Методическая статья

Анализ городской среды - трубопровод для отбора проб и обнаружения SARS-CoV-2 из экологических резервуаров

3.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62379

⸱

9 апреля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University, 2Viral Information Institute, San Diego State University, 3Big Rose Web Design, LLC

В этой статье

Краткое содержание

Гражданский научный проект был разработан для привлечения жителей Сан-Диего для сбора образцов окружающей среды для SARS-CoV-2. Многоязычная веб-платформа была создана для отправки данных с использованием удобного интерфейса мобильного устройства. Система управления лабораторной информацией облегчила сбор тысяч географически разнообразных образцов с отслеживанием результатов в режиме реального времени.

Аннотация

Для контроля за передачей коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) во время глобальной пандемии 2020 года большинство стран внедрили стратегии, основанные на прямом тестировании на людях, покрытии лица и дезинфекции поверхности. Исходя из предположения, что основной путь передачи включает аэрозоли и респираторные капли, усилия по обнаружению SARS-CoV-2 в фомитах были сосредоточены на местах с подозрением на высокую распространенность (например, больничные палаты, круизные суда и системы общественного транспорта). Чтобы исследовать присутствие SARS-CoV-2 на поверхностях в городской среде, которые редко очищаются и редко дезинфицируются, 350 граждан были привлечены из округа Сан-Диего. Всего эти гражданские ученые собрали 4080 образцов. Была разработана онлайн-платформа для контроля за доставкой и получением комплектов для отбора проб, а также для сбора данных о пробах. Наборы для отбора проб были в основном построены из материалов, доступных в магазинах, испытывая стресс в условиях пандемии. Образцы обрабатывались с использованием реагентов, к которым было легко получить доступ, несмотря на периодический дефицит поставок. Используемые методы были высокочувствительными и устойчивыми к ингибиторам, которые обычно присутствуют в образцах окружающей среды. Предложенные экспериментальные методы проектирования и обработки были успешными в привлечении многочисленных гражданских ученых, которые эффективно собирали образцы с различных площадей поверхности. Рабочий процесс и методы, описанные здесь, имеют отношение к обследованию городской среды на наличие других вирусов, которые представляют интерес для общественного здравоохранения и представляют угрозу для будущих пандемий.

Введение

Считается, что SARS-CoV-2 в основном передается при вдыхании загрязненных аэрозолей и капель при прямом контакте с инфицированными лицами1,2,3,4. Однако на начальных этапах глобальной пандемии COVID-19 усилия по борьбе с передачей SARS-CoV-2 были сосредоточены на дезинфекции поверхностей, мытье рук и санитарной обработке. К концу 2020 года руководящие принципы по передаче инфекции Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)5 и Центров США по контролю и профилактике заболеваний (CDC)6 считали передачу инфекции воздушно-капельным путем опасной главным образом при тесном контакте (<2 м) с инфицированным человеком или в присутствии аэрозольных медицинских процедур. Самопрививка после контакта с загрязненными поверхностями или вдыхания аэрозольных фомитов еще не исключена в качестве пути передачи SARS-CoV-2.

Были зарегистрированы случаи COVID-19, когда передача по воздуху кажется маловероятной7,8. Вирионы SARS-CoV-2 остаются заразными на меди до 8 ч, на картоне и нержавеющей стали до 24 ч, а на пластике до 48 ч9. В каютах круизных судов РНК SARS-CoV-2 была обнаружена через 17 дней после того, как пассажиры вылетеличерез 7. Пробы воздуха и поверхности из больниц и систем общественного транспорта дали положительный результат на SARS-CoV-2 и другие коронавирусы8,10,11,12,13,14. Исследование, проведенное на внешней упаковке конфет на Хэллоуин, обработанных бессимптомными и умеренными / умеренно симптоматическими пациентами с COVID-19, показало, что сочетание мытья рук обработчиком и мытья конфет с мылом для рук снижает РНК SARS-CoV-2 ниже пороговых уровней15.

Опубликовано несколько методов диагностики SARS-CoV-2 наосновеполимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR)16,17,петлево-опосредоопосредоования с обратной транскрипцией изотермической амплификации (RT-LAMP)11, 18, 19,20, 21и CRISPR-Cas18,19,22,23. Большинство из них нуждаются в наборах для экстракции РНК, которые часто находятся в дефиците в периоды значительного глобального спроса, и очень немногие из них использовались для экологического скрининга вируса24. Было продемонстрировано, что обнаружение РНК SARS-CoV-2 с использованием RT-LAMP более чем на 83% согласуется с использованием RT-qPCR. Кроме того, RT-LAMP привел к снижению неубедительных результатов на 25% по сравнению с RT-qPCR15.

RT-LAMP представляет собой простую технику, которая использует обратную транскриптазу для синтеза кДНК из шаблонаРНК 25,за которой следует ДНК-полимераза с сильной активностью смещения нитей, которая синтезирует ДНК при постоянной температуре (т.е. изотермическая амплификация)26. Более высокая специфичность обнаружения вирусного генома достигается за счет использования четырех или шести праймеров, которые распознают шесть или восемь областей целевой ДНК. Амплификация инициируется из внутреннего праймера и дает полудвоцепочечную структуру ДНК. Затем ведущая нить усиливается внешней грунтовой. Эти усиления повторяются для обратных праймеров. Внутренние и внешние грунтовки на любом конце имеют внутренний обратный саморепломплементарный участок, образующий петлю в продукте усиления26,27. При изотермическом смещении нитей асинхронный синтез ДНК генерирует большие количества амплифицированного продукта, где непрерывная полимеризация усиливает сигнал всего лишь 10 копий на реакцию11,20,28. Колориметрическая смесь RT-LAMP слабо буферизована и использует фенол-красный в качестве индикатора pH. Поскольку полимераза включает нуклеотид, она высвобождает протон, и достаточное количество протонов изменит рН раствора, а также его цвет с розового на желтый11,20,28,29.

RT-LAMP был разработан для выявления заболеваний, переносимых комарами, в периферических медицинских учреждениях, в которые отсутствуют полностью оборудованные лаборатории25, и для быстрого обнаружения других РНК-вирусов, таких как вирус иммунодефицита человека30. Наиболее уязвимые группы населения во время эпидемических вспышек — в соответствии с определением ВОЗ — часто не имеют достаточных экономических ресурсов и соответствующего оборудования для проведения обнаружения (Глобальная повестка дня Организации Объединенных Наций в области общественного здравоохранения). В условиях нынешней пандемии SARS-CoV-2 такие поставки, как медицинские мазки и реагенты для наборов для экстракции РНК, не смогли удовлетворить глобальный спрос, особенно в непроизводственных странах. В предлагаемом протоколе использовалась экстракция сырой РНК на основе гуанидиния тиоцианата (GITC), которая эффективно сохраняла РНК независимо от холодовой цепи и значительно уменьшала стойкость ингибиторов из образца. Кроме того, протокол экстракции GITC-хлороформа основан на отделении РНК от ДНК и белков с последующим осаждением, что позволяет восстановить большую часть генетического материала. Эти преимущества перевешивают потенциальные опасности гражданских ученых, работающих с химическим веществом, если будут приняты меры для надлежащего информирования их о рисках.

В предлагаемом рабочем процессе используются материалы и реагенты, которые имеют общее применение. Для этого требуется оборудование, которое доступно в базовых, часто сельских, лабораторных условиях. Эти методы недороги, очень устойчивы к ингибиторам, часто встречаемым в образцах окружающей среды или образцах, которые не могут быть обработаны экстракционными наборами, и устраняют необходимость в высокоточном термоциклере. В настоящем исследовании представлен трубопровод для отбора проб и обнаружения SARS-CoV-2 из экологических резервуаров на часто затрагиваемых и редко дезинфицируемых поверхностях домашних хозяйств и городской среды.

Протокол

В Таблице материалов приведен подробный список реагентов и расходных материалов, включая каталожные номера, производителя и соответствующие затраты.

1. Выборка городской среды

  1. Работа с гражданскими учеными
    1. Привлекаем гражданских ученых, используя прямой и четкий призыв к действию, опубликованный через местные и социальные сети. Создайте дескриптор социальных сетей (например, #swab4corona),чтобы связать тему с контентом социальных сетей.
    2. Создайте учетную запись электронной почты для прямого общения между командой лаборатории и каждым гражданским ученым, управляемым человеком, свободно владея основными языками интересующего региона (например, испанским и английским для округа Сан-Диего).
    3. Создайте безопасную веб-платформу управления выборками (SMP), которая будет служить базой данных, системой управления лабораторной информацией (LIMS) и общаться с гражданскими учеными.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SMP обеспечивает централизованное расположение, где пользователи запрашивают комплект, получают доступ к протоколам сбора образцов, отправляют метаданные образцов и запрашивают получение готовых наборов образцов.
    4. Создайте ссылку на SMP (например, https://demo.covidsample.org/)(рисунок 1)для физических лиц, чтобы подать заявку на участие в усилиях по отбору проб окружающей среды, ответив на вопросы, связанные с биобезопасностью, указанные в онлайн-форме.
    5. Безопасный доступ к SMP с помощью интерфейса прикладного программирования проверки подлинности, облегчаемого поставщиком облачных компьютерных услуг. Предоставьте утвержденным пользователям доступ к SMP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к литературе для описания протокола OAuth 2.031 для проверки подлинности и авторизации. Он обеспечивает беспроблемный процесс входа в систему для гражданских добровольцев-ученых. Он также позволяет пользователям входить в систему с помощью существующей учетной записи, устраняя необходимость создания пользовательского решения для входа и управления учетными данными пользователей, что значительно экономит время и поощряет участие. Согласно последним сообщениям, бесплатный сервис электронной почты, доступный для выбранного поставщика облачных компьютерных услуг, насчитывает около 1,5 миллиарда активных пользователей электронной почты в месяц; Требование учетной записи электронной почты от этого поставщика услуг для участия не считается обескураживающим фактором.
    6. Объясните цель исследования и соображения биобезопасности гражданским ученым в SMP, прежде чем они запросят свой первый комплект. Предоставьте многоязычный плагин для обеспечения навигации на любом из языков, доступных в многоязычной службе нейронного машинного перевода, предоставляемой поставщиком облачных компьютерных услуг.
    7. Включите в раздел выборки графические и аудиовизуальные протоколы на английском и испанском языках.
    8. Назначьте уникальный идентификатор каждому комплекту и разработайте пользовательский интерфейс таким образом, чтобы использовать кнопки, связанные с Sample ID, для упрощения процесса ввода данных(рисунок 1A).
    9. Используйте программное обеспечение для планирования маршрута доставки с приложением для мобильных устройств, которое будет использоваться водителями для оптимизации маршрутов доставки / самовывоза и уведомления гражданских ученых о точном расчетном времени прибытия.
    10. Постройте платформу LIMS на стеке веб-сервисов PHP и разместяйте ее на коммерческой платформе хостинга (предлагаемая операционная система, программное обеспечение веб-сервера и программное обеспечение базы данных указаны в Таблице материалов).
    11. Обеспечьте безопасный веб-интерфейс приложений, позволяющий персоналу лаборатории быстро и легко управлять данными в LIMS. Обеспечьте визуализацию данных с помощью интерфейса прикладного программирования для построения диаграмм данных, предоставляемого поставщиком облачных компьютерных услуг.
    12. Визуализируйте геопространственные данные с помощью интерфейса геопространственного прикладного программирования, облегчаемого поставщиком облачных компьютерных услуг. Хранить данные, представленные в LIMS через SMP, чтобы облегчить (1) централизованное хранение проектных данных; (2) отслеживание рабочих процессов обработки образцов/данных; и 3) управление материально-техническим обеспечением распределения комплектов образцов среди гражданских ученых.
    13. Защита представленных метаданных с использованием передовой практики (например, https://demo.covidsample.org/).
    14. Предварительная загрузка информации, такой как идентификатор образца, идентификатор образца, дата, время и координаты глобальной системы позиционирования (GPS) (автоматически собранные из изображения сайта), чтобы обеспечить соответствие типа данных и свести к минимуму отправку ошибочных или отсутствующих данных пользователем(рисунок 1B). Включите следующие поля, которые должны быть вручную и быстро (<1 мин) заполнены гражданским ученым: дата и время сбора, краткое описание местоположения и изображение места отбора проб.
    15. Облагораживайте все загруженные данные и проверяйте тип данных. Например, проверьте данные изображений, загруженные пользователями, чтобы выбрать .jpg файлы, переименуйте их с помощью Sample ID для быстрой связи с образцом и сохраните загруженные изображения в отдельном безопасном месте, недоступном для пользователей.
    16. Активируйте опцию запроса на доставку и получение комплекта, когда все образцы (16) будут завершены. Кроме того, активируйте опцию запроса нового комплекта, который будет доставлен при получении предыдущего(рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для добровольцев, которые предпочитают не веб-платформу, и для тех, кто обеспокоен раскрытием своего местоположения GPS (например, членов сообщества, обеспокоенных их миграционным статусом), наборы могут быть доставлены в согласованное место встречи, а добровольцев просят записать письменную версию сбора данных. Для общения между лабораторией и каждым гражданином-ученым, иметь двуязычного участника проекта, доступного для телефонных звонков и текстовых сообщений.
  2. Тампон для короны
    1. Определить эпидемиологически значимое временное окно для отбора проб.
    2. Соберите комплект, который содержит все материалы для отбора проб, включая необходимые средства индивидуальной защиты (например, маску, перчатки), протокол отбора проб и информацию, относящуюся к биобезопасности(рисунок 2). Предварительно маркировать каждую трубку с присвоенным уникальным идентификатором (Sample ID).
    3. Тампон редко дезинфицирует поверхности, которые подвергаются воздействию аэрозольных фомитов в домашних хозяйствах и городской среде.
      1. Носите предоставленную маску в общественных местах и новую пару перчаток для сбора каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения. После завершения отбора проб используйте предоставленное дезинфицирующее средство для рук.
      2. Смочите 1см2 полиэфирной абсорбирующей тампон (например, швабры) моющим средством (например, 0,5% додецилсульфата натрия (SDS)) для инактивации вируса путем разрушения его оболочки и стабилизации голой РНК путем индуцирования разворачиванияРНК 32.
      3. Смавь на поверхность 10см2. С помощью зубочистки полностью погрузите каждый образец тампона в соответствующую предварительно маркированную пробирку, содержащую 200 мкл раствора гуанидиниума тиоцианата (GITC). Храните тубы при 4 °C до тех пор, пока они не будут транспортированы в лабораторию. Как только образцы поступят в лабораторию, храните их при -80 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: GITC является токсичным раздражителем; избегать контакта с кожей. Раствор GITC прост в приготовлении из обычных лабораторных химикатов, рецепт см.в 33,34. Он инактивирует вирус, стабилизирует РНК путем денатурацииРНК 34,35,36и стабилизирует образцы при комнатной температуре. Комплект, однако, включает в себя пакеты со льдом, чтобы держать образцы холодными без необходимости использовать бытовые холодильники для хранения.

2. Обнаружение SARS-CoV-2

  1. Полная изоляция РНК
    1. Дезинфекция поверхностей, оборудования и пипеток раствором 2 мМ медного сульфата и 3% перекиси водорода; затем следует раствор 10% отбеливателя, 90 мМ бикарбоната натрия, 5% SDS и 2,5% NaOH. Тщательно протрите дистиллированной водой, а затем 75% этанолом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти решения являются альтернативой коммерчески доступным решениям.
    2. Оттаивать образцы на льду. Вихревые пробы в течение 2 мин на средней скорости.
    3. Чтобы увеличить скорость скрининга, обработайте образцы в бассейнах. Если пул положительный, извлеките РНК каждого образца независимо, чтобы найти положительный образец (ы). Объедините образцы из каждого набора для отбора проб (всего 16) в 2 пула по 8 образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие 8 образцов на пул означает, что только 2 пула должны быть обработаны на комплект. Если пул положительный, то отдельные образцы повторно обрабатываются для индивидуального анализа RT-LAMP. Это сокращает время, затраты и реагенты.
    4. Пул 50 мкл каждого из 8 образцов в микроцентрифужную трубку (общий объем 400 мкл); сохранить оставшийся образец при -80 °C. Добавьте 0,2 объема (80 мкл) хлороформа, вихрь в течение 15 с, а затем инкубировать в течение 20 мин при 4 °C. Центрифуга при 13 000 × г в течение 20 мин при 4 °C.
    5. Перенесите водный (прозрачный жидкий) слой в новую микроцентрифужную трубку. Храните оставшуюся часть раздела и розовую жидкость в морозильной камере -80 °C; эти фракции содержат ДНК и белки33,36.
    6. Добавьте равный объем изопропанола (~200 мкл) и 2,6 мкл гликогена(15 мг мл-1)37. Хорошо перемешать и инкубировать при -20 °C в течение, по меньшей мере, 1 ч, а затем 4 °C в течение 10 мин для осаждения РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь путем инкубации образцов при -20 °C в течение ночи вместо 1 ч.
    7. Центрифуга при 13 000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Удалите супернатант, не нарушая гранулу. Повторно суспендируют гранулу в 50 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC), и добавляют равный объем (50 мкл) РБАзы 5 М ацетата аммония и 2,5 объема (250 мкл) 100% этанола7,38.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ионы аммония ингибируют полинуклеотидкиназу, если они используются в последующем процессе38. Смесь осаждает РНК, оставляя дезоксинуклеозидтрифосфаты и олигосахариды врастворе 38.
    8. Хорошо перемешать и инкубировать при -20 °C в течение, по меньшей мере, 1 ч, а затем 4 °C в течение 10 мин для осаждения РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь путем инкубации образцов при -20 °C в течение ночи вместо 1 ч.
    9. Центрифуга при 13 000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Вымойте гранулу 1 мл холодного (-20 °C), свежеприготовленного 75% этанола. Центрифуга при 8 000 × г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант пипеткой P10, чтобы не потревожить гранулу.
    10. Гранулы высушивают на воздухе в течение 10-15 мин, пока не останется этанола. Повторно суспендируют гранулу в 50 мкл воды, обработанной DEPC, добавляют 5 мкл 10x ДНКазного буфера + 1 мкл ДНКазы (2 единицы мкл-1)и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин.
    11. Добавьте 0,1 объема (5,6 мкл) реагента инактивации ДНКазы, инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин и аккуратно перемешайте каждую минуту. Центрифуга при 13 000 × г в течение 2 мин и перенос супернатанта в новую пробирку (~50 мкл). Поместите трубку на лед сразу же во время приготовления реакций RT-qPCR или RT-LAMP или храните в морозильной камере при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните изоляцию РНК в помещении без ампликонов, чтобы избежать переносного загрязнения.
  2. Мультиплексное изотермическое усиление с обратной транскрипцией, опосредованное петлей (RT-LAMP)
    1. Приготовьте 20-кратный раствор грунтовки (таблица 1) для каждого набора грунтовок (таблица 2). Готовят реакционную смесь RT-LAMP (таблица 3) при комнатной температуре с избыточным объемом 10% для учета потерь при пипете.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колориметрическая смесь LAMP 2X с антарктическим термолабильным урацил-ДНК-гликозилазой (UDG) предотвращает амплификацию загрязнения ДНК от предыдущих реакций20,28.
    2. Вихрь и раскрутите смесь вниз. Дозируйте 20 мкл смеси в каждую реакционную трубку: пробу, шипованную, положительную контрольнуюи отрицательную контрольную. Инкубируют реакции в трубках при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы позволить UDG действовать на потенциальное переносяемое загрязнение.
    3. Добавьте 5 мкл РНК к реакции образца, 5 мкл РНК + 2,5 мкл (450 копий) синтетической РНК SARS-CoV-2 к шиповидной реакции, 2,5 мкл (450 копий) синтетической SARS-CoV-2 РНК к положительной управляя реакции и 5 мклН2Ок отрицательной контрольной реакции. Хорошо перемешайте и раскрутите реакции; оттаить всю РНК на льду.
    4. В то время как термоциклер или водяная баня нагревается до 65 °C, позвольте всем реакциям оставаться при комнатной температуре. UDG будет инактивирован при >50 °C. Поместите реакции в термоциклер (используйте тепловую крышку), инкубировать при 65 °C в течение 40 мин и дать реакциям достичь комнатной температуры (~22 °C в течение 5 мин) или остыть на льду в течение 1 мин. Анализируйте результаты, используя колориметрический признак (простое наблюдение) или запуская продукты в агарозном геле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя предел обнаружения (LOD) составляет 10 копий на реакцию, частота обнаружения увеличивается по мере приближения числа копий к 500 копиям на реакцию(рисунок 3A). Для колориметрического наблюдения обратите внимание, что отрицательный результат обозначается розовым цветом (pH = 8,8), тогда как положительный результат обозначается желтым (pH = 5)(рисунок 3B). Колориметрический вариант позволяет избежать открытия трубок RT-LAMP после усиления, что уменьшит объем продукции RT-LAMP в рабочей среде и переносимое загрязнение. Для гелевого электрофореза приготовьте 1,5% агарозный гель с 1X окрашиванием геля ДНК в буфере 0,5% Tris/Borate/EDTA (TBE). Нагрузка 25 мкл реакции + 5 мкл 6Х нагрузочного красителя в каждой скважине. Запускают гель при 100 В в течение 60 мин. Молекулярный маркер не нужен, так как положительные образцы показывают лестничный рисунок(рисунок 3C).

Результаты

Образцы, собранные гражданскими учеными для обнаружения SARS-CoV-2. За 8-месячный период (с середины марта по третью неделю ноября 2020 года) к участию в данном проекте было одобрено 482 гражданина, из них 350 (73%) запросил комплект. В общей сложности было поставлено 362 комплекта (т.е. некоторые участники запросили несколько комплектов), а 246 (70%) были возвращены (рисунок 4A,B). Все 4080 образцов, содержащихся в этих наборах, были обработаны. Места сбора были распределены по Северному побережью, Северному Центральному, Центральному и Южному районам округа, а также по нескольким в восточных округах (рисунок 4А). Эти районы имеют самую высокую плотность населения округа Сан-Диего и наиболее документированные случаи COVID-19, как сообщает Агентство службы здравоохранения Сан-Диего39.

Граждане просили забрать большинство отобранных наборов (т.е. средний показатель успеха: 70,4%). Каждый день запрашивалось 1-16 комплектов, и 0-14 комплектов возвращались в лабораторию(рисунок 4B). Опрос гражданских ученых показал, что сбор полного комплекта (16 образцов) занял 1-3 ч, распределенных в среднем на 8 дней(рисунок 4А и табл. 4). Подавляющее большинство наборов были полными (91,1%), что означает, что они содержали мазок внутри всех 16 пробирок, и соответствующие данные отбора проб были загружены в LIMS(рисунок 4A и таблица 4).

Обнаружение SARS-CoV-2 с использованием экстракции GITC-хлороформа и мультиплексной обратной транскриптазной петлево-опосредоопосредооченной изотермической амплификации (RT-LAMP). Для колориметрического анализа RT-LAMP использовали два набора праймеров11,20,28 для нацеливания на нуклеокапсидные(N2)и оболочку(E1)гены (таблица 2). Последовательности, распознаваемые этими букварями, находятся в том же регионе, что и праймеры и зонды, одобренные CDC40 и Европейским союзом (ЕС)41 для диагностики COVID-19 на людях с помощью RT-qPCR. Эти результаты подтверждают то, что описали Zhang et al.28, в котором добавление 60 мМ гуанидина гидрохлорида в реакцию увеличивает LOD при запуске в мультиплексе. LOD с частотой 100% составлял 500 копий на реакцию 25 мкл (Рисунок 3A,B). В колориметрическом RT-LAMP положительные образцы изменили цвет с розового на желтый из-за сдвига рН от ~8 до 5,5 (рисунок 3B). Когда реакция стала оранжевой при низких числах копий, образцы были запущены в 1,5% агарозном гелевом, чтобы подтвердить, что они были положительными и привели к лестничной картине (рисунок 3C). RT-LAMP использовался для обнаружения SARS-CoV-2 в объединенных образцах РНК.

Для контроля ложноотрицательных результатов из-за ингибиторов реакции каждый образец тестировался в дополнительной реакции, наполненной 500 копиями синтетического SARS-CoV-2. Положительные объединенные образцы были дереплицированы путем выделения РНК каждого отдельного образца в пуле и запускались в реакции RT-LAMP для определения идентичности положительного образца. Затем результаты обнаружения были загружены в LIMS, где уникальный идентификатор образца был сопряжен с информацией о дате, времени, координатах GPS, месте и изображении образца.

Методы ОТ-ПЦР в режиме реального времени и традиционные методы: ингибирование загрязняющими веществами в образцах. Чтобы выбрать наилучший метод, подходящий для предлагаемого конвейера обнаружения, другие методы амплификации РНК были протестированы с образцами окружающей среды, собранными пилотной когортой гражданских ученых. Примеры результатов каждого из этих методов представлены на фиг.5 для отображения их чувствительности к ингибиторам окружающей среды и фоновому сигнальному шуму при низких концентрациях вирусного копи-числа.

Шесть составов RT-qPCR (Таблица материалов), одобренных CDC и ВОЗ, были протестированы для обнаружения вируса на образцах окружающей среды. Протоколы соблюдались в соответствии с инструкциями производителя, а также рекомендациями CDC по выявлению SARS-CoV-2 в клинических условиях40. Реакции, содержащие различные концентрации синтетической РНК SARS-CoV-2, были включены в образцы с мазаной поверхностью после выделения сырой РНК. Все мастер-миксы были чувствительны к ингибиторам при концентрациях LOD положительного контроля (Рисунок 5A).

Чтобы обойти ингибиторы этих технологий реального времени, была протестирована традиционная система ОТ-ПЦР. Одноступенчатая система ОТ-ПЦР (Таблица материалов) использовалась для амплификации гена нуклеокапсида с использованием праймерных наборов N1, N2и гена оболочки с использованием набора праймеров E1, одобренного CDC (США) и ECDC (ЕС) соответственно (Таблица 2). Протоколы соблюдались в соответствии с инструкциями производителя, а также рекомендациями CDC по выявлению SARS-CoV-2 в клинических условиях40. Наборы грунтовок N1 и N2, разработанные CDC, дают продукт ~ 70 bp; однако положительные результаты с низким числом копий не отличались от фонового шума усиления отрицательного контроля (рисунок 5B),что внесло ложные срабатывания в результаты. Произведение праймеров Е1 имело слабый сигнал при низком числе копирования (рисунок 5В),вводя в результаты ложные отрицательные результаты. Кроме того, испытанный метод ОТ-ПЦР по-прежнему чувствителен к ингибиторам, присутствующим в образцах окружающей среды (данные не показаны).

Другие методы были разработаны для обнаружения очень малых количеств целевой последовательности. Одним из таких методов является амплификация по скользящему кругу (RCA), после чего после распознавания целевой последовательности, РНК или ДНК, с помощью определенного линейного зонда лигаза циркуляризирует шаблон. Используя праймеры, предназначенные для гибридизации с зондом, ДНК-полимераза с активностью смещения нитей усиливает зонд в изотермической реакции42. Именно зонд идентифицировал мишень, которая усиливается, а не целевую последовательность, что делает этот метод высокочувствительным43. Wang et al.44 опубликовали протокол RCA для прямого обнаружения РНК SARS-CoV-1. Метод модифицировался для использования праймеров, специфичных для SARS-CoV-2. К сожалению, в некаблонерном контроле (NTC) зонд циркуляризируется и выдает продукт при отсутствии шаблона РНК, даже при использовании широкого спектра лигазов, включая SNP-чувствительную лигазу. В отсутствие лигазы NTC не показывал усиления от линеарализованного зонда (рисунок 5C).

figure-results-1
Рисунок 1:Веб-платформа выборки с интерфейсом сбора данных для мобильных устройств. (A) Веб-сайт, содержащий многоязычный плагин, был создан для посредничества взаимодействия между лабораторией и гражданскими учеными. Платформа использовалась для запроса на доставку/получение комплекта образцов и представления образцовых данных. Платформа содержала подробные англо-испанские графические и аудиовизуальные протоколы сэмплирования. (B)Представление мобильного устройства, используемое для загрузки образцов данных: дата, время, КООРДИНАТЫ GPS, образец описания сайта и изображение сайта коллекции. Сокращения: SARS-CoV-2 = тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2; GPS = Глобальная система позиционирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2:Комплект для сбора образцов. Гражданские ученые получили охладитель, содержащий два пакета со льдом, паспорт безопасности для информирования добровольцев об опасностях обращения с раствором GITC, подробный протокол отбора проб и ношения маски, маску KN95, мешок для отходов, флакон с распылителем для рук, флакон с распылителем с 0,5% SDS, 16 пар перчаток, небольшой пакет с 16 зубочистками и 16 полиэфирными тампонами, 16 предварительно маркированных микроцентрифужных трубок, содержащих 200 мкл раствора GITC, коробку, содержащую пробоотборные трубки, и мешок, используемый в качестве вторичного контейнера для ящика для трубок в случае разлива. Сокращения: GITC = гуанидиниум тиоцианат; SDS = додецилсульфат натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3:Мультиплексированный анализ изотермической амплификации с обратной транскрипцией, опосредоованной петлей (RT-LAMP). Мультиплексированные реакции с использованием праймеров для генов нуклеокапсида SARS-CoV-2(N2)и оболочки(E1)для обнаружения всего 10 копий вируса в реакции. В качестве положительного контроля использовалась синтетическая РНК SARS-CoV-2. (A) Частота обнаружения в мультиплексном колориметрическом RT-LAMP SARS-CoV-2 при различных номерах копий генома за реакцию. Среднее значение пяти реплик в розовом цвете. (B)Предел обнаружения (LOD) SARS-CoV-2 в мультиплексном колориметрическом RT-LAMP; желтый = положительный (рН ~5); розовый = отрицательный (рН ~8). (C)Лестничная картина положительных реакций SARS-CoV-2 RT-LAMP в 1,5% электрофорезе агарозного геля. Сокращения: SARS-CoV-2 = тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2; rxn = реакция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4:Расположение наборов для отбора проб гражданскими учеными в округе Сан-Диего и показатель успешности запрошенных наборов. (A) Оранжевые точки представляют местоположение 1 набора для отбора проб, который содержит 16 образцов. Синяя круговая диаграмма показывает процент наборов, которые заняли несколько дней с момента, когда они были доставлены гражданским ученым, до момента их возвращения в лабораторию. Количество дней в скобках. Оранжевая круговая диаграмма показывает процент наборов с различным количеством завершенных образцов из 16 образцов. Количество заполненных образцов, содержащих мазок внутри пробирки для отбора проб и соответствующие данные отбора проб, загруженные в LIMS в скобках. (B)Процентная доля комплектов, которые были возвращены в лабораторию (точки), и общее количество запрошенных комплектов (стержней) по отношению к дате, когда комплект был запрошен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5:Альтернативные методы SARS-CoV-2 RNAdetection. (A)ОБНАРУЖЕНИЕ RT-qPCR гена нуклеокапсида SARS-CoV-2(N)с использованием праймерного набора N2. Объединенные образцы окружающей среды с 900 (зелеными) или 9 (оранжевыми) копиями SARS-CoV-2. Положительные элементы управления одинаковыми номерами копий синего цвета. Стрелка указывает на снижение флуоресцентного обнаружения положительного контроля с низким числом копий при наличии образца окружающей среды. (B)Традиционное обнаружение ОТ-ПЦР SARS-CoV-2. Вверху: ОТ-ПЦР продукты гена нуклеокапсида с использованием праймерных наборов N1 и N2. Слабый фоновый сигнал наблюдается в элементе управления без шаблона. Внизу: ПРОДУКТЫ ОТ-ПЦР гена оболочки с использованием праймерного набора Е1. Очень низкий сигнал наблюдается при концентрации LOD. Синие стрелки показывают ожидаемый положительный продукт: (вверху) ~70 bp и (внизу) 113 bp в 2% агарозном гелевом электрофорезе. (C)RCA РНК SARS-CoV-2. Циркулярный зонд усиливается в присутствии лигазы и отсутствии шаблона РНК (NTCcir); при отсутствии лигазы и РНК шаблон линейный зонд не усиливается (NTClin). Сокращения: SARS-CoV-2 = тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2; РФС = относительные единицы флуоресценции; bp = пары оснований; rxn = реакция; MM = молекулярный маркер; ОТ-ПЦР = полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; ОТ-qPCR = количественная ОТ-ПЦР в реальном времени; RCA = усиление скользящего круга; NTC= без шаблона; LOD = предел обнаружения; rxn = реакция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

букварьКонцентрация 20X (мкМ)Концентрация 1X (мкМ)
ФИП321.6
БИП321.6
Ф340.2
В340.2
ПетляФ80.4
ПетляБ80.4

Таблица 1: Состав для 20X RT-LAMP грунтовки. В реакции RT-LAMP 6 праймеров распознают 8 областей целевой ДНК. Сокращения: обратная транскрипция петлево-опосредованная изотермическая амплификация; FIP = прямой внутренний грунтовка; BIP = обратная внутренняя грунтовка; F3 = грунтовка с перемещением вперед; B3 = грунтовка с обратным смещением; LoopF = праймер прямого цикла; LoopB = праймер обратного цикла.

букварьпоследовательностьцельРазмер продукта
РТ-ЛАМПА9,18,19
Е1-Ф3TGAGTACGAACTTATGTACTCATмилестничный узор
Е1-В3TTCAGATTTTTAACACGAGAGT
Е1-ФИПACCACGAAAGCAAGAAAAAAGTTCGTTTCGGAAGAGAGACAG
Е1-БИПTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT
E1-LoopBGCGCTTCGATTGTGTGTGTGTGT
E1-LoopFCGCTATTAACTATTAACG
Н2-Ф3АККАГГААКТААЦАГАКААГн
Н2-В3GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCTCT
Н2-ФИПTTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC
Н2-БИПCGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA
N2-LoopFGGGGGCAAATTGTGCAATTTG
N2-ПетляБCTTCGGGAACGTGGTTGACC
РТ-кПЦР38
2019-nCoV_N1-ФГАККККААААТКАГГАААТн72 б/с
2019-nCoV_N1-РTCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
2019-nCoV_N1-П5'-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'
2019-nCoV_N2-ФТТАКАААКАТТГГКККААААн67 л.п.
2019-nCoV_N2-РGCGCGACATTCCGAAGAA
2019-nCoV_N2-П5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3'
ОТ-ПЦР 39
E1_Sarbeco_FACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTми113 б/с
E1_Sarbeco_RАТАТТГКАГКАГТАЦКАКАКАКА

Таблица 2: Грунтовки, используемые для ОТ-ЛАМП, ОТ-кПЦР и ОТ-ПЦР. Перечислены последовательности праймеров, ген-мишень, ожидаемый размер продукта и соответствующая ссылка. Сокращения: RT-LAMP = петлево-опосредованная петля обратной транскрипции изотермическая амплификация; ОТ-ПЦР = полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; bp = пары оснований; ОТ-qPCR = количественная ОТ-ПЦР в реальном времени; E1 = ген оболочки; N2 = ген нуклеокапсида; F = прямой грунтовка; R = обратная грунтовка; P = зонд; FIP = прямой внутренний грунтовка; BIP = обратная внутренняя грунтовка; F3 = грунтовка с перемещением вперед; B3 = грунтовка с обратным смещением; LoopF = праймер прямого цикла; LoopB = праймер обратного цикла.

реагентОбъем (мкл)
Теплый старт Колориметрическая лампа 2X Мастер Микс с UDG12.5
N2 Грунтовка Смесь (20x)1.25
E1 Грунтовка Микс (20x)1.25
Гуанидина гидрохлорид (600 мМ)*2.5
Целевая РНК5
Без нуклеаз H2O2.5
Общий объем25

Таблица 3: Реакционная мастер-смесь для мультиплексного колориметрического RT-LAMP. (*) Было показано, что гуанидина гидрохлорид повышает чувствительность и скорость реакции с помощью нехарактеризованного механизма28. Сокращения: LAMP = петлево-опосредованное изотермическое усиление; UDG = урацил-ДНК-гликозилаза; N2 = ген нуклеокапсида; E1 = ген оболочки; DEPC = диэтилпирокарбонат.

Утвержденные гражданеГраждане, запросившие комплектПоставляемые комплектыВозвращенные образцы комплектовДни, посвященные отбору проб% Комплекты% Неполные комплектыОбработанные образцы
48272.6% (350/482)36270.4% (255/362)значить891.1 (224/246)8.9 (22/246)4,080
медиана3

Таблица 4:Мазок для SARS-CoV-2 по цифрам. Показатели успешности охвата и выборки. Аббревиатура: SARS-CoV-2 = тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2.

Обсуждение

Участие гражданского ученого. Гражданские ученые были привлечены для мазка поверхностей по всему округу Сан-Диего, чтобы взять пробы и обнаружить присутствие SARS-CoV-2 в городской среде. Большинство поставляемых комплектов для отбора проб (70%) были возвращены в лабораторию, и из них почти все образцы были полными (91%) (Рисунок 3А,В и Таблица 4). Добровольцы могли легко запросить доставку / получение комплекта через веб-платформу, а программное обеспечение для планирования маршрута доставки уведомляло гражданских ученых о предполагаемом времени прибытия, что, вероятно, является значительным фактором для наблюдаемого успеха. Среднее время с момента доставки комплекта гражданскому ученому до момента его возвращения в лабораторию составляло 8 дней, со средним значением 3 дня и диапазоном 1-64 дня (рисунок 3А и таблица 4). Более частые напоминания добровольцам, вероятно, сократят это время задержки.

Платформой сбора данных успешно пользовалось подавляющее большинство пользователей (73%) (Таблица 4). Хотя усилия гражданских ученых не были измерены, полевые испытания показали, что платформа сбора данных значительно сократила усилия и время, необходимые для надлежащего завершения сбора образцов. Таким образом, сокращение объема бухгалтерского учета стимулировало участие гражданских ученых. Веб-платформа предназначена для преодоления демографических ограничений путем предоставления многоязычной службы нейронного машинного перевода и предоставления графических и аудиовизуальных протоколов на английском и испанском языках. Это было лишь частично успешным, поскольку было собрано меньше образцов как из Южного залива, так и из Северного округа, где проживает большая часть испаноязычного / латиноамериканского населения округа- 45 человек. В этих районах также зарегистрировано 63% (1 700 случаев на 100 000) от общего числа случаев COVID-19 в округе Сан-Диего с самой высокой распространенностью заболевания46 и уровнем госпитализаций (62%)47,48. Хотя большинство образцов поступило из Центрального округа, репрезентативное число было собрано из районов, наиболее пострадавших от COVID-19, и только небольшая часть образцов была положительной, что говорит о том, что поверхностные резервуары SARS-CoV-2 в городских условиях относительно редки.

Обработка образцов. Мазки для отбора проб смачивали SDS, который инактивировал вирус, нарушая его оболочку, и стабилизировал голую РНК путем развертывания RNases32. Удобно во время сбора моющее средство в тампоне очищало отобранную поверхность. Образцы окружающей среды часто содержат очень малые количества РНК. Чтобы максимизировать восстановление, выделение РНК было выполнено с использованием метода экстракции сырой экстракции на основе GITC без колонн. GITC, сильный хаотропный агент, разрушает водородные связи, которые поддерживают сворачивание белка (т. Е. Гидрофобный эффект). Это действие приводит к инактивации вирусных частиц, и РНК остается стабильной за счет ингибирования RNAses34,35,36. Решение GITC поддерживало стабильность образцов РНК без строгих соображений холодовой цепи, что позволяло гражданам поддерживать образцы при комнатной температуре, если морозильная камера для предоставленных пакетов со льдом была недоступна. Чтобы уменьшить потенциальную опасность, которую этот реагент представляет при прямом контакте с кожей или слизистой оболочкой, граждане были осведомлены об этих рисках путем включения паспорта безопасности материала, предоставленного в комплект, и предупреждающего уплотнения было помещено в коробку, содержащую трубки.

Сырой метод экстракции GITC-хлороформа помог восстановить следы РНК из тампонов, и, как показало усиление шипованных образцов, ингибиторы редко сохранялись в образцах после экстракции. Образцы, которые были отрицательными на SARS-CoV-2 и не показали ингибирования RT-LAMP, представляли собой истинные отрицательные результаты или имели более низкое число копий, чем LOD на 100% частоте. И наоборот, обнаружение вирусной РНК на поверхности напрямую не подразумевает риск передачи через контакт, поскольку необходимо проверить инфекционность вируса из положительных образцов. Оперативный скрининг окружающей среды, не ограничиваемый наличием современных материалов или высококвалифицированного персонала, имеет решающее значение для оценки того, являются ли поверхности вирусным резервуаром, и для более целенаправленных усилий по профилактике и сдерживанию.

RT-LAMP был выбран в качестве наилучшего метода, подходящего для предлагаемого трубопровода обнаружения. Это оказалось быстрым и недорогим методом, который был высокоустойчив к большинству оставшихся ингибиторов и столь же чувствителен и специфичн, как и другие методы RT-qPCR. Из-за их использования в клинических условиях во время пандемии SARS-CoV-2 на доступность наборов RT-qPCR повлиял мировой спрос. Более того, методы RT-qPCR — даже те, которые были разработаны для сопротивления ингибиторам — были чувствительны к веществам, содержащимся в образцах окружающей среды, собранных пилотной когортой гражданских ученых, даже после использования других общих стратегий для снижения конкуренции ингибиторов за связывание ферментов49. Эти результаты подтверждаются недавним исследованием, в котором сравнивались оба метода обнаружения SARS-CoV-2 на образцах мазков из конфет, обработанных пациентами с COVID-19, и было обнаружено более 83% конкордантности результатов, с 25% более низким ингибированием в образцах, проанализированных RT-LAMP15. Кроме того, экстракция сырой нефти GITC-хлороформа в сочетании с RT-LAMP снизила стоимость реагентов и поставок на 42% по сравнению с экстракцией набора РНК и RT-qPCR (Таблица материалов).

Этот метод позволил пролить высокопроизводительный анализ тысяч образцов поверхностного тампона. До 80 пулов, представляющих 640 образцов, были обработаны за 2 дня от экстракции РНК до обнаружения SARS-CoV-2 с помощью RT-LAMP. Предлагаемый протокол является полуквалифициативным, ограничивается обнаружением вирусной РНК, и не указывает на наличие инфекционных вирусных частиц. Необходим дальнейший анализ для оценки риска передачи SARS-CoV-2 от инфицированных фомитов, присутствующих на мазаемых поверхностях.

В этом исследовании представлен протокол для быстрой настройки стратегии тестирования, которая включает в себя эффективный рабочий процесс при столкновении с чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения с инфекционным заболеванием. Предлагаемый протокол отбора проб прост и использует расходные материалы, обычно встречающиеся в домашних хозяйствах, а метод обнаружения вируса осуществляется на оборудовании, доступном в основных лабораторных условиях, таких как водяная баня вместо термоциклера. Затраты на реагенты RT-LAMP значительно ниже, чем те, которые необходимы для RT-qPCR, и менее восприимчивы к сценариям высокого глобального спроса. Это исследование служит основой для оценки экологических вирусных резервуаров в будущих эпидемических вспышках и глобальных пандемиях.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что конкурирующих интересов не существует.

Благодарности

Мы благодарим исследователей Института вирусной информации (VII), доктора Анку М. Сегалл, Уиллоу Сегалл, Патрисию Л. Роуэр, Гэри Роуэра, Кэри Л. Роуэра, Магду Сильвию Пинетту, Элизабет Круз Кано, доктора Грегори Питерса, доктора Стюарта А. Сандина и доктора Дженнифер Смит за то, что они нашли время для сбора многочисленных образцов. Мы также благодарим д-ра Роба Найта, д-ра Джека Гилберта, д-ра Педро Балда-Ферре и д-ра Сару Аллард из отделения педиатрии Медицинского факультета Университета Сан-Диего, Калифорния (UCSD) за содействие положительному контролю и полезную обратную связь. Мы благодарим Стейси Кароту (SDSU College of Sciences) и Джину Спидель (SDSU) за материально-техническую поддержку и Хуана Родригеса за художественное и графическое оформление протокола отбора проб. Мы благодарим всех участников за их приверженность и преданность этому проекту в очень трудные времена. Эта работа была поддержана щедрым пожертвованием от доктора Джо Энн Лейн (Колледж наук SDSU) и гранта Национального научного фонда RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 (номер награды: 2030479).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
SMP, LIMS и работа с сообществом:
Authentication Интерфейс прикладного программированияSign-In
Коммерческая хостинговая платформаGoDaddy
Data Charting Интерфейс прикладного программированияCharts
Программное обеспечение для баз данныхMySQL 
Программное обеспечение для планирования маршрутов доставки CircuitCircuit для команд
Бесплатный почтовый сервисGoogleGoogle Email
Геопространственное приложение Интерфейс программированияприложений GoogleGoogle Maps API Многоязычный
сервис нейронного машинного переводаGoogleGoogle Google Translate
Онлайн-формаGoogleGoogle Form
Операционная системаРазработка
 Программное обеспечение для веб-сервера Big Rose Web Design
Apache 
Sampling kit:
CoolersColeman (Amazon)B00363X3F2Стоимость (US$) за 100 rxn: 70
галлонные пакетыZiploc Solimo (Amazon)B07BJ495GLСтоимость (US$) за 100 rxn: 18
Глицерин (дезинфицирующее средство для рук)FischerScientificG33-4Стоимость (US$) за 100 rxn: 9
пакетов льдаIce-Brix (Amazon)B075GLD3X1Стоимость (US$) за 100 rxn: 110
Isopropanol (дезинфицирующее средство для рук)FischerScientificAA36644K7Стоимость (US$) за 100 rxn: 43
маски KN95Echo-SigmaEcho-SigmaСтоимость (US$) за 100 rxn: 400
Paper for Protocols and Trizol Safety SheetOffice Depot348037Стоимость (US$) за 100 rxn: 36
Флаконы с распылителем объемом 30 мл (SDS и дезинфицирующее средство для рук)Anyumocz (Amazon)B07T64FHXRСтоимость (долл. США) за 100 rxn: 80
РНКазы, ДНКазы, ДНК и Микроцентрифужные пробирки без ингибиторов ПЦРGenesee Scientific22-281Стоимость (в долларах США) за 100 пробирок: 83
Идентификатор образца устойчивые к растворителям этикеткиLABTAGXST-10C1-1WHСтоимость (в долларах США) за 100 проб: 68
подушечек (тампонов) Swiffer WetJet (тампоны)Swiffer (Amazon)B001F0RBT2Стоимость (в доллар B00PBK4NG6 США) за 100 проб: 8
Реагент тризол (раствор изотиоцианата гуанидиния - GITC), не LSInvitrogen15596018Стоимость (US$) за 100 rxn: 40
коробок с трубкамиGenesee Scientific21-119Стоимость (US$) за 100 rxn: 180
маленьких пакетиков Ziploc(Amazon)B01LRKEI9KСтоимость (US$) за 100 rxn: 8
Настольный термотрансферный принтер Zebra ZebraGK420t
Общая стоимость набора для отбора проб (US$) за 100 rxn: 1,160
Trizol РНК экстракция:
Ammonium-acetate RNase-freeInvitrogenAM9070GСтоимость (US$) за 100 rxn: 2
ChloroformFisherScientificC298-500Стоимость (US$) за 100 rxn: 2
GlycoBlue (гликоген 15 мг/мл)InvitrogenAM9515Стоимость (в долларах США) за 100 rxn: 80
Абсолютный молекулярный (200 proof) этанолFisherBP2818500Стоимость (US$) за 100 rxn: 30
Изопропанол молекулярного качестваFisherScientificBP2618500Стоимость (US$) за 100 rxn: 3
TURBO DNA-free Kit InvitrogenAM1907Стоимость (в долларах США) за 100 rxn: 110
<сильно>мультиплексированная колориметрическая RT-LAMP:
гуанидина гидрохлоридAlfa AesarAAJ6548522Стоимость (US$) за 100 rxn: 1
RT-LAMP E1-PrimersIDTн/дСтоимость (US$) за 100 rxn: 7
RT-LAMP N2-PrimersIDTн/дСтоимость (US$) за 100 rxn: 7
Синтетическая SARS-CoV-2 РНКATCCVR-3276SDСтоимость (в долларах США) за 100 rxn: 14
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix с UDGNEBM1800SСтоимость (в долларах США) за 100 rxn: 210
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal CyclerEppendorf950030010
Общая экстракция РНК тризола + LAMP Стоимость (US$) за 100 rxn: 470
Kit для экстракции РНК:
QIAamp DSP Viral RNA Mini KitQiagen61904Стоимость (доллары США) за 100 rxn: 570
RT-qPCR:
Synthetic SARS-CoV-2 RNAATCCVR-3276SDСтоимость (US$) за 100 rxn: 14
TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixApplied Biosystems4444432Стоимость (долл. США) за 100 rxn: 180
праймеров и зондов SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2IDT10006713стоимость (долл. США) за 100 rxn: 20
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMixQuantabio95132-100
QuantiNova Pathogen Qiagen208652
зонд QuantiNovaQiagen208352
UltraPlex 1-Step ToughMix Quantabio95166-100
CFX96 Сенсорная система обнаружения ПЦР в реальном времени BioRad1855196
Набор для выделения РНК + RT-qPCR Стоимость (US$) за 100 rxn: 790 
RT-PCR:
SuperScript IV One-Step RT-PCR Invitrogen12594025
Lab cleanup:
DNAZapInvitrogenAM9890
RNAZapInvitrogenAM9780
Google Google веб-сайтов и баз данных в Linux Scientific

Ссылки

  1. Alsved, M., et al. Exhaled respiratory particles during singing and talking. Aerosol Science and Technology. 54 (11), 1245-1248 (2020).
  2. Morawska, L., Cao, J. Airborne transmission of SARS-CoV-2: The world should face the reality. Environment International. 139, 105730(2020).
  3. Stadnytskyi, V., Bax, C. E., Bax, A., Anfinrud, P. The airborne lifetime of small speech droplets and their potential importance in SARS-CoV-2 transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (22), 11875-11877 (2020).
  4. Yu, I. T. S., et al. Evidence of Airborne Transmission of the Severe Acute Respiratory Syndrome Virus. New England Journal of Medicine. 350 (17), 1731-1739 (2004).
  5. Coronavirus disease (COVID-19): How is it transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/question-and-answers-hub/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2020).
  6. How COVID-19 Spreads. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/how-covid-spreads.html (2020).
  7. Moriarty, L. F., et al. Public Health Responses to COVID-19 Outbreaks on Cruise Ships - Worldwide, February-March 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (12), 347-352 (2020).
  8. Cheng, V. C. -C., et al. Air and environmental sampling for SARS-CoV-2 around hospitalized patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19). Infection Control and Hospital Epidemiology. , 1-8 (2020).
  9. Van Doremalen, N., et al. Aerosol and surface stability of SARS-CoV-2 as compared with SARS-CoV-1. New England Journal of Medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  10. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582, 557-560 (2020).
  11. Butler, D. J., et al. Shotgun transcriptome and isothermal profiling of SARS-CoV-2 infection reveals unique host responses, viral diversification, and drug interactions. bioRxiv. , (2020).
  12. Döhla, M., et al. SARS-CoV-2 in environmental samples of quarantined households. medRxiv. , (2020).
  13. Ikonen, N., et al. Deposition of respiratory virus pathogens on frequently touched surfaces at airports. BMC Infectious Diseases. 18, 437(2018).
  14. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800(2020).
  15. Salido, R. A., et al. Handwashing and detergent treatment greatly reduce SARS-CoV-2 viral load on Halloween candy handled by COVID-19 patients. mSystems. 5, 01074(2020).
  16. Chan, J. F. W., et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), 00310-00320 (2020).
  17. Dao Thi, V. L., et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  18. Rauch, J., et al. A scalable, easy-to-deploy, protocol for Cas13-based detection of SARS-CoV-2 genetic material. bioRxiv. , (2020).
  19. Zhang, F., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. , Available from: https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/COVID-119%20detection%20(updated).pdf (2020).
  20. Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
  21. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-185 (2020).
  22. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology. 38, 870-874 (2020).
  23. Lucia, C., Federico, P. -B., Alejandra, G. C. An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12. bioRxiv. , (2020).
  24. Danko, D., et al. Global genetic cartography of urban metagenomes and anti-microbial resistance. bioRxiv. , (2020).
  25. Parida, M., et al. Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2895-2903 (2005).
  26. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research. 28 (12), 63(2000).
  27. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  28. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-186 (2020).
  29. Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. BioTechniques. 58 (2), 59-68 (2015).
  30. Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Journal of Virological Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
  31. OAuth 2.0. Internet Engineering Task Force (IETF. , Available from: https://oauth.net/2/ (2012).
  32. Naidu, K. T., Prabhu, N. P. Protein-surfactant interaction: Sodium dodecyl sulfate-induced unfolding of ribonuclease A. Journal of Physical Chemistry B. 115 (49), 14760-14767 (2011).
  33. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  34. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  35. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-472 (2007).
  36. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  37. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Ethanol precipitation of RNA and the use of carriers. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  38. Wallace, D. M. Precipitation of nucleic acids. Methods in Enzymology. 152, 41-48 (1987).
  39. COVID-19 Dashboard. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/96feda77f12f46638b984fcb1d17bd24 (2020).
  40. CDC 2019-novel Coronavirus (2019-nCoV) real-time RT-PCR diagnostic panel. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.fda.gov/media/134922/download (2020).
  41. Corman, V. M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 25 (3), 2000045(2020).
  42. Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nature Genetics. 19, 225-232 (1998).
  43. Johne, R., Müller, H., Rector, A., van Ranst, M., Stevens, H. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase. Trends in Microbiology. 17 (5), 205-211 (2009).
  44. Wang, B., et al. Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle amplification. Journal of Clinical Microbiology. 43 (5), 2339-2344 (2005).
  45. Population of Mexican origin in San Diego County. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/CHS/ENGLISH VERSION_Mexican Origin.pdf (2020).
  46. COVID-19 city of residence MAP. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/Epidemiology/COVID-19 City of Residence_MAP.pdf (2020).
  47. COVID-19 hospitalizations summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/ Epidemiology/COVID-19 Hospitalizations Summary_ALL.pdf (2020).
  48. COVID-19 race and ethnicity Summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/ phs/Epidemiology/COVID-19 Race and Ethnicity Summary.pdf (2020).
  49. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SARS CoV 2RT LAMP

Похожие статьи