Методическая статья

Протокол экстракции ДНК комаров на магнитной основе для секвенирования следующего поколения

DOI:

10.3791/62354

⸱

15 апреля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Medical Entomology Laboratory, Department of Entomology and Nematology, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, 2U. S. Fish and Wildlife Service, Pacific Islands Fish and Wildlife Office, 3Department of Entomology and Nematology, University of California Davis

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описан протокол экстракции ДНК с использованием магнитных шариков для получения высококачественной экстракции ДНК от комаров. Эти извлечения подходят для последующего подхода к секвенированию следующего поколения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно опубликованный протокол экстракции ДНК с использованием магнитных шариков и автоматизированного инструмента экстракции ДНК предположил, что можно извлечь высококачественную и количественную ДНК из хорошо сохранившегося отдельного комара, достаточного для последующего секвенирования всего генома. Тем не менее, зависимость от дорогостоящего автоматизированного инструмента для извлечения ДНК может быть непомерно высокой для многих лабораторий. Здесь исследование предоставляет бюджетный протокол экстракции ДНК на магнитной основе, который подходит для низкой и средней пропускной способности. Протокол, описанный здесь, был успешно протестирован с использованием отдельных образцов комаров Aedes aegypti. Снижение затрат, связанных с высококачественной экстракцией ДНК, увеличит применение высокопроизводительного секвенирования в лабораториях и исследованиях с ограниченными ресурсами.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавняя разработка улучшенного протокола экстракции ДНК1 позволила пролить много высокоэффективных последующих исследований, включающих секвенирование всего генома2,3,4,5,6. Этот протокол экстракции ДНК на основе магнитных шариков обеспечивает надежный выход ДНК из отдельных образцов комаров, что, в свою очередь, снижает стоимость и время, связанные с приобретением достаточного количества образцов из полевых коллекций.

Последние достижения в популяции и ландшафтной геномике напрямую связаны со снижением затрат на секвенирование всего генома. Хотя предыдущий протокол экстракции ДНК1 повышает эффективность, связанную с высокопроизводительный секвенированием, небольшие лаборатории / исследования без средств могут отказаться от использования этих новых мощных инструментов ландшафтной и популяционной геномики из-за затрат на внедрение протокола (например, затраты на специализированные инструменты).

Здесь представлен модифицированный протокол экстракции ДНК, который использует аналогичную магнитную ступень экстракции шариков, как Neiman et al.1, для получения ДНК высокой чистоты, но не полагается на дорогостоящие инструменты для лизиса тканей и экстракции ДНК. Этот протокол подходит для экспериментов, требующих >10 нг высококачественной ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Общее хранение образцов и подготовка перед извлечением ДНК

  1. Гидратировать образец в воде ПЦР-класса 100 мкл в течение 1 ч (или на ночь) при 4 °C, если образец хранился в >70% спирте для размягчения ткани.

2. Нарушение выборки

  1. Установите инкубатор или встряхивательный тепловой блок при 56 °C.
  2. Производят смесь буфера и фермента протеиназы K (PK). Для каждой отдельной экстракции комара требуется 2 мкл протеиназы К (100 мг/мл) и 98 мкл буфера протеиназы К (всего 100 мкл). Чтобы приготовить мастер-микс для нескольких образцов, увеличьте общее количество (объединенное для всех отдельных образцов) на ~ 15%, чтобы обеспечить наличие достаточного объема.
  3. Если образцы были гидратированы перед извлечением, выбросьте воду из каждой пробы.
  4. В микроцентрифужную трубку 1,5 мл, содержащую ткань комара, добавьте 100 мкл смеси буфера и фермента ПК.
  5. Гомогенизируйте ткань с помощью микроцентрифуги трубчатого пестикла.
  6. Центрифугировать образцы в течение 1 мин при 9 600 х г при комнатной температуре.
  7. Инкубировать образец в течение 2-3 ч при 56 °C.
  8. Во время инкубации подготовьте другие реагенты, используя этап экстракции ДНК (этап 3).

3. Извлечение ДНК

  1. Сделайте магнитный бисероплетение. Для каждого образца смешайте 100 мкл лизисного буфера, 100 мкл изопропанола и 15 мкл магнитных шариков (всего 215 мкл). Чтобы приготовить мастер-микс для нескольких реакций, увеличьте общее количество (объединенное для всех отдельных образцов) на ~ 20%, чтобы обеспечить наличие адекватного объема.
  2. По истечении времени инкубации (этап 2.7) перенесите каждый лизат в чистую микроцентрифужную трубку или микропластинку с помощью пипетки.
  3. Добавьте 100 мкл лиазата и 215 мкл магнитной бисероплетительной смеси в каждый образец.
  4. Используйте пипетку, чтобы хорошо перемешать ее в течение 10-20 с, а затем дайте ей постоять в течение 10 минут при комнатной температуре. Осторожно время от времени встряхивайте трубку, чтобы максимизировать связывание магнитных шариков и ДНК.
  5. Поместите трубку/пластину на магнитный сепаратор шариков и подождите, пока раствор не очистится.
  6. Выбросьте жидкость из трубки/пластины с помощью пипетки. При удалении супернатанта старайтесь не трогать и не беспокоить магнитные шарики, удерживающие ДНК.
  7. Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 325 мкл промывного буфера 1 в каждую скважину.
  8. Тщательно перемешать путем пипетки и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
  9. Повторите шаги 3.5–3.6.
  10. Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 250 мкл промывного буфера 1 к каждой скважине.
  11. Тщательно перемешать путем пипетки и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
  12. Повторите шаги 3.5–3.6.
  13. Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 250 мкл промывочного буфера 2 к каждому образцу.
  14. Тщательно перемешать и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
  15. Повторите шаги 3.5–3.6.
  16. Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 250 мкл промывного буфера 2 к каждой скважине.
  17. Тщательно перемешать и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
  18. Повторите шаги 3.5–3.6.
  19. Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 100 мкл буфера элюдения в каждую скважину.
  20. Тщательно перемешать и инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
  21. Переместите трубку/пластину на магнитный сепаратор шариков и подождите, пока раствор не очистится.
  22. Пипетка супернатанта в новую чистую 0,5 микроцентрифужную трубку или микропластинку.
  23. Храните образцы ДНК при 4 °C (до 1 недели) или -80 °C.  Если используется микропластиня, накройте ее парапленкой.
  24. Определите выход ДНК с помощью любого подходящего метода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались показания и поглощение флуорометра ДНК при 260/280 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Средний выход ДНК на отдельную голову комара / ткань грудной клетки составил 4,121 нг / мкл (N = 92, стандартное отклонение 3,513), измеренный с использованием флуорометра при элюировании с использованием 100 мкл буфера элюации. Этого достаточно для входных требований геномной ДНК в 10-30 нг, необходимых для построения библиотеки всего генома1,7. Количество ДНК может варьироваться в диапазоне 0,3-29,7 нг/мкл в зависимости от размера тела комара и условий сохранен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный здесь, может быть адаптирован для других видов насекомых. Первоначальная версия протокола, представленная в Nieman et al.1, была протестирована на нескольких видах, включая Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta и Keiferia lyco...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем финансовую поддержку со стороны Тихоокеанского юго-западного регионального центра передового опыта по трансмиссивным заболеваниям, финансируемого Центрами США по контролю и профилактике заболеваний (Соглашение о сотрудничестве 1U01CK000516), грантОМ CDC NU50CK00420-04-04, Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США (проект Хэтча 1025565), стипендией UF / IFAS Флоридской медицинской энтомологической лаборатории Це-Ю Чен, грантом NSF CAMTech IUCRC Фаза II (AWD05009_MOD0030) и Департаментом здравоохранения Флориды (контракт CODQJ). Выводы и заключения в этой статье являются выводами автора (авторов) и не обязательно отражают точку зрения Службы охраны рыбных ресурсов и дикой природы США.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AE BufferQiagen19077Элюирующий буфер
AL BufferQiagen19075Лизис
буфер AW1 BufferQiagen19081Промывочный буфер 1
AW2 БуферQiagen19072Промывочный буфер 2
MagAttract Суспензия GQiagen1026901магнитный
шарик Магнитный сепаратор шариковEpigentekQ10002-1
NanodropThermoFisherND-2000микрообъемный спектрофотометр
PK BufferThermoFisher4489111Proteinase K Buffer
Proteinase KThermoFisherA25561
QubitInvitrogenQ33238флуориметр

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).
  3. Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).
  4. Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473(2019).
  5. Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
  6. Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).
  7. Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211(2016).
  8. Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
  9. Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
  10. Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
  11. Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Aedes aegyptiK

Похожие статьи