируемых показателей кальция (GECIs) открывает путь к изучению функции β-клеток. Ранее исследования показали, что изолированные островки данио-рерио, экспрессирующие GCaMP6, проявляют значительную активностьCa2+ при стимуляции определенными концентрациями глюкозы. Тем не менее, крайне важно изучить, как β-клетки реагируют на глюкозу не изолированно, а в своей родной среде, где они системно связаны, васкуляризированы и плотно иннервированы. С этой целью в исследовании использовалась оптическая прозрачность личинок данио-рерио на ранних стадиях развития, чтобы осветить активность β-клеток in vivo. Здесь представлен подробный протокол визуализацииCa2+ и стимуляции глюкозы для исследования функции β-клеток in vivo . Эта методика позволяет отслеживать координированную динамику Ca2+ в β-клетках с разрешением по одной ячейке. Кроме того, этот метод может быть применен для работы с любым инъекционным раствором, таким как небольшие молекулы или пептиды. В целом, протокол иллюстрирует потенциал модели рыбок данио для исследования координации островков in vivo и для характеристики того, как экологические и генетические компоненты могут влиять на функцию β клеток.

Введение

β-клетки поджелудочной железы обладают уникальной способностью к секреции инсулина в ответ на глюкозу. После приема пищи, богатой углеводами, уровень сахара в крови повышается и поступает в β-клетки, где он быстро метаболизируется для производства АТФ. Увеличение внутриклеточного соотношения АТФ/АДФ приводит к закрытию АТФ-зависимых К+ каналов, деполяризации клеточной мембраны и активации потенциал-зависимых Са2+ каналов. Быстрое увеличение внутриклеточного Са2+ стимулирует секрецию β-клеток инсулин-гранул.

Визуализация островковых клеток в интактной поджелудочной железе у мышей сложна и требует экстериоризации всего органа. Мощной альтернативой неинвазивной визуализации in vivo является трансплантация островков в переднюю камеру (АС) глаза мышей1. Трансплантированные островки в АК мышей имитируют среду in vivo, что позволяет проводить лонгитюдные исследования и визуализировать Ca2+ in vivo 2,3. Тем не менее, процесс реваскуляризации островков может занять несколько недель после трансплантации островков4. Таким образом, сохранение исходной естественной среды, в которой β-клетки васкуляризируются и связаны с метаболическим статусом организма, и достижение разрешения визуализации одиночных клеток in vivo остаются очень сложными и трудоемкими задачами.

Чтобы преодолеть эти ограничения, исследователи разработали трансгенные линии рыбок данио, экспрессирующие GECI в β-клетках, которые позволяют в режиме реального времени визуализировать приток Ca2+ в β-клетках 5,6,7,8,9. С помощью этих инструментов было обнаружено, что в клеточной культуре β-клетки рыбок данио демонстрируют консервативную реакцию на повышенный уровень глюкозы, аналогичную мышиным и человеческим островкам. Более того, оптическая прозрачность личинок данио-рерио позволила изучить функцию β-клеток в их родной среде. Важно отметить, что уже через 4 дня после оплодотворения (dpf) β-клетки первичного островка данио-рерио экспрессируют маркеры зрелости, такие как ортолог урокортина3 (ucn3l) у рыбок данио, и проявляют реакцию in vitro на глюкозу в физиологическом диапазоне6. Кроме того, островок данио-рерио густо васкуляризирован и иннервирован10. Генетическая абляция β-клеток на этом этапе приводит к непереносимости глюкозы. Кроме того, рыбки данио демонстрируют консервативную реакцию на сахароснижающие агенты, такие как инсулин и сульфонилмочевина, показывая, что первичный островок является глюкозо-чувствительной и системно связанной тканью, контролирующей уровень глюкозы. Эти особые характеристики делают рыбок данио уникальной моделью для изучения активности островковых β-клеток in vivo 11,12.

Протокол визуализации Ca2+ и одновременного введения глюкозы непосредственно в кровоток рыбок данио позволяет исследовать реакцию β-клеток на глюкозу in vivo. Этот протокол позволяет вводить определенные концентрации глюкозы в сочетании с высоким временным и пространственным разрешением, что в совокупности выявляет скоординированную реакцию β-клеток на глюкозу и присутствие β-клеток первого ответа in vivo13. Более того, протокол может быть адаптирован к любому инъекционному раствору, например, к химическим соединениям или небольшим пептидам. В целом, эта методология иллюстрирует силу модели рыбок данио для исследования координации β-клеток in vivo и для характеристики того, как компоненты окружающей среды и генетические компоненты могут влиять на функцию β-клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Ранее установленные трансгенные линии, использованные в этом исследовании, были Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)6, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)14. Все эксперименты проводились в соответствии с законами Европейского Союза и Германии (Tierschutzgesetz) и с одобрения Комитетов по этике Технического университета Дрездена и Земельного округа Саксонии (номера одобрения: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016 и T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018 и TVV33-2019). В этом исследовании все живые визуализации in vivo и инъекции глюкозы, а также экспериментальные процедуры проводились с личинками рыбок данио, которые не превышали 5-дневную стадию после оплодотворения (dpf), как указано в законе о защите животных (TierSchVersV §14). В соответствии с директивой ЕС 2010/63/EU, использование этих ранних стадий данио рерио сокращает количество экспериментальных животных в соответствии с принципами 3R.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол относится к визуализации in vivo Ca2+ первичного островка данио-рерио из Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) двойных трансгенных личинок. У этих животных промотор инсулина управляет экспрессией cdt1-mCherry, который помечает ядра отдельных β-клеток красным флуоресцентным цветом. GCaMP6s показывает изменения зеленой флуоресценции в ответ на внутриклеточные уровниCa2+ . Специфическая экспрессия GCaMP6 в β-клетках позволяет охарактеризовать чувствительность отдельных клеток к глюкозе без вмешательства других типов клеток или тканей.

  1. Подготовка эмбриональной среды Е215.
  2. Приготовьте 0,003% (200 мкм) 1-фенил-2-тиомочевину (ПТУ) в 10% физиологическом растворе Хэнкса15.
  3. Приготовьте 1% легкоплавкую агарозу (LMA) в эмбриональной среде E2 путем нагревания в микроволновой печи и фильтрации с помощью фильтра размером пор <25 мкм. Поддерживайте LMA на уровне >37 °C в течение 1 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы должны быть отфильтрованы, чтобы предотвратить закупорку стеклянного капилляра, используемого для инъекций.
  4. Приготовьте 0,4% раствор трикаина метана сульфоната (MS222) с 979 мл стерильного H2O и 21 мл 1 М Tris (pH 9). Отрегулируйте pH до 7.
  5. Растворите 1,8 г D-глюкозы в 50 мл PBS для приготовления 200 мМ раствора D-глюкозы и отфильтруйте его с помощью фильтров с размером пор <25 мкм. Приготовьте рабочий раствор D-глюкозы (25 мМ) путем разведения 200 мМ D-глюкозы в соотношении 1:8 в 1x PBS (фильтрованный). Хранить при температуре 4 °C для длительного хранения. Добавьте 5 мкл фенол-красного к 1 мл 25 мМ D-глюкозы, чтобы иметь возможность визуализировать раствор при инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 недели. Однако рабочий раствор 25 мМ следует готовить в свежем виде. Выбросьте приклад, если есть какие-либо признаки загрязнения.
  6. Подготовьте стеклянные капилляры для микроинъекций с помощью капиллярного пуллера или приобретите коммерчески доступные капилляры из микростекла. Настройки для вытягивания иглы, описаны в Таблице материалов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Было обнаружено, что микроинъекционные капилляры из боросиликатного стекла без внутренней нити дают лучшие результаты по сравнению с аналогичными капиллярами с внутренней нитью.
  7. Приобретите посуду со стеклянным дном диаметром 35 мм для размещения личинок данио-рерио. В этом протоколе были использованы тарелки со стеклянным дном и стеклянной крышкой 0,17 мм, так как они позволяют получать изображения с помощью корректируемых по стеклу объективов в конфокальных системах.
  8. Приобретите наконечники для микрозагрузки пипеток. В этом протоколе использовались микрозагрузчики объемом 20 мкл длиной 100 мм.
  9. Приобретите набор микропинцетов.
  10. Приобретите чашки Петри 90 мм для сортировки и выращивания рыбок данио.
  11. Приобретите минеральное масло.
  12. Приобретите пневматический микронасос или систему для подачи 1-5 нл жидкости в объеме через стеклянные капилляры.
  13. Для сортировки и монтажа рыбок данио используется стереомикроскоп, оснащенный источником света и синими и красными фильтрующими кубиками для флуоресценции (CFP: возбуждение 420-450 нм, излучение 460-490 нм, TRITC: возбуждение: 532-554 нм, излучение: 570-613 нм; или Texas-Red: возбуждение: 540-580 нм, излучение: 592-667 нм). Сортировать двойные трансгенные Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) с помощью стереоскопа. Отбирайте эмбрионы с синей и красной флуоресценцией в сетчатке из-за экспрессии CFP и mCherry под промотором кристаллина.
  14. Для визуализации притока Ca2+ в β-клетках используйте инвертированный конфокальный микроскоп, оснащенный 10-кратным (0,8 NA) воздушным и 40-кратным (1,0 NA) водяным объективом. Используйте столик с держателем для тарелки для посуды со стеклянным дном диаметром 35 мм.
  15. Приобретите 3D ручной или моторизованный манипулятор с капиллярным держателем. Вставьте стеклянный капилляр в держатель капилляра и установите держатель капилляра в 3D-манипулятор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-манипулятор позволяет точно перемещать стеклянный капилляр и вставлять его в личинки данио-рерио.

2. Крепление личинок данио-рерио

ПРИМЕЧАНИЕ: Двойной трансгенный Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) обрабатывают 0,03% (20 мкМ) 1-фенил2-тиомочевины (ПТУ) для подавления пигментации начиная с 24 ч после оплодотворения. При дозе 4,5 dpf обезболите личинок, используя 0,04% от конечной концентрации трикаина непосредственно перед установкой.

  1. Для поддержания анестезии во время сеанса визуализации добавьте к 1% легкоплавкой агарозе конечную концентрацию 0,04% трикаина и 20 μМ PTU. Храните агарозу LMA при температуре >37 °C до использования. Используйте этот раствор в тот же день приготовления.
  2. Отсортируйте обезболенный двойной трансгенный Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) личинок. Поместите 3-5 рыб на чашку Петри со стеклянным дном и удалите большую часть жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не дайте личинкам высохнуть на этом этапе и всегда держите их погруженными в минимальное количество E2.
  3. Добавьте 500 μL LMA на стеклянное дно чашки Петри, в которой находится рыба, и с помощью микропинцета осторожно переместите рыбу так, чтобы правая сторона рыбы непосредственно соприкасалась со стеклянным дном. Удалите излишки агарозы и дайте ей застыть в течение 1-3 минут. Обратите внимание, что в этот момент агароза становится слегка непрозрачной (рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если агароза слишком горячая, это может повредить личинки. Чтобы этого избежать, дайте агарозе остыть при комнатной температуре в течение 30-45 с, прежде чем добавлять ее к личинкам.
  4. Как только агароза станет твердой, с помощью микропинцета осторожно удалите агарозу вокруг области сердца, чтобы предотвратить поломку иглы, используемой для последующей инъекции, при контакте с агарозой (рис. 1C).
  5. Добавьте 500 μL E2, содержащего конечную концентрацию 0,04% трикаина, и 20 μM PTU.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не высыхать личинки во время съемки в реальном времени.

3. Одновременная инъекция и визуализация Ca2+ β-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Те личинки, которые имеют чрезмерное количество желтка в верхней части поджелудочной железы из-за задержки развития, не следует использовать для визуализации, так как липиды желтка влияют на качество изображения. Кроме того, используются малые мощности лазера (0,5%-5%), чтобы избежать фотообесцвечивания и фототоксичности.

  1. С помощью стереомикроскопа и микропинцета отрежьте кончик стеклянного капилляра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не режьте только кончик капилляра, так как диаметр капилляра должен быть меньше, чем входной тракт сердца данио-рерио.
  2. С помощью насадочных наконечников заполните иглу 25 мМ раствором D-глюкозы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Капилляр должен быть равномерно заполнен, с особой осторожностью, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, поскольку они мешают доставке соответствующих объемов впрыска.
  3. Установите стеклянный капилляр в держатель капилляра и подключите его к микронасосу. Поддерживайте давление впрыска микронасоса в диапазоне 500-1 000 гПа, компенсационное давление = 0 гПа и время подачи = 1 с.
  4. Для калибровки объема инъекции используется стереомикроскоп, оснащенный градуировочным окуляром. Поместите каплю минерального масла в предметное стекло под стереоскопом. Отрегулируйте зум стереоскопа в 4 степени с помощью объектива с 1,5-кратным увеличением. Вставьте стеклянный капилляр в минеральное масло.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 5 нл эквивалентно 5 единицам градуировки, отображаемой в окуляре стереоскопа. Увеличьте или уменьшите давление впрыска микронасоса, чтобы отрегулировать объем капли.
  5. Установите капиллярный держатель в 3D-манипулятор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-манипулятор должен обеспечивать точное управление движением в направлениях x, y и z капиллярного держателя.
  6. Осторожно поместите чашку с установленными личинками на держатель пластины конфокального микроскопа. Используйте воздушный объектив 10x, 0,8 NA для обнаружения личинок с помощью опции яркого поля.
  7. Ориентируйте рыбку данио сердцем в направлении, где расположены капилляр и 3D-манипулятор. Наблюдая за красной флуоресценцией, убедитесь, что островок находится в центре поля зрения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента сцена должна оставаться неподвижной (Рисунок 2).
  8. С помощью 3D-манипулятора переместите стеклянный капилляр по направлению к сердцу личинок, проникните в кожу и нацельтесь на полость перикарда. Осторожно введите капилляр в середину общей кардинальной вены (CCV) и синуса venosus (SV), расположенных примерно в 100-200 мкм от предсердия сердца16 (рисунок 1B и рисунок 2C). Угол наклона иглы составляет примерно 20-30° по отношению к поверхности пластины. Если край пластины слишком высокий, снимите его, чтобы обеспечить более легкий доступ к капилляру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это критический шаг, так как требуется очень осторожное проникновение; Быстрые движения могут нарушить работу сердца или вызвать кровяную оболочку в этой области. Если кровоток нарушен, следует использовать другой образец. Так как 3D манипулятор держит фиксированное положение, избегайте движений сцены, чтобы не мешать работе сердечной ткани.
  9. После того, как капилляр будет помещен в SV, измените его на объектив погружения в воду 40x, 1,2 NA. Используя красное и зеленое дихроматические зеркала 488/561, найдите ядерный сигнал mCherry в β-клетках и сфокусируйтесь на островке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные ядра должны быть хорошо видны, а зеленая флуоресценция должна быть низкой (Рисунок 1D).
  10. Настройте одновременный сбор данных для GCaMP6s и флуоресценции mCherry со следующими параметрами в меню Smart Setup: GFP (GCaMP6s), возбуждение: 488 нм, излучение: 498-555 нм, ложный цвет: зеленый (выберите GFP); mCherry, возбуждение: 561 нм (mCherry), излучение: 570-640 нм, ложный цвет: красный (выберите mCherry). Пропускаемый свет, ложный цвет: серый.
  11. Отрегулируйте плоскость изображения, настроив фокальную плоскость вдоль оси z островка. Найдите плоскость, содержащую большинство β-ячеек.
  12. Отрегулируйте усиление ядерного сигнала mCherry для равномерной идентификации каждой отдельной ячейки и покрытия около 70% цветной гистограммы.
  13. Отрегулируйте усиление сигнала GCaMP6s таким образом, чтобы он покрывал не менее 25% цветовой гистограммы, так как GCaMP6s увеличивает свою яркость до 4 раз.
  14. Отрегулируйте усиление проходящего света для получения равномерного сигнала образца, охватывающего около 70% цветной гистограммы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Серый канал используется для визуализации и обеспечения правильного кровотока островка.
  15. В режиме съемки установите разрешение изображения на 512 x 512 пикселей, масштаб на 5, шаг линии на 3, скорость сканирования на 13 и усреднение линии на 2-3. Выберите опцию Time-series (Временные ряды) и установите для параметра Duration (Длительность) значение 500 циклов (Duration) на 500 циклов (Duration) со скоростью захвата 150 мс на кадр.
    Примечание: Первые 50 кадров временного ряда соответствуют исходной флуоресценции до инъекции глюкозы. Было замечено, что некоторые β-клетки проявляют базальную активность in vivo. Реагирующая β-клетка со временем будет демонстрировать увеличение интенсивности зеленой флуоресценции при введении глюкозы. Большинство β-клеток проявляют реакцию на инъекцию 25 мМ глюкозы in vivo.
  16. Запустите создание образа. После первых 50 кадров (7,5 с) введите глюкозу с помощью микропомпы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции могут вызвать небольшое движение, которое может сместить фокальную плоскость островка. Во время записи фильма движения кишечника могут изменить фокальную плоскость островка.
  17. Следите за получением изображения и вручную настраивайте координаты x, y и z, чтобы сохранить одну и ту же фокальную плоскость вдоль фильма.
  18. После инъекции глюкозы система регистрирует островковую реакцию в терминах притока Ca2+ в виде увеличения флуоресценции GCaMP. После каждой инъекции дайте личинкам отдохнуть не менее 5 минут перед любой дальнейшей стимуляцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ядра клеток остаются стабильными во время процесса. Если островок сильно перемещается во время съемки или если островок вышел из фокальной плоскости, образец не может быть использован для дальнейшего анализа.
  19. Повторите инъекцию три раза. Сохраняйте видео в форматах TIF, CZI или LSM (рекомендуется). После записи ответов Ca2+ удаляйте капилляр из сердца очень медленно. Перейдите к следующему образцу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки данио-рерио могут быть восстановлены в чашке Петри со свежим E2, содержащим PTU.

4. Количественное определение кривых флуоресценции GCaMP для отдельных β-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное демонстрирует слишком много движения, фильм можно стабилизировать с помощью подключаемого модуля FIJI Регистрация серий на основе дескриптора (2d/3d + t)17.

  1. Загрузите изображение для анализа, перетащив его в FIJI. В окне «Параметры импорта биоформата» нажмите «ОК».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для форматов, не поддерживаемых Фиджи, преобразуйте видео в формат tiff для анализа.
  2. Чтобы извлечь интенсивность флуоресценции GCaMP, нажмите на меню «Анализ» > «Установить измерения». Поставьте галочку в поле «Интегрированная плотность» и нажмите «ОК».
    1. Откройте Менеджер окупаемости инвестиций.
    2. В меню FIJI выберите пункт Выбор многоугольников , расположенный на панели инструментов.
    3. Вручную нарисуйте многоугольник, охватывающий площадь, немного превышающую площадь ядра клетки, и включающий часть цитоплазматической площади клетки, чтобы обеспечить надлежащую количественную оценку ответа Ca2+ для одной клетки.
    4. Убедитесь, что положение ROI одинаково по всем кадрам; при необходимости скорректируйте ROI.
    5. Добавьте выбранный ROI в Менеджер ROI , нажав на кнопку Добавить [t] .
  3. Чтобы количественно оценить сигнал GCaMP, разделите каналы изображения. Нажмите на меню FIJI «Изображение > Цвета > Разделить каналы » и выберите «Зеленый канал».
  4. В Менеджере ROI выберите все области и нажмите на меню Еще > Мультимера. Сохраните результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетка выходит за пределы полигональной области из-за инъекции глюкозы или движения животного, извлеките флуоресценцию клетки до и после движения, вручную регулируя полигональную область.
  5. Чтобы выполнить анализ отдельных клеток, выполните следующие шаги.
    1. Удалите фоновое соцветие. Для этого рассматриваем фоновую флуоресццию как минимальное значение, зарегистрированное в фильме для каждой ячейки (FMIN). Минимум вычитается из всего временного ряда (FT - FMIN) для каждой ячейки.
    2. Нормализуйте значения флуоресценции по всему фильму. Для этого разделите каждое значение на наибольшее значение интенсивности по записям для каждой ячейки. Для этого рассчитаем разницу между FMIN и FMAX, т.е. (FMAX - FMIN). Делим (FT - FMIN) / (FMAX - FMIN).
      Примечание: Этот шаг позволяет сравнить реакцию Ca2+ между различными клетками и островками разных животных, поскольку они будут излучать различные уровни интенсивности флуоресценции в зависимости от фокальной плоскости и доступности клетки или островка для визуализации.
  6. После получения значений флуоресценции отдельных клеток используйте программу (например, Excel или R) для обработки значений флуоресценции, измеренных на шаге 4, и автоматического построения графиков флуоресцентных кривых. Для проведения анализа в этом протоколе (шаг 6) использовалась Дополнительная таблица 1 (Singlecelltrace.xlsx).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью этого протокола была охарактеризована реакция на глюкозу отдельных β-клеток в их родной среде. Для этого личинку данио-рерио устанавливают на чашку Петри со стеклянным дном. С помощью 3D-манипулятора в циркуляцию был введен стеклянный капилляр, нацеленный на СВ (рис. 1 и рис. 2). Это позволяет впрыскивать определенные объемы растворов с определенной концентрацией. Одновременно регистрировался индуцированный глюкозой приток Ca2+ для всех β-кл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе была исследована динамика Ca2+ β-клеток в их нативном микроокружении с разрешением одиночных клеток. Это возможно за счет стимуляции β-клеток рыбок данио с помощью инъекции глюкозы в кровоток при одновременной регистрации динамики ихCa2+ с помощью GCaMP6.

Протокол дает три основных преимущества. Во-первых, исследователи продемонстрировали, что β-клетки рыбок данио демонстрируют скоординированную реакцию на стимуляцию глюк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Николай Нинов получил финансирование от Центра регенеративной терапии Дрездена при Техническом университете Дрездена и Немецкого центра исследований диабета (DZD), а также исследовательские гранты от Немецкого научно-исследовательского общества (DFG) и Международной исследовательской учебной группы (IRTG 2251) по иммунологическим и клеточным стратегиям в метаболических заболеваниях. Мы благодарны Центру световой микроскопии ЦСПГ за поддержку во всех методах визуализации. Мы благодарим Рыбный комплекс при КГПОГ за всю техническую помощь и поддержку в области рыбы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Посуда со стеклянным дном диаметром 35 ммMattekP35G-1.5-14-CМы используем эту чашку со стеклянным дном для установки личинок рыбок данио и проведения конфокальной микроскопии
Сине-зеленый фильтрующий кубZEISS489038-9901-000Набор фильтров 38 HE
Конфокальный микроскопZEISSLSM 980
D-(+)-глюкозаSigma-AldrichG7528
Excel ( 2016)https://www.office.com/
Фемтоджет Eppendorf5252000013Это оборудование представляет собой пневматический микронасос, который обеспечивает точную подачу объема и сопровождается капиллярным держателем. Мы используем микронасос Femtojet (давление впрыска от 500 до 1000 гПа; компенсационное давление = 0 гПа; время подачи = 1 секунда).  
Фемтотипы, стеклянные капилляры готовы к использованию.Eppendorf5242952008это готовые к использованию стеклянные капилляры, которые могут заменить вытянутые капилляры.
Фиджи, с использованием ImageJ Версия: 1.51chttps://fiji.sc/
Люминесцентная лампаZEISS423013-9010-000Осветитель HXP 120 В
Стеклянные капилляры 3.5"Drummonds Scientific Company3-000-203-G/XМы используем эти стеклянные капилляры для подготовки инъекционных капилляров путем их вытягивания капиллярным пуллером
InjectmanEppendorf5192000019Это оборудование позволяет проводить 3D манипуляции с держателем капилляров
Низкоплавкая агарозаBiozymArt. -Nr.: 840101Мы используем агарозу для установки рыбок данио на чашку со стеклянным дном
Наконечник микрозагрузчика для стеклянных микрокапилляров 0,5 – 20 & микро; L, 100 ммEppendorf 5242956003Длинные советы по нагрузке стеклянных капилляров растворами
Микропинцет Dumont Swiss made0102-4-POМы используем микропинцет для перемещения личинок данио-рерио во время монтажа и для срезания кончика стеклянного капилляра (например. Дюмон, размер 4). 
Минеральное маслоSigma-AldrichM5904Мы используем минеральное масло для калибровки размера капли для инъекции
P-1000 Пипетка нового поколенияНаучный продуктP-1000Мы используем этот капиллярный пуллер для подготовки стеклянного капилляра с помощью капилляров Друмонда. Мы используем капиллярный съемник P-1000 со следующими параметрами: Температура: 650, Тяга: 20, Вел: 160, Время: 200, Давление: 500.
PTU (1-фенил-2-тиомочевина)Sigma-AldrichP7629Мы используем это соединение для подавления пигментации во время развития рыбок данио-рерио
Filter CubeZEISS000000-1114-462 Набор фильтров 45 HQ TexasRed
СтереомикроскопZEISS495015-0001-000SteREO Discovery.V8
Шприцевые фильтры, стерильные. Размер пор 0,2 & микро; mPall Corporation 4612Мы используем их для фильтрации всех растворов и предотвращения капиллярной игольчатой одежды
Трансгенная линия данио-рерио: Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)
трикаин метансульфонат (MS222)Sigma-Aldrich  E10521Мы используем это соединение для обезболивания личинок рыб
Red

Ссылки

  1. Speier,, et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocol. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  2. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. Federation of American Society of Experimental Biology Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  3. Chen, C., et al. Alterations in beta-cell calcium dynamics and efficacy outweigh islet mass adaptation in compensation of insulin resistance and prediabetes onset. Diabetes. 65 (9), 2676-2685 (2016).
  4. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  5. Janjuha, S., Pal Singh, S., Ninov, N. Analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  6. Singh, S. P., et al. Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth. Nature Communications. 8 (1), 664(2017).
  7. Lorincz, R., et al. In vivo monitoring of intracellular Ca2+ dynamics in the pancreatic beta-cells of zebrafish embryos. Islets. 10 (6), 221-238 (2018).
  8. Mullapudi, S. T., et al. Disruption of the pancreatic vasculature in zebrafish affects islet architecture and function. Development. 146 (21), (2019).
  9. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. eLife. 8, 41540(2019).
  10. Yang, Y. H. C., Kawakami, K., Stainier, D. Y. A new mode of pancreatic islet innervation revealed by live imaging in zebrafish. eLife. 7, 34519(2018).
  11. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  12. Nath, A. K., et al. PTPMT1 inhibition lowers glucose through succinate dehydrogenase phosphorylation. Cell Reports. 10 (5), 694-701 (2015).
  13. Salem, V., et al. Leader β-cells coordinate Ca2+ dynamics across pancreatic islets in vivo. Nature Metabolism. 1 (6), 615-629 (2019).
  14. Ninov, N., et al. Metabolic regulation of cellular plasticity in the pancreas. Current Biology. 23 (13), 1242-1250 (2013).
  15. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
  16. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Delgadillo-Silva, L. F., et al. Modelling pancreatic beta-cell inflammation in zebrafish identifies the natural product wedelolactone for human islet protection. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 036004(2019).
  19. Emfinger, C. H., et al. Beta-cell excitability and excitability-driven diabetes in adult zebrafish islets. Physiological Reports. 7 (11), 14101(2019).
  20. Zhang, M., Goforth, P., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. The Ca2+ dynamics of isolated mouse beta-cells and islets: implications for mathematical models. Biophysical Journal. 84 (5), 2852-2870 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivoGCaMP6s
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.