Температура контролируемой сборки и характеристики droplet интерфейс Bilayer

Summary

В этом протоколе подробно используется система отопления, контролируемая температурой обратной связи, для содействия сборке липидных монослой и формированию бислойного интерфейса капель для липидов с повышенными температурами плавления, а также измерения емкости для характеристики изменений, обусловленных температурой в мембране.

Abstract

Метод капельного интерфейса bilayer (DIB) для сборки липидных двуслойных (т.е. DIBs) между липидными аквестными каплями в масле предлагает ключевые преимущества по сравнению с другими методами: DIBs стабильны и часто долговечны, область билейера может быть обратимо настроена, листовка асимметрия легко контролируется с помощью капельных композиций, и ткани, как сети Формирование DIB требует спонтанной сборки липидов в липидные монослой высокой плотности на поверхностях капель. Хотя это происходит легко при комнатной температуре для общих синтетических липидов, достаточный монослой или стабильный билейер не может сформировать в аналогичных условиях для липидов с точками плавления выше комнатной температуры, в том числе некоторые клеточные липидные экстракты. Такое поведение, вероятно, ограничило составы и, возможно, биологическую значимость DIB в модельных мембранных исследованиях. Для решения этой проблемы представлен экспериментальный протокол для тщательного нагрева нефтяного резервуара, в которого обухотятся капли DIB, и характеризует влияние температуры на липидную мембрану. В частности, этот протокол показывает, как использовать теплопроводящий алюминиевый светильник и резисторные нагревательные элементы, контролируемые циклом обратной связи, чтобы назначать повышенные температуры, что улучшает сборку монослой и образование двухслойных для более широкого набора липидных типов. Структурные характеристики мембраны, а также термотропические фазы переходов липидов, включающих билейер, количественно измеряются путем измерения изменений электрической емкости DIB. Вместе эта процедура может помочь в оценке биофизических явлений в модельных мембранах по различным температурам, включая определение эффективной температуры плавления_(ТМ)для многокомпонентных липидных смесей. Таким образом, эта возможность позволит более тесно реплицировать естественные фазовые переходы в модельных мембранах и будет способствовать образованию и использованию модельных мембран из более широкой полосы мембранных компонентов, включая те, которые лучше фиксируют неоднородность их клеточных аналогов.

Introduction

Клеточные мембраны избирательно проницаемые барьеры, состоящие из^{тысяч липидных типов 1,}белков, углеводов и стерий, которые инкапсулируют и субдивидуируют все живые клетки. Понимание того, как их составы влияют на их функции и выявление того, как природные и синтетические молекулы взаимодействуют с, придерживаются, нарушают и транслокируют клеточные мембраны, являются, следовательно, важными областями исследований с широкими последствиями в биологии, медицине, химии, физике и инженерии материалов.

Эти цели для открытия непосредственно выгоду от проверенных методов для сборки, манипулирования и изучения модели мембран....

Protocol

1. Подготовка нагретого арматуры

1. Соберите 2 куска 1 мм толщиной изолятора резины обрезается до 25 мм х 40 мм в ширину и длину, соответственно, 2 части 6 мм толщиной резины, которые также 25 мм х 40 мм, подготовленный алюминиевый базовый прибор сборки, и акриловое масло резервуар, который помещается в смотровое окно алюминиевого базового прибора (см. рисунки S1, S2, и S3 для деталей на изготовление и взорвался вид сборки). Подготовка алюминиевого приспособления во-первых, прикрепив к нижней части прибора стекло coverslip смотровое окно с УФ излечимый клей и придерживаясь 1 резистивный нагревательный элемент в верхней части каждого 25 мм х 25 ....

Results

На рисунке 1 показано, как на стадии микроскопа готовятся алюминиевые светильники и акриловое масло. Сборка шаги 1.2-1.4 служить для термически изолировать приспособление от сцены для более эффективного отопления. Шаги 1.5-1.7 показывают, как правильно прикрепить термокупл к прибору и расположить масляный резервуар, а шаги 1.8 -1.9 показывают рекомендуемые места для распределения масла на эти кусочки.

На рисунке 2 излагаются компонент.......

Discussion

В описанном в настоящем протоколе содержатся инструкции по сборке и эксплуатации экспериментальной системы контроля температуры масла и капель, используемых для формирования ДИБ. Это особенно полезно для включения образования DIB с использованием липидов, которые имеют температуру плавления выше RT. Кроме того, точно изменяя температуру нефтяного резервуара, высотой билейера можно манипулировать для изучения влияния повышенных температур на различные мембранные свойства и характеристики, включая емкость, площадь, толщину.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 мм x 40 мм x 1 мм изоляционная резина (x2)	Любой		Изолирует нижнюю часть алюминиевого приспособления от предметного столика микроскопа
25 мм x 40 мм x 6 мм Изоляционная резина (x2)	Любой		Защищает нагревательные элементы от повреждений зажимами предметного стекла микроскопа и изолирует верхнюю часть нагревательных элементов.
3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота	Sigma Aldrich	M3183	Буферный агент для липидного раствора
Акриловая подложка	Изготовлена на собственном предприятии	HTD_STG_2	~1000 мкл акриловая скважина с наружным профилем poka-yoke для фиксации ориентации
Алюминиевый светильник	Изготовлен на месте HTD_STG_1		Базовое приспособление с масляной скважиной, которая удерживает ациловый светильник и включает в себя две плоские прокладки, примыкающие к масляной скважине для нагревательных элементов;
Экстракт общего липида мозга	Avanti	131101C-100 мг	25 мг/мл экстракта свиных липидов
Компактное шасси для сбора данных (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Шасси для размещения различных типов измерительных или выходных модулей датчиков
Система сбора данных (DAQ)	Молекулярные приборы	Digidata 1440A	Аналого-цифровой преобразователь высокого разрешения
Усилитель/источник питания с фиксированным коэффициентом усиления	Hewlitt Packard	HP 6826A	Усиливает выходное напряжение постоянного тока от модуля выхода
напряжения Стеклянная крышка Slip	Corning	CLS284525	Уплотняет дно алюминиевой основы и позволяет проводить оптическую характеристику двухслойного
нагревательного элемента (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 мм 25 мм полимидовый пленочный каптоновый нагревательный элемент с ограничением мощности 5 Вт.
Винт M3 из нержавеющей стали McMaster	Carr	90116A150	Крепит термопару к алюминиевому приспособлению
Усилитель патч-зажима	Молекулярные устройства	AxoPatch 200B	Измеряет ток и выходное напряжение на головном каскаде
Персональный компьютер	Любой		компьютер с несколькими высокоскоростными usb портами и минимум 6 Гб оперативной памяти
Хлорид калия	Sigma Aldrich	P3911	Раствор электролита диссоциированных ионов
Модуль ввода температуры	National Instruments	NI 9211	Позволяет проводить измерения термопар с разомкнутым и холодным спаем для шасси cDAQ
Термопара	Omega	JMTSS-020U-6	Термопара U-типа диаметром 0,02 дюйма и длиной 6 дюймов
УФ-отверждаемый клей	Loctite	19739	Крепит стеклянное покровное стекло к алюминиевому основанию светильника
Модуль выхода напряжения	National Instruments	NI 9263	Модуль аналогового вывода напряжения для использования с шасси cDAQ
Генератор сигналов	Agilent	33210A	Используется для вывода синусоидального сигнала с напряжением 10 мВ и частотой 10 Гц