Трехмерная визуализация органоидов для изучения первичного цилиогенеза во время ex vivo органогенеза

Краткое содержание

Органоиды, полученные из стволовых клеток, облегчают анализ молекулярных и клеточных процессов, регулирующих самообновление и дифференцировку стволовых клеток в ходе органогенеза в тканях млекопитающих. В данной статье представлен протокол анализа биологии первичной реснички в органоидах молочной железы мыши.

Аннотация

Органоиды представляют собой трехмерные структуры, полученные из стволовых клеток, которые ex vivo воспроизводят сложную архитектуру и физиологию органов. Таким образом, органоиды представляют собой полезные модели для изучения механизмов, контролирующих самообновление и дифференцировку стволовых клеток у млекопитающих, включая первичный цилиогенез и ресничную сигнализацию. Первичный цилиогенез — это динамический процесс сборки первичной реснички, ключевого клеточного сигнального центра, который контролирует самообновление и/или дифференцировку стволовых клеток в различных тканях. В данной работе мы представляем комплексный протокол иммунофлуоресцентного окрашивания клеточной линии и первичных маркеров ресничек в целых органоидах молочной железы мышей для световой листовой микроскопии. Мы описываем метод микроскопии и технику обработки изображений для количественного анализа первичной сборки и длины ресничек в органоидах. Этот протокол позволяет проводить точный анализ первичных ресничек в сложных трехмерных структурах на уровне одной клетки. Этот метод применим для иммунофлуоресцентного окрашивания и визуализации первичных ресничек и ресничной сигнализации в органоидах молочной железы, полученных из нормальных и генетически модифицированных стволовых клеток, из здоровых и патологических тканей, для изучения биологии первичной реснички в норме и при заболеваниях.

Введение

Развитие многоклеточных организмов и поддержание гомеостаза в их взрослых тканях находятся в тонко настроенной регуляции между самообновлением и дифференцировкой стволовых клеток, которые организуют во времени и пространстве нормальное развитие^{и регенерацию} тканей. Нарушение этого правила приводит к аномалиям развития и раку². Таким образом, понимание молекулярных и клеточных механизмов, которые управляют самообновлением и дифференцировкой стволовых клеток, представляет ключевой интерес для биологии развития и рака.

Недавнее развитие методов органогенеза ex vivo, в которых тканевые стволовые клетки генерируют трехмерные органоиды, изменило наши возможности по изучению динамики стволовых клеток во время органогенеза млекопитающих и поддержания тканевого гомеостаза в^чашке. Органоиды представляют собой хорошую альтернативу громоздким генетически модифицированным животным моделям для изучения этих процессов. В настоящее^{время разработаны} протоколы разработки органоидов из тканевых стволовых клеток многих органов3, включая тонкую кишку и толстую кишку, желудок, печень, поджелудочную железу, простату и молочную^{железу3}. Кроме того, разработка методов редактирования соматического генома в органоидных стволовых клетках теперь позволяет быстро исследовать молекулярные и клеточные механизмы, которые контролируют их ^{биологию.}

Первичная ресничка представляет собой структуру на основе микротрубочек, которая собрана на поверхности стволовых и/или дифференцированных клеток различных тканей⁶. Как правило, он неподвижен и собран как единая структура в каждой ячейке⁷. Первичный цилиогенез — это динамический процесс сборки первичной реснички⁷. На поверхности клетки ресничка действует как клеточная сигнальная платформа⁸. Таким образом, считается, что первичная ресничка действует как ключевой регулятор самообновления и/или дифференцировки стволовых клеток во многих тканях, включая мозг ^9,10, молочную железу ^4,11, жировую ткань¹² и обонятельный эпителий¹³, среди прочих. Первичный цилиогенез и/или ресничная сигнализация динамически регулируются в отдельных клеточных линиях и на разных стадиях развития ^4,13,14, но лежащие в их основе механизмы еще в значительной степени не определены.

Органогенез ex vivo обещает развитие базовых знаний о молекулярных и клеточных механизмах, контролирующих биологию стволовых клеток, включая первичный цилиогенез и ресничную сигнализацию. Тем не менее, он опирается на способность правильно визуализировать целые органоиды на уровне одной клетки и на субклеточном уровне. Недавно мы использовали модель органоида, полученного из стволовых клеток молочной железы мыши, чтобы показать, что первичные реснички положительно контролируют органоидообразующую способность стволовых клеток молочной железы мыши⁴. Здесь мы представляем комплексный протокол иммунофлуоресцентного окрашивания целых органоидов молочной железы мыши (рис. 1A, B), который позволяет анализировать первичные реснички с помощью световой листовой микроскопии во время ex vivo органогенеза в трехмерном измерении. Недавно были опубликованы альтернативные методы иммунофлуоресцентного окрашивания и визуализации органоидов с помощью конфокальной микроскопии^15,16. Вместо этого этот протокол фокусируется на получении и визуализации органоидов с помощью световой листовой микроскопии.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол рекомендуется для окрашивания органоидов, которые были выращены в 5 лунках из 96-луночной пластины и объединены вместе (> 100 органоидов). Органоиды были получены из стволовых клеток молочной железы мышей. Мыши-доноры размещались и обрабатывались в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными Университета Ренна (Франция).

1. Реактивы

1. Для приготовления фиксирующего раствора разведите 125 мкл 16% водного коммерческого раствора параформальдегида (PFA) в 375 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) с получением 4% раствора PFA.
   ВНИМАНИЕ: Манипулируйте PFA, которое является токсичным веществом, под химическим колпаком.
2. Для приготовления буфера для пермеабилизации разбавьте 1,5 мкл Triton X100 в 500 мкл PBS, чтобы получить 0,3% раствор Triton X100.
3. Для приготовления блокирующего буфера разбавьте 1,5 мкл Tween-20 и 75 мкл нормальной козьей сыворотки в PBS, чтобы получить 5% раствор козьей сыворотки-0,1% Tween 20.
4. Для приготовления монтажной среды для легкого листа растворите 1 г сверхчистой агарозы с низкой температурой плавления в 100 мл dH20 или PBS при 65 °C. Приготовьте 1 мл аликвот и храните при комнатной температуре.

2. Восстановление органоидов

1. Перенесите органоиды из культуральных лунок в полимерную пробирку с низким связыванием объемом 1,7 мл, предварительно пипетируя их вверх и вниз 3 раза в лунках, с наконечником с покрытием FBS, для которого был срезан конец (минимальный диаметр конца 1,5 мм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие предотвращает прилипание органоидов к кончику. Малосвязующий полимерный материал позволяет уменьшить прилипание органоидов к боковой стороне тубы в течение всей процедуры окрашивания.
2. Наполните пробирку PBS и вращайте при 350 x g в течение 3 минут. Удалите надосадочную жидкость.

3. Фиксация, пермеабилизация и блокада

1. Ресуспендируйте органоиды в 500 мкл 4% PFA. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре. Вращайте при 350 x g в течение 30 с. Удалите надосадочную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, ресуспендируйте органоиды в различных буферах, просто добавляя буферы на гранулу органоидов, не касаясь их. Выполняйте все этапы стирки при комнатной температуре.
2. Промойте органоиды 1 мл PBS в течение 3 минут. Вращайте при 350 x g в течение 30 с. Удалите надосадочную жидкость.
   ПАУЗА: Фиксированные органоиды можно хранить в PBS при температуре 4 °C не менее недели.
3. Пермеабилизируйте органоиды, повторно суспендируя их в 500 мкл PBS-Triton X100 0,3% и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре. Уменьшите количество органоидов при 350 g в течение 30 с.
4. Промойте органоиды, повторно суспензировав их 1 мл PBS и инкубируйте в течение 3 минут. Вращайте при 350 x g в течение 30 с. Удалите надосадочную жидкость. Повторите один раз.
5. Дополнительно: Ресуспендирование органоидов в 500 мкл ледяного метанола. Выдерживать при температуре -20 °C в течение 10 мин. Этот этап может потребоваться для окрашивания специфических центросомальных маркеров.
6. Необязательно (если был выполнен шаг 5): Промойте органоиды 1 мл PBS в течение 3 минут. Вращайте при 350 x g в течение 30 с. Удалите надосадочную жидкость. Повторите один раз.
7. Блокируйте сайты связывания неспецифических антител в органоидах путем их суспендирования 500 мкл блокирующего буфера (PBS, 5% козья сыворотка, 0,1% Tween 20). Выдерживать 1 ч 30 мин при комнатной температуре. Отжим при 350 g в течение 30 с. Удалите надосадочную жидкость.
8. Промойте органоиды, повторно суспензировав их 1 мл PBS и инкубируйте в течение 3 минут. Вращайте при 350 x g в течение 30 с. Удалите надосадочную жидкость.

4. Маркировка

1. Ресуспендируют органоиды 200 мкл блокирующего буфера с разбавленными первичными антителами и инкубируют в течение ночи при 4 °C с легким встряхиванием (60 об/мин на горизонтальном шейкере). Поместите трубки под углом 45° в горизонтальном плане шейкера. Он будет поддерживать органоиды на дне пробирок в буфере для окрашивания.
2. Промойте органоиды, повторно суспензировав их 1 мл PBS, и инкубируйте в течение 5 минут. Вращайте при 350 x g в течение 30 с. Удалите надосадочную жидкость. Повторите дважды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые органоиды на последнем этапе могут прилипать к боковой стороне пробирки, что приводит к потере органоидов во время аспирации надосадочной жидкости после центрифугирования, добавление 0,2% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS на этапах промывки может снизить потерю органоидов.
3. Ресуспендируют органоиды 200 мкл блокирующего буфера с вторичными антителами и инкубируют в течение 1 ч 30 мин с легким встряхиванием (60 об/мин на горизонтальном шейкере). Поместите трубки под углом 45° в горизонтальном плане шейкера. Он будет поддерживать органоиды на дне пробирок в буфере для окрашивания.
   Примечание: Hoechst (или другие ядерные красители, такие как DAPI или DRAQ5) могут быть добавлены в буфер со вторичными антителами.
4. Промойте органоиды, повторно суспензировав их 1 мл PBS, и инкубируйте в течение 5 минут. Вращайте при 350 x g в течение 30 с. Удалите надосадочную жидкость. Повторите дважды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые органоиды на последнем этапе могут прилипать к боковой стороне пробирки, что приводит к потере органоидов во время аспирации надосадочной жидкости после центрифугирования, добавление 0,2% (w/v) BSA к PBS на этапах промывки может уменьшить потери органоидов.

5. Подготовка образца агарозы к визуализации

1. Расплавьте легкий листовой монтажный материал, инкубируя его при 65 °C. Как только среда растает, инкубируйте ее при температуре 37 °C в течение 5 минут.
2. Ресуспендировать органоиды в 100 мкл монтажной среды с помощью наконечника объемом 200 мкл, с концом среза кончика (минимальный размер конца: 1,5 мм), дважды пипетируя вверх и вниз.
3. Всасывайте монтажную среду с органоидами в стеклянный капилляр (зеленый капилляр, внутренний диаметр: 1,5 мм) с помощью поршня. Инкубируйте капилляр при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы монтажная среда застыла.
   ПАУЗА: Капилляры можно хранить в PBS при температуре 4 °C в течение недели перед визуализацией.

6. Визуализация

1. С помощью светового листового микроскопа (например, ZEISS Lightsheet Z.1) визуализируйте органоиды с помощью 20-кратных или 40-кратных объективов для погружения в воду.
   1. Поместите стеклянный капилляр в камеру наблюдения. Найдите капилляр с помощью фронтальной камеры и поместите кончик стеклянного капилляра на верхнюю границу объекта обнаружения.
   2. Выберите образец и установите оптимальный фокус с помощью кончика стеклянного капилляра при светлопольном освещении. Медленно вытолкните образец агарозы из капилляра и найдите органоиды внутри затвердевшей агарозы.
   3. Органоиды для визуализации должны находиться близко к кончику капилляра, чтобы уменьшить движение образца агарозы в PBS. Поверните капилляр, чтобы установить оптимальную ориентацию образца и определить желаемый масштаб.
   4. Выберите режим сбора данных. Определите каналы для изображения, установите правильную ориентацию светового листа, установите мощность лазера для каждого канала (чтобы уменьшить фотообесцвечивание, используйте низкую мощность лазера), установите размер изображения и желаемую сторону (стороны) освещения. Пример параметров изображения: Размер изображения 1920 x 1920, освещенность: двусторонняя.
   5. Определите Z-стек в образ, установив Z-концы стека с помощью модуля Z-стек, и установите оптимальный размер Z-шага.
2. Обработайте выходной файл с помощью модуля обработки изображений программного обеспечения микроскопа для навигации по образцу, получения Z-проекции и 3D-представления.
3. Поверните образец и получите новое изображение под другим углом или сфотографируйте другие органоиды.
4. Анализируйте изображения с помощью интерактивного программного обеспечения для анализа изображений для микроскопии (например, Imaris), позволяющего (i) визуализировать образец в 3D, (ii) сегментировать объекты, (iii) идентифицировать и количественно анализировать объекты.

Результаты

Методы органогенеза ex vivo трансформируют наши возможности по изучению развития тканей млекопитающих и поддержанию тканевого гомеостаза в чашке. Анализ молекулярных и клеточных механизмов, регулирующих эти процессы, включая первичный цилиогенез и ресничную сигнализацию, опирается на способность визуализировать органоиды в трехмерном пространстве.

Описанный выше протокол позволяет окрашивать органоиды молочной железы целиком. Они возникают из обогащенных стволовыми клетками молочной ж...

Обсуждение

Представленный здесь подробный протокол позволяет окрашивать и визуализировать органоиды молочной железы мыши, которые растут в полутвердой среде. Этот протокол, по-видимому, применим для окрашивания органоидов, имитирующих архитектуру различных тканей, которые растут в полутвердых и твердых средах. Для органоидов, которые растут в 100% Матригеле со средой сверху, этапы восстановления и фиксации немного отличаются. Питательную среду необходимо хорошо удалить из культуры. После быстрой пр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антимышиный IgG1 647	Термофишер	A21240
Антимышиный IgG2A 488	Термофишер	A21131
Антикролик 546	Термофишер	A11035
Arl13b	НейроМаб	73-287
EMS 16% параформальдегидный водный раствор, ЭМ класс	Электронная микроскопия Науки	15710
FBS	Thermo-Fisher	10270106
гтубулин	Sigma-Aldrich	T5326
Hoechst 33342	Thermo-Fisher	62249
Integrin a6 Biolegend		313616
Легкий листовой капиллярный	Zeiss	701908
Легкий листовой поршень	Zeiss	701998
Низкий связывающий Микроцентрифужные пробирки	BioScience	27210
Нормальная козья сыворотка Блокирующий раствор	Векторные лаборатории	S-1000
PBS	Sigma-Aldrich	p3587
передачи сигналов	слизнячковых	9585
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284
Tween-20	Euromedex	9005-64-5
UltraPure с низкой температурой плавления Agarose	Thermo-Fisher	16520050