В данной работе мы представляем и оцениваем протокол создания недорогих нанопроточных жидкостных хроматографических колонок с обращенной фазой для определения характеристик пептидов с использованием протеомных рабочих процессов ЖХ-МС/МС.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
* These authors contributed equally
В данной работе мы представляем и оцениваем протокол создания недорогих нанопроточных жидкостных хроматографических колонок с обращенной фазой для определения характеристик пептидов с использованием протеомных рабочих процессов ЖХ-МС/МС.
Высокая сложность, преобладающая в биологических образцах, требует эффективного анализа хроматографической сепарации с высокой чувствительностью и разрешением. В данной работе мы представляем надежный, воспроизводимый и недорогой протокол для подготовки высокопроизводительных колонок для жидкостной хроматографии (RP-ВЭЖХ) с нанопотоком и обратной фазой для разделения аналитических пептидов в режиме реального времени перед введением и детектированием с помощью масс-спектрометра в традиционных рабочих процессах протеомики снизу вверх. В зависимости от цели эксперимента и химических свойств разделяемых аналитов оптимальные параметры колонки могут различаться по их внутреннему или внешнему диаметру, длине, размеру частиц, размеру пор, химическому составу частиц в неподвижной фазе, а также наличию или отсутствию встроенного излучателя электрораспыления на наконечнике. Собственная система упаковки колонн не только позволяет быстро изготавливать колонны с желаемыми свойствами, но и значительно снижает стоимость процесса. Рассмотренный здесь оптимизированный протокол упаковки колонки C18 AQ (водный) из плавленого диоксида кремния совместим с широким спектром жидкостных хроматографических приборов для достижения эффективного разделения аналитов.
Колонки для ВЭЖХ внесли огромный вклад в производительность в области фармацевтических, медицинских и экологических исследований 1,2,3,4. Доступ к высококачественным хроматографическим колонкам является ключевым шагом в фракционировании сложных аналитов. В протеомике дробовика высокая аналитическая чувствительность обычно достигается путем сопряжения масс-спектрометрии (МС) электролучевой ионизации (ESI) с нанопроточной хроматографией 5,6,7,8.<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
1. Подготовка кончика капилляра
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Для оценки производительности колонок 750 нг дигестов триптических пептидов, приготовленных из цельных клеточных лизатов клеток HEK293, были фракционированы в режиме онлайн с использованием капилляра из плавленого диоксида кремния длиной 25 см и внутренним диаметром 75 мкм, упакованного внутри компании с объемными частицами ReproSil-Pur 120 C18-AQ, как описано в протоколе. Перед загрузкой образца колонку промывали с использованием 6 мкл смеси ацетонитрила, изопропанола и H2O в соотношении 6:2:2 и предварительн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Современные протеомные стратегии основаны на высококачественном хроматографическом разделении для эффективного анализа сложных биологических систем. Таким образом, высокопроизводительные и экономичные нанопроточные колонки LC являются важнейшими компонентами успешного тандемного режима масс-спектрометрии, направленного на определение характеристик тысяч белков в одном рабочем процессе.
В этом исследовании мы оценили производительность и надежность ряда колонок.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения GM089778 J.A.W.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 99,99% Формамидная кислота | Сигма-Олдрич | для изготовления фрит-спиртовой | |
| лампы | Любая марка | Для обеспечения тепла | |
| Гелиевая ячейка Брехбюлера | БиоИзбыток | для уплотнительной колонны | |
| Керамическая колонна Резак | любой марки | для резки диметилсульфоксида кремния | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) > 99% | Sigma-Aldrich | Хранится в легковоспламеняющемся шкафу | |
| Formamide & ge; 99,5% | Sigma-Aldrich | для приготовления фритты | |
| Фтористоводородная кислота (HF) (50%) | Fisher Scientific | для открытия эмиттера после полимеризации | |
| KASIL (раствор силиката калия) | PQ Corporation | для изготовления фритты | |
| Orbitrap Fusion Lumos | Thermo Fisher Scientific | для сбора данных | |
| MS P2000 Laser Puller | Sutter | для вытягивания капилляра | |
| PTFE 1/16" Наконечник 0,4 мм ID (длинный) для трубного фитинга | Chromre | 214104 | Для установки бомбы |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1,9 мкм, 1г | Dr. Masch GmbH | r119.aq.0001 | Batch 5910 |
| Пайка | любой марки | Для инициирования полимеризации | |
| Фитинг для труб из нержавеющей стали, шестигранная муфта, 1/4 дюйма. Внутренняя NPT | Swagelok | SS-4-HCG | для установки бомб |
| TSP075375 плавленым диоксидом кремния, 75 и микро; m ID x 360 & микро; OD | MOLEX/Polymicro | 1068150019 | Для колонных трубок |
| Ultimate 3000 UHPLC | Dionex | типа ВЭЖХ |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно