Методическая статья

Анализ HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификация HLA-DR-ограниченных CD4 Т-клеточных эпитопов на основе пептидной матрицы

DOI:

10.3791/62387

⸱

20 октября 2021 г.

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основываясь на пептидной матрице, полученной из вируса гепатита В (HBV), HBV-специфические CD4 Т-клеточные ответы могут быть оценены параллельно с идентификацией HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD4 Т-клетки играют важную роль в патогенезе хронического гепатита В. Как универсальная клеточная популяция, CD4 Т-клетки были классифицированы как отдельные функциональные подмножества на основе цитокинов, которые они секретировали: например, IFN-γ для CD4 T-хелперных клеток 1, IL-4 и IL-13 для CD4 T-хелперных клеток 2, IL-21 для CD4 T фолликулярных хелперных клеток и IL-17 для CD4 T хелперов 17 клеток. Анализ специфических CD4 Т-клеток вируса гепатита В (HBV) на основе секреции цитокинов после стимуляции пептидов, полученных из HBV, может предоставить информацию не только о величине HBV-специфического ответа CD4 T-клеток, но и о функциональных подмножествах HBV-специфических CD4 Т-клеток. Новые подходы, такие как транскриптомика и метаболомический анализ, могут предоставить более подробную функциональную информацию о HBV-специфических CD4 Т-клетках. Эти подходы обычно требуют выделения жизнеспособных HBV-специфических CD4 Т-клеток на основе пептидно-основных мультимеров гистосовместимости комплекса II, в то время как в настоящее время информация об HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопах ограничена. На основе пептидной матрицы, полученной из HBV, был разработан метод для оценки HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификации HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов одновременно с использованием образцов мононуклеарных клеток периферической крови у пациентов с хронической инфекцией HBV.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время существует 3 основных подхода к анализу антиген-специфических Т-клеток. Первый подход основан на взаимодействии между Т-клеточным рецептором и пептидом (эпитопом). Антиген-специфические Т-клетки могут быть непосредственно окрашены мультимерами пептидно-большого комплекса гистосовместимости (MHC). Преимущество этого метода заключается в том, что он может получить жизнеспособные антиген-специфические Т-клетки, подходящие для последующего анализа транскриптомики / метаболомики. Ограничение этого метода заключается в том, что он не может предоставить информацию о реакции всей Т-клетки на специфический антиген, поскольку он требует проверенных эпитопных пептидов, в то время как количество идентифицированных эпитопов для конкретного антигена на данный момент ограничено. По сравнению с cd8-клеточными эпитопами CD8,специфичными для вируса гепатита В (HBV), было идентифицировано меньше HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов1,2,что сделало этот метод менее применимым для анализа HBV-специфических CD4 Т-клеток в настоящее время.

Второй подход основан на апрегуляции серии индуцированных активацией маркеров после стимуляции антигеннымпептидом 3. Обычно используемые маркеры включают CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Этот метод в настоящее время используется для анализа антиген-специфических Т-клеточных ответов у вакцинированных лиц5,6,пациентов с вирусной инфекцией иммунодефицита человека7и тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 с инфекцией8,9. В отличие от мультимерного анализа на основе пептида-MHC, этот метод не ограничен валидируемыми эпитопами и может получить жизнеспособные клетки для последующего анализа. Ограничением этого метода является то, что он не может предоставить информацию о цитокиновом профиле антиген-специфических Т-клеток. Кроме того, экспрессия этих маркеров, индуцированных активацией, некоторыми активированными антиген-неспецифическими клетками может способствовать фоновым сигналам в анализе, что может быть проблемой, особенно когда целевые антиген-специфические Т-клетки редки. В настоящее время применение этого метода на HBV-специфических CD4 Т-клетках4ограничено. Может ли этот метод быть использован для надежного анализа HBV-специфических CD4 Т-клеток, требует дальнейшего изучения.

Третий подход основан на секреции цитокинов после стимуляции антигенным пептидом. Как и анализ на основе маркеров, индуцированный активацией, этот метод не ограничен валидированными эпитопами. Этот метод может непосредственно выявить цитокиновый профиль антиген-специфических Т-клеток. Чувствительность этого метода ниже, чем метода, индуцированного активацией маркера, поскольку он опирается на секрецию цитокинов антиген-специфических Т-клеток, а количество тестируемых цитокинов обычно ограничено. В настоящее время этот метод широко используется при анализе HBV-специфических Т-клеток. Поскольку цитокины, секретируемые HBV-специфическими Т-клетками, вряд ли могут быть обнаружены путем прямой пептидной стимуляции ex vivo10,11,цитокиновый профиль HBV-специфических Т-клеток обычно анализируется после 10-дневного ин-витида in vitro, стимулированного расширением12,13,14,15,16. Расположение пептидных пулов в матричной форме было использовано для облегчения идентификации антиген-специфических эпитопов17,18. С комбинацией пептидной матрицы и анализа цитокиновой секреции был разработан метод оценки HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификации HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов одновременно16. В этом протоколе подробно описаны данные метода. Основной антиген HBV выбран в качестве примера демонстрации в этом протоколе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Письменное информированное согласие было получено от каждого пациента, включенного в исследование. Протокол исследования соответствует этическим принципам Хельсинкской декларации 1975 года, что отражено в априорном одобрении комитетом по медицинской этике Юго-Западной больницы.

1. Проектирование пептидной матрицы, полученной из HBV

  1. Загрузите аминокислотные последовательности основного антигена HBV из баз данных NCBI (GenBank: AFY98989.1).
  2. Приобретите пептиды, полученные из основного антигена HBV (панель из 35 15-мерных пептидов, перекрывающихся 10 остатками, чистота > 90%, 4 мг / пептид) у поставщика услуг по синтезу пептидов.
  3. Установите квадратную пептидную матрицу 6×6 с каждым положением в матрице, содержащей только 1 пептид. Имеется 12 пептидных пулов: 6 рядных пептидных бассейнов и 6 колонных пептидных бассейнов, по 5-6 пептидов в каждомпуле по 16. Рядные пептидные пулы и колонные пептидные пулы в матрице представляют собой 2 отдельных образования основного антигена HBV.
  4. Для 3/4 приобретенных пептидов смешайте пептиды в одном ряду/столбце матрицы в 12 отдельных пулов пептидов, растворив их вместе в диметилсульфоксиде (ДМСО) (2 мкг/мкл для каждого пептида). Хранить при -80 °C для анализа HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций.
  5. Остальные пептиды растворяют отдельно (10 мкг/мкл) и хранят при -80 °C для идентификации эпитопа.

2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПБМК)

  1. Забор 5 мл венозной крови у пациентов с хронической инфекцией HBV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем крови должен быть приблизительно оценен в соответствии с количеством пептидных пулов плюс 1 фоновый контроль и 1 положительный контроль. Для анализа 1 пептидного пула необходимо 3 х 105 МПК. В среднем, 1 х10 6 PBMCs могут быть получены из 1 мл крови.
  2. Изолируйте НБМК из крови с помощью центрифугирования градиента плотности Фиколла (800 × г, 20 мин) и криоконсервируйте изолированные МПК в жидком азоте для последующего использования.
  3. Используйте пипетку Пастера для сбора гранулоцитов между прозрачным слоем Фиколла и слоем эритроцитов. Извлеките геномную ДНК из гранулоцитов с помощью набора для очистки геномной ДНК в соответствии с протоколом производителя.
  4. Отправьте образец ДНК поставщикам услуг генотипирования для определения генотипа HLA-DRB1.

3. Расширение PBMC in vitro с использованием пептидной матрицы HBV

  1. Оттаивать НБМК.
    1. Теплый RPMI 1640 дополнен 1:10 000 бензоназой (25 Ед/мл) до 37 °C на водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бензоназа помогает ограничить слипание клеток во время оттаивания. Для каждого образца потребуется 20 мл RPMI 1640 с бензоназой. Рассчитайте количество, необходимое для размораживания всех образцов, и подготовьте отдельную аликвоту среды (37 °C) с 1:10 000 бензоназой (25 Ед/мл). Размораживать не более 5 образцов за один раз.
    2. Извлеките образцы из жидкого азота и быстро разморозите замороженные флаконы на водяной бане (37 °C).
    3. Перенесите размороженный клеточный суспензию в центрифужную трубку 15 мл. Добавьте 1 мл бензоназы RPMI 1640 (37 °C) по каплям в пробирку. Медленно добавьте 6 мл бензоназы RPMI 1640 (37 °C) в трубку центрифуги, промыть криовиал еще 2 мл бензоназы RPMI 1640 (37 °C), чтобы извлечь все клетки. Продолжайте работу с остальными образцами как можно быстрее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медленное разбавление криоконсервированных образцов является ключом к поддержанию жизнеспособности размороженных клеток.
    4. Центрифуга (400 × г, 10 мин), удалите супернатант и ослабьте гранулу, постукивая по трубке.
    5. Аккуратно повторно суспендируйте гранулы в 1 мл теплой бензоназы RPMI 1640. Осторожно перемешайте и фильтруйте клетки через 70-мкм клеточный сетчатый фильтр, если это необходимо (т. Е. Если есть какой-либо видимый сгусток).
    6. Aliquot 10 мкл суспензии и разбавить в фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS), добавить трипан синий (0,04%), загрузить на гемоцитометр, подождать 1 мин и подсчитать количество жизнеспособных клеток (прозрачных клеток).
    7. Добавьте 9 мл бензоназы RPMI 1640 (37 °C) в трубку, центрифугу (400 × г, 10 мин), удалите супернатант и ослабьте гранулу, постукивая по трубке.
  2. Повторное суспендирование PBMCs в RPMI 1640 с добавлением 25 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% сыворотки AB человека (полная культуральная среда). Отрегулируйте плотность ячеек до 1,5 x 106 ячеек/мл. Плитные НБМК в 96-скважинных плитах (с плоским дном) при плотности 3 х 105 ячеек/скважина.
  3. Добавьте пулы пептидов, полученных из HBV (2 мкг/мл на каждый отдельный пептид) в каждую скважину. Для скважин фонового контроля и положительного контроля добавляют одинаковое количество растворителя (ДМСО, 1 мкл/мл). Добавить 10 ЕД/мл ИЛ-2 и 10 нг/мл Ил-7. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2.
  4. На 3-й день добавляйте культуральная среда 50 Ед/мл ИЛ-2 и 10 нг/мл ИЛ-7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение дня с 1 по 3 день не будет наблюдаться явной пролиферации Т-клеток. Общее количество клеток обычно уменьшается на 1/3-1/2 из-за гибели не-Т-клеток, таких как В-клетки, NK-клетки, NKT-клетки и моноциты.
  5. На 7-й день заменить половину культуральной среды свежей средой, содержащей пептиды (4 мкг/мл), IL-2 (100 Ед/мл) и IL-7 (20 нг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы не потревожить клетки внизу, пипетку около 90 мкл питательной среды осторожно от верхней части среды. В течение 3-7 дня будет наблюдаться устойчивая пролиферация Т-клеток, и пролиферация Т-клеток обычно агрегируется, образуя кластеры.
  6. На 10-й день осторожно пипетку культивируют клеточную культуру в каждой скважине 7-9 раз, чтобы дезагрегировать кластеры клеток, подсчитать количество жизнеспособных клеток и перенести 2×105 клеток в каждой скважине на пластину из 96 скважин (круглое дно) для hbV-специфического анализа ответа CD4 Т-клеток.
  7. Продолжить культивирование остальных клеток для идентификации эпитопа на 12-й день, скорректировать объем питательной среды до 100 мкл (выбросив избыточную среду) и дополнить культуру 100 мкл свежей полной культуральной среды, содержащей пептиды (4 мкг/мл), IL-2 (100 Ед/мл) и IL-7 (20 нг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение дня с 7 по 10 день Т-клетки продолжают энергично размножаться. Замените питательную среду, как по состоянию на шаге 3.5, если среда желтеет. В целом, номер ячейки превысит 6×105 на 10 день. Каждая скважина обычно показывает одинаковое количество ячеек, подсчитывает номер ячейки в 3 скважинах и использует среднее значение в качестве оценки номера ячейки для всех скважин.

4. Анализ HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций внутриклеточной проточной цитометрией

  1. Стимуляция НБМК с помощью пептидных пулов
    1. Для клеток, перенесенных на плиту 96 скважин (круглое дно), промыть 3 раза в пластине (550 × г, 3 мин). Используйте 200 мкл среды для каждой стирки (RPMI 1640 для первых 2 промывок, полная питательная среда для последней промывки). Выбросьте супернатанты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление остаточных цитокинов в культуре путем повторной промывки может эффективно снизить фон при внутриклеточном проточном цитометрии.
    2. Для каждой скважины клеток, стимулируемых определенным пептидным пулом, добавляют 200 мкл полной питательной среды, дополненной теми же пулами пептидов (2 мкг/мл для каждого отдельного пептида). Для фонового контроля добавьте полную питательную среду, дополненную 1 мкл/мл ДМСО. Для хорошего контроля добавляют полную культурально-среду, дополненную 1 мкл/мл ДМСО, 150 нг/мл форбола 12-миристата 13-ацетата (ПМА) и 1 мкмоль/л иономицина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая доза ДМСО блокирует секрецию цитокинов Т-клеток (наиболее значимая для TNF-α). Доза ДМСО выше 5 мкл/мл не рекомендуется. Как правило, доза ДМСО в нашем эксперименте не превышает 1 мкл/мл.
    3. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 6 ч.
    4. После 1 ч инкубации добавляют в культуру Моненсин (1,37 мкг/мл).
  2. Проточная цитометрия
    1. Через 6 ч инкубации. Удалите супернатант после центрифугирования (550 × г, 3 мин), промыть ячейки один раз 200 мкл DPBS (550 × г, 3 мин), маркерами поверхности пятна (CD3, CD4 и CD8) и маркером жизнеспособности (с использованием fixable Viability Dye) в холодильнике с температурой 4 °C в течение 30 минут.
    2. Промыть однократно 200 мкл DPBS (550 × г, 3 мин). Фиксируют и проникают клетки, окрашивают внутриклеточные цитокины (TNF-α и IFN-γ) в холодильнике с 4 °C в течение 45 мин.
    3. После окончательной промывки во внутриклеточном окрашивание повторно суспендирует клетки в 150 мкл буфера проточной цитометрии (DPBS + 0,5% BSA).
    4. Получение данных проточной цитометрии на проточном цитометре.
  3. Анализ результатов проточной цитометрии
    1. Определение положительного ямки: считать скважину положительной, если она имеет частоту цитокинов, секретировывающих Т-клетки не менее чем в два раза от фоновой контрольной скважины(рисунок 1).
    2. Согласно следующей формуле, рассчитайте частоту ответа для каждого анализируемого цитокина(рисунок 2):
      figure-protocol-1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пул пептидов ряда и пулы пептидов столбцов в матрице представляют собой 2 различных образования основного антигена HBV, поэтому конечная скорость ответа должна быть разделена на 2.

5. Идентификация HBV-специфических HLA-DR ограниченных CD4 Т-клеточных эпитопов

  1. Оттаивать и поддерживать аллогенные линии В-лимфобластоидных клеток (БЛКЛ) в колбе Т-75 (5-20 ×106 клеток, 20 мл полной питательной среды).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гарантировать хорошее состояние БЛКЛ, этот этап должен быть начат за 2 недели до размораживания PBMC пациентов. LCL должны быть гомозиготными в аллеле HLA-DRB1. Согласно результату генотипирования, пациенты должны иметь тот же аллель HLA-DRB1, что и LCL.
  2. Скрининг пептидов-кандидатов для идентификации (Рисунок 3)
    1. Согласно результатам скорости ответа Т-клеток на 10-й день, отсейте 2 пула пептидов с самой высокой скоростью ответа (1-рядный пептидный пул и 1-колонный пул пептидов).
    2. Установите пептид в эти 2 пула в качестве пептида-кандидата, если другой пул пептидов, содержащий этот пептид, также показывает положительный результат в анализе ответа Т-клеток. Используйте НБМК, расширенные с другим пулом пептидов, для идентификации эпитопов позже.
  3. Пульсирующая БЛКГ с пептидом
    1. На 12-й день подсчитывают количество жизнеспособных БЛКЛ, переносят клетки в 15 мл центрифужных трубок, центрифугу (350 × г, 10 мин) и удаляют супернатант. Повторно суспендировать клеточную гранулу в полной культуральной среде и аликвотные LCL на 96-скважинную пластину (круглое дно) при 4×104 клетках/скважине в 80 мкл полной культуральной среде.
    2. Добавляют один пептид (10 мкг/мл), инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение 2 ч. Набор 2 фоновых контроля: пульсация пептида с блокировкой HLA-DR (предварительная обработка анти-HLA-DR (10 мкг/мл) в течение 1 ч); ДМСО (1 мкл/мл) пульсирует. Конечный объем полной питательной среды в каждой скважине составляет 100 мкл.
    3. Добавляют митомицин С (100 мкг/мл), инкубируют при 37 °C и 5%CO2 в течение 1 ч.
    4. Промыть 3 раза по 200 мкл RPMI 1640 (550 × г, 3 мин) в пластине для удаления непопульсного пептида и митомицина С. Для первой промывки дополнив инкубационную культуру 100 мкл RPMI 1640.
    5. Повторное суспендирование клеток в 120 мкл полной питательной среды.
  4. Стимуляция МПК с помощью пептидных импульсных БЛКЛ.
    1. На 12-й день перенесите НБМК на плиту из 96 скважин (круглое дно).
    2. Удаляют супернатант после центрифугирования (550 × г, 3 мин) в пластине, дважды промывая 200 мкл RPMI 1640 (550 × г, 3 мин) в тарелке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление остаточных цитокинов и пептидов в культуре путем повторной промывки является ключевым этапом для снижения фона при внутриклеточном проточном цитометрии. Особенно для остаточных пептидов он будет связываться с LCL и значительно увеличивать фон.
    3. Повторное суспендование НБМК в каждой скважине с 210 мкл полной питательной среды.
    4. Для скважины НБМК, выбранной для идентификации эпитопов, смешайте аликвоту (по 70 мкл каждая) с пептидными импульсными БЛКЛ (3 скважины, включая 2 фоновых контрольных).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На 12-й день количество пептидных пулов расширенных МПК обычно достигает более 5-7×105 на скважину, поэтому соотношение НБМК/БЛК составляет около 6/1 к 4/1.
    5. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 6 ч.
    6. После 1 ч инкубации добавляют в культуру Моненсин (1,37 мкг/мл). Конечный объем полной питательной среды в каждой скважине составляет 200 мкл.
  5. Проточная цитометрия
    1. Повторите те же операции, что и на шаге 4.2.
  6. Анализ результатов проточной цитометрии
    1. Проверить пептид как HLA-DR ограниченный CD4 Т-клетки эпитопа, если PBMCs, инкубированные с этим пептидом импульсными LCL, показывают частоту цитокинов, секретирующих CD4 Т-клетки, по крайней мере, в два раза превышающую частоту PBMCs, инкубированных с фоновыми контрольными элементами (пептид пульсирует с предварительной блокировкой HLA-DR; DMSO пульсирующая)(Рисунок 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Частота цитокинов, секретировывающих CD4 Т-клеток, рассчитывается как сумма как одиночных продуцентов, так и двойных продуцентов. Как показано на рисунке 1,частота TNF-α секретирования CD4 Т-клеток и частота IFN-γ секретирования CD4 Т-клеток в фоновом контроле (DMSO) составляют 0,154% и 0,013% соответственно. Частота TNF-α секретирования CD4 Т-клеток и частота IFN-γ секретирования CD4 Т-клеток, специфичных для пула пептидов Core11, составляют 0,206 и 0,017 соответственно, поэтому как TNF-α с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее важные шаги в этом протоколе перечислены следующим образом: 1) достаточное количество НБК высокой жизнеспособности для начала расширения НБК; 2) подходящая среда для расширения НБМК; и 3) полное удаление остаточных пептидных пулов в культуре PBMCs до идентификации эпитопа.

Весь анализ в этом протоколе зависит от надежной пролиферации CD4 Т-клеток. В целом, количество НБМК после 10-дневного расширения будет в 2-3 раза больше начального числа. Количество ячеек и жизнеспособность PBMC яв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81930061), Фондом естественных наук Чунцина (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) и Китайским ключом.
Специализированный проект по инфекционным заболеваниям (2018ZX10723203).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Альбумин крупного рогатого скота V (BSA)BeyotimeST023
APC-конъюгированный античеловеческий TNF-αeBioscience17-7349-82Хранить в защищенном от света
бензоназной нуклеазеSigma-AldrichE1014Ограничьте скопление
клеток B-лимфобластоидных клеточных линий (BLCL)ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ФРЕДА ХАТЧИНСОНАIHW09126 HLA-DRB1*0803 гомозиготы
B лимфобластоидных клеточных линий (BLCL)ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ФРЕДА ХАТЧИНСОНАHLA-DRB1*1202 гомозиготы
Колба для клеточных культур (T75)ПластинаCorning 430641
(96 лунок, плоское дно)ПлоскаяCorning3599
(96 лунок, круглое дно)Corning3799круглым дном
CLS431751размер пор 70  μ m, белая, стерильная
центрифужная пробирка (15 мл)СтерильнаяKIRGENKG2611
(50 мл)Стерильная
центрифуга Corning 430829, охлаждаемаяEppendorf5804R
ThermoST16R
, охлаждаемая ThermoLegend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Набор буферных буферов транскрипционного фактора)BD Biosciences562574Готовьте раствор перед применением
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2650Хранить при комнатной температуре для предотвращения кристаллизации
Dulbecco' s Фосфатно-солевойбуферный препарат ddH2O (1000 мл), содержащий NaCl (8000 мг), KCl (200 мг), KH2PO4 (200 мг) и Na2HPO4.7H2O (2160  мг). Установите PH на 7,4. Стерилизовать через автоклав.
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-03
(0,5-10)СтерильныеKirgenKG5131
(100-1000)СтерильныеKirgenKG5333
(1-200)KirgenKG5233Стерильный
FITC-конъюгированный античеловеческий CD4BioLegend300506Хранить в защищенном от света
Поправимая жизнеспособность Краситель eFluor780eBioscience65-0865-14Хранить защищенным от света
Ингибитор транспорта белка GolgiStop (содержащий монензин)BD Biosciences554724Ингибитор транспорта белка
Гемоцитометрмарки718620
HBV Core Antigen Derived PeptidesChinaPeptides
HEPESGibco15630080100 мл
Сыворотка крови человека ABGemini Bio-Products100-51100 мл
ИономицинSigma-AldrichI0634
KClSangon BiotechA100395-0500
KH2PO4Sangon BiotechA100781-0500
LSRFortessa Проточный цитометрBD
L-глутаминGibco25030081
Микроцентрифужная пробирка 100 мл (1,5 мл)CorningMCT-150-CАвтоклавная стерилизация перед использованием
Шейкеры для микропланшетовScientific IndustriesMicroPlate Genie
Mitomycin CRoche10107409001
Na2HPO4.7H2OSangon BiotechA100348-0500
NaClSangon BiotechA100241-0500
ПЦР-пробирки (0,2 мл)KirgenKG2331
PE/Cy7-конъюгированный Античеловеческий CD8BioLegend300914Хранить защищенный от света
ПЭ-конъюгированный Античеловеческий ИФН-&гамма;eBioscience12-7319-42Хранить в защищенном от света
Пенициллин стрептомицинGibco15140122100 мл
PerCP-Cy5.5-конъюгированный Античеловеческий CD3eBioscience45-0037-42Хранить в защищенном от света
Phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA)Sigma-AldrichP1585
Рекомбинантный человеческий IL-2PeproTech200-02
Рекомбинантный человеческий IL-7PeproTech200-07
RPMI Medium 1640GibcoC11875500BT500 мл
пирувата натрия, 100mMGibco15360070
трипановым синим красителем (0.4%)Gibco15250-061
Ultra-LEAF Очищенный античеловеческий HLA-DRBioLegend307648
Wizard Genomic DNA Набор для очисткиPromegaA1125
IHW09121 для клеточных культур пластина для культивирования клеток Сетчатое фильтр для клеток с центрифужная пробирка центрифуга , охлаждаемая центрифуга Фильтрующие наконечники фильтрующие наконечники фильтрующие наконечники

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998(2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD4HBVHLA DRFicollB

Похожие статьи