В статье представлено устройство μTongue (микрофлюидика на языке) для функциональной визуализации вкусовых клеток in vivo путем интеграции микрофлюидики в окно прижизальной визуализации на языке.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
μTongue: функциональная платформа визуализации на основе микрофлюидики для языка in vivo
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Прижизневая флуоресцентная микроскопия является инструментом, широко используемым для изучения многоклеточной динамики у живого животного. Однако он не был успешно использован во вкусовом органе чувств. Интегрируя микрофлюидику в окно визуализации языка прижизностно, μTongue обеспечивает надежные функциональные изображения вкусовых клеток in vivo при контролируемом воздействии нескольких вкусовых гастян. В данной работе представлена подробная пошаговая процедура использования системы μTongue. Существует пять подразделов: подготовка вкусных решений, настройка микрофлюидного модуля, монтаж образца, получение функциональных данных изображения и анализ данных. Также представлены некоторые советы и методики решения практических вопросов, которые могут возникнуть при использовании μTongue.
Введение
Прижизальный флуоресцентный микроскоп широко используется для изучения пространственно-временной динамики на живых тканях. Исследователи быстро разрабатывают генетически закодированные датчики, которые обеспечивают специфические и чувствительные преобразования биологических процессов в флуоресцентные сигналы, которые могут быть легко записаны с помощью флуоресцентных микроскопов, которые широко доступны1,2. Хотя большинство внутренних органов у грызунов были исследованы с помощью микроскопа, его успешное применение к языку еще не было успешным3.
Предыдущие ис....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все хирургические процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Сунгюнван и Сеульского национального университета.
1. Приготовление растворов: искусственной слюны и вкусовых постоялых веществ
- Готовят искусственную слюну путем растворения 2 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 3 мМ NaHCO3,3 мМ KHCO3,0,25 мМ CaCl2,0,25 мМ MgCl2,0,12 мМ K2HPO4,0,12 мМ KH2PO4и 1,8 мМ HCl в дистиллированной воде (>1 л) и отрегулировать рН раствора до 7 (см. Таблицу материалов)12.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мышь Pirt-GCaMP6f-tdTomato использовалась для получения изображения вкусовых рецепторов. Поверхность мышиного языка была покрыта автофлуоресцентными нитевидными сосочами. Вкусовые рецепторы разложены по поверхности языка(рисунок 4А). Изображения вкусового рецептора и его структуры были получены с помощью трех различных детекторов фильтров. Используя набор фильтров 607/70 нм, сигнал tdTomato от вкусовых ячеек был получен для ратиометрического анализа(рисунок 4B)........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь описан подробный протокол применения μTongue к исследованию функциональной активности вкусовых клеток in vivo. В этом протоколе выполняется функциональная визуализация на вкусовых клетках с использованием генетически закодированных показателей кальция. В дополнение к использованию трансгенных мышей, электрофоретическая нагрузка кальциевых красителей (или красителей, чувствительных к напряжению) на вкусовые ячейки может быть альтернативным вариантом.
В этом эксперименте были испо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют о конкурирующих финансовых интересах: J. Han и M. Choi являются изобретателями запатентованной технологии μTongue, описанной в этой статье, а система μTongue коммерчески доступна через SciTech Korea.
Благодарности
Эта работа была поддержана Институтом фундаментальных наук (IBS-R015-D1), грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (No 2019M3A9E2061789), и грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (No 2019M3E5D2A01058329). Мы благодарны Ынсу Киму и Юджину Ли за их техническую помощь.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ацесульфам K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Искусственная слюна / раствор |
| хлорида кальция | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Искусственная слюна / тастант |
| лимонная кислота | Sigma Aldrich | C0759-100G | Искусственная слюна / тастант |
| циклогексимид | Sigma Aldrich | 01810-5G | Искусственная слюна / тастант |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Искусственная слюна / tastant |
| Стоматологический клей | Denkist | P0000CJT-A2 | Препарат животного происхождения |
| Image J | NIH | ImageJ | Анализ данных |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Искусственная слюна / tastant |
| Мгновенный клей | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Препарат животного происхождения |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Искусственная слюна / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Искусственная слюна / tastant |
| Кетамин | Yuhan | Ketamine 50 | Препарат животного происхождения |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Искусственная слюна / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Искусственная слюна / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Анализ данных |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Искусственная слюна / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Искусственная слюна / tastant |
| Mutiphoton микроскоп | Thorlab | Bergamo II | Микроскоп |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Искусственная слюна / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Искусственная слюна / tastant |
| объектив | Nikon | N16XLWD-PF | Микроскоп |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic Control |
| PC | LG | Lg15N54 | Флюидный контроль |
| рН-метр | Термонаучный | ORION STAR AZ11 | Искусственная слюна / тастант |
| Фосфатно-солевой буфер | Sigma Aldrich | 806562 | Искусственная слюна / тастант |
| хинин | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Искусственная слюна / тастант |
| Шприцевой насос | Havard Аппарат | PHD ULTRA 4400 | Жидкостный контроль |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Препарат животного происхождения |
| Сверхбыстрый волоконный лазер | Toptica | FFultra920 01042 | Микроскоп |
| Ксилазин | Байер Корея | Ромпун | Препарат для животных |
Ссылки
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
