Использование липидных наночастиц для доставки химически модифицированной мРНК в клетки млекопитающих

Краткое содержание

Протокол представляет транскрипцию in vitro (IVT) химически модифицированной мРНК, катионный липосомный препарат и функциональный анализ трансфекций мРНК с липосомами в клетках млекопитающих.

Аннотация

В последние годы химически модифицированная матричная РНК (мРНК) превратилась в мощную молекулу нуклеиновой кислоты для разработки широкого спектра терапевтических применений, включая новый класс вакцин, белково-заместительную терапию и иммунную терапию. Среди векторов доставки липидные наночастицы оказались более безопасными и эффективными в доставке молекул РНК (например, миРНК, микроРНК, мРНК), и некоторые продукты уже используются в клинической практике. Для демонстрации доставки мРНК, опосредованной липидными наночастицами, мы представляем оптимизированный протокол синтеза функциональной мРНК me1Ψ-UTP модифицированной eGFP, получения катионных липосом, электростатического образования комплекса мРНК с катионными липосомами и оценки эффективности трансфекции в клетках млекопитающих. Результаты показывают, что эти модификации эффективно улучшают стабильность мРНК при доставке катионных липосом, а также повышают эффективность трансляции мРНК eGFP и стабильность в клетках млекопитающих. Этот протокол может быть использован для синтеза желаемой мРНК и трансфекта катионными липосомами для экспрессии генов-мишеней в клетках млекопитающих.

Введение

Как терапевтическая молекула, мРНК имеет ряд преимуществ благодаря своей неинтегративной природе и способности трансфицировать немитотические клетки по сравнению с плазмидной ДНК (пДНК)¹. Несмотря на то, что доставка мРНК была продемонстрирована в начале 1990-х годов, ее терапевтическое применение было ограничено из-за ее недостаточной стабильности, отсутствия иммунной активации и^{низкой эффективности трансляции}. Недавно обнаруженные химические модификации, такие как псевдоуридин 5'-трифосфат (Ψ-UTP) и метилпсевдоуридин 5'-трифосфат (me1Ψ-UTP) на мРНК, помогли преодолеть эти ограничения, произвели революцию в исследованиях мРНК и, в свою очередь, сделали мРНК многообещающим инструментом как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Спектр применения охватывает от получения ИПСК до вакцинации и генной терапии ^3,4.

Параллельно с развитием технологии мРНК, значительные достижения в области невирусных систем доставки сделали доставку мРНК эффективной, что сделало эту технологию возможной для различных терапевтических^{применений5}. Среди невирусных векторов было обнаружено, что липидные наночастицы эффективны в доставке нуклеиновых кислот ^6,7. Недавно Алнилам получил одобрение FDA на препараты миРНК на основе липидов для лечения заболеваний печени, включая Патисиран для лечения наследственного транстиретин-опосредованного амилоидоза (hATTR амилоидоза) и Гивосиран для лечения острой печеночной порфирии (AHP)⁸. Во время пандемии COVID19 года инкапсулированные липидами мРНК-вакцины от Pfizer-BioNtech и Moderna продемонстрировали свою эффективность и получили одобрение FDA ^9,10. Таким образом, доставка мРНК с помощью липидов обладает большим терапевтическим потенциалом.

В данной статье мы подробно описываем протокол производства химически модифицированной, транскрибируемой in vitro мРНК eGFP, катионного липосомального препарата, оптимизации мРНК-липидного комплекса и трансфекции в клетки млекопитающих (рис. 1).

Протокол

1. Получение модифицированной мРНК me1 Ψ-UTP

1. Препарирование матриц ДНК методом транскрипции in vitro (IVT)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения матрицы ДНК IVT (промотор Т7 - открытая рамка считывания (ORF) гена) разработайте набор ген-специфичных праймеров для интересующего гена. Добавьте последовательность промотора T7 (5'-NNNNNNTAATACGACTCACTAGGGGNNNN-3') перед ген-специфичным прямым праймером.
   1. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР, как описано в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите не менее четырех реакций ПЦР для повышения концентрации и качества матрицы ДНК ИВТ для ИВТ.
   2. Полностью перемешайте реакционную смесь с помощью микропипетки и раскрутите с помощью микрофуги.
   3. Запустите протокол циклирования ПЦР, приведенный в таблице 2 , на термоамплификаторе.
2. Очистка матрицы ДНК IVT методом органической экстракции/осаждения этанола
   1. Отрегулируйте амплифицированную реакционную смесь ПЦР до 200 мкл с использованием воды, обработанной DEPC, в микрофуговой пробирке объемом 1,5 мл (без нуклеаз).
   2. Добавьте 200 μL насыщенного TE фенола/хлороформа, pH 8,0. Энергично делайте вихрь в течение 10 секунд.
   3. Центрифугируйте при давлении 12 000 x g в течение 5 минут, чтобы разделить фазы и перенести водную верхнюю фазу (примерно 200 μL) в новую микропробирку объемом 1,5 мл.
   4. Добавьте 1/^10-й (20 мкл) объем 3 М ацетата натрия, рН 5,5 и два объема (400 мкл) 99-100% этанола. Хорошо перемешайте, а затем выдерживайте не менее 30 минут при температуре -20 °C.
   5. Гранулируйте матрицу ДНК центрифугированием при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
   6. Удалите надосадочную жидкость полностью, не потревожив гранулу с помощью микропипетки.
   7. Добавьте в гранулу 0,5 мл 75% этанола и переверните 5-10 раз.
   8. Центрифугируйте в течение 2 минут при 12 000 x g при 4 °C. Затем полностью удалите этанол с помощью пипетки, не нарушая ДНК-гранулу.
   9. Дайте грануле высохнуть при комнатной температуре, пока пеллета не станет немного полупрозрачной.
   10. Добавьте 20 μL воды, не содержащей нуклеаз, и тщательно восстановите суспендию на несколько секунд.
3. Контроль качества очищенной ДНК-матрицы IVT
   1. Квантификация
      1. Измерьте концентрацию и качество очищенной ДНК-матрицы IVT с помощью микроспектрофотометра.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемая концентрация ДНК составит около 300-600 нг/мкл. Храните матрицу ДНК IVT при температуре -20 °C в течение длительного времени.
   2. Электрофорез в агарозном геле ДНК
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент направлен на то, чтобы проверить, имеет ли очищенная матрица ДНК IVT правильного размера и лишена ли она неспецифических загрязнений продуктом.
      1. Чтобы приготовить 1% агарозный гель, добавьте 0,5 г агарозы и 50 мл 1x TAE в коническую колбу. Разогревайте его в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Остудите агарозу при комнатной температуре в течение 5 минут.
      2. Добавьте 1 мкл красителя нуклеиновой кислоты (краситель SafeView) в виде 50 мл раствора агарозы.
      3. Налейте раствор агарозы в лоток для литья геля с помощью гребня и оставьте до тех пор, пока гель не застынет.
      4. Выньте расческу из геля и храните гель в 1x буферном баке TAE.
      5. Смешайте 10 мкл 100-10000.н. ДНК-лестницы и 100-200 нг очищенного ПЦР матричного продукта с 2 мкл 6x буфера для загрузки ДНК до общего объема 12 мкл.
      6. Загрузите каждый образец в соответствующие лунки и работайте при напряжении 100 В в течение не менее 45-60 минут.
      7. Визуализируйте полосы ДНК на приборе для документирования геля (рис. 2).
4. Синтез модифицированной РНК me1Ψ-UTP
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом этого эксперимента рабочая зона (ламинарный поток воздуха) должна быть очищена 70% этанолом в воде, обработанной DEPC. Используйте стерильные пробирки с низким уровнем удержания, не содержащие нуклеазы и эндотоксинов, и фильтрующие барьерные наконечники. Часто наносите 70% этанол на руки в перчатках.
   1. Приготовьте реакционную смесь IVT, как указано в таблице 3 , при комнатной температуре в пробирке объемом 0,2 мл и тщательно перемешайте ее с помощью микропипетки.
   2. Вращайте пробирку в течение 10 секунд в микрофуге.
   3. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 3 часов в термоамплификаторе.
5. Деградация ДНК-матрицы ИВТ под действием ДНКазы 1
   1. Добавьте 1 мкл 1 Ед/мкл ДНКазы 1 (без РНКазы) в реакционную смесь IVT и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
6. Очистка РНК методом органической экстракции/осаждения ацетата аммония
   1. Отрегулируйте объем реакционной смеси IVT до 200 мкл с помощью 179 μл воды, обработанной DEPC.
   2. Добавьте 200 мкл насыщенного TE фенола/хлороформа pH 8,0. Сделайте его вихрем в течение 10 секунд.
   3. Центрифугируйте при давлении 12 000 x g в течение 5 минут при 25 °C, чтобы разделить две фазы.
   4. Перенесите водную верхнюю фазу (200 мкл) в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 200 мкл ацетата аммония 5 мкл. Хорошо перемешайте, а затем инкубируйте в течение 15 минут на льду, чтобы выпасть в осадок РНК.
   5. Гранулируйте осажденную РНК центрифугированием при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C и полностью удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки.
   6. Промойте гранулу РНК с использованием 70% этанола и переверните 5-10 раз. Центрифуга при 12 000 x g в течение 5 минут при 4 °C.
   7. Полностью удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки, не нарушая гранулу РНК.
   8. Дайте гранулам высохнуть при комнатной температуре, пока они не станут полупрозрачными. Затем повторно суспендируйте гранулу в 60-75 мкл воды, не содержащей РНКазы.
7. Контроль качества очищенной РНК
   1. Квантификация
      1. Измерьте концентрацию и качество очищенной РНК с помощью микроспектрофотометра.
         Ожидаемый выход РНК составит 140-180 мкг для немодифицированной РНК и 100-150 мкг для модифицированной РНК me1Ψ-UTP за реакцию, в зависимости от размера интересующего гена и качества матрицы ДНК IVT. Оптимальным качеством должно быть соотношение OD₂₆₀/OD₂₈₀ в районе 1,9-2,0 и соотношение OD₂₆₀/OD₂₃₀ >2,0. Храните РНК при температуре -20 °C в течение короткого времени.
   2. Электрофорез с денатурирующей РНК агарозным гелем
      Примечание: Этот эксперимент проводится для проверки того, имеет ли синтезированная РНК правильную длину и лишена ли она загрязнения побочными продуктами ИВТ.
      1. Чтобы приготовить 1% агарозный гель, добавьте 0,5 г агарозы и 50 мл 1x TAE в коническую колбу. Готовьте раствор в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Подержите раствор агарозы при комнатной температуре 5 минут для остывания.
      2. Добавьте 1 мкл красителя нуклеиновой кислоты на 50 мл 1% раствора агарозы.
      3. Налейте раствор агарозы в лоток для литья геля с помощью гребня и оставьте до тех пор, пока гель не застынет.
      4. Выньте расческу из геля и храните гель в 1x буферном баке TAE.
      5. Приготовьте образец красителя, загружающего РНК, как описано в таблице 4.
      6. Нагрейте образцы до 65 °C в течение 10 минут, а затем держите образцы на льду.
      7. Загрузите каждый образец в соответствующие лунки и работайте при напряжении 100 В в течение не менее 45-60 минут.
      8. Визуализируйте полосы РНК на приборе для документирования геля (рис. 3).
8. Синтез модифицированной мРНК me1Ψ-UTP путем ферментативного кэппинга и поли-А хвостового оперения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность каппинга РНК IVT с использованием ферментативного метода составляет 100%. Следовательно, в этом протоколе мы использовали ферментативное кэппинг Cap-1 при синтезе мРНК. Мы добавили поли-А хвосты длиной >150 А оснований на молекулу для повышения трансляционной эффективности мРНК.
   1. Добавьте 55-60 мкг очищенной РНК IVT и доведите ее до 72 мкл с водой, свободной от РНКазы, в пробирке объемом 1,5 мл.
   2. Денатурируйте РНК при 65 °C в течение 10 минут в термомиксере, а затем немедленно поместите пробирку на лед на 5 минут.
   3. Тем временем приготовьте укупорочную реакционную смесь, как показано в таблице 5.
   4. Добавьте к денатурированной РНК реакционную смесь для каппинга и 4 мкл фермента каппинга и хорошо перемешайте с помощью микропипетки. Вращайте пробирку в течение 10 секунд в микрофуге.
   5. Инкубировать реакционную смесь при 37 °C в течение 2 часов.
   6. Через 2 часа держите трубку на льду и приготовьте основную смесь для хвостохранилища Poly A, как указано в таблице 6.
   7. Добавьте смесь Poly A tailing master в закрытый раствор РНК и хорошо перемешайте с помощью микропипетки. Вращайте пробирку в течение 10 секунд в микрофуге.
   8. Инкубировать реакционную смесь при 37 °C в течение 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: мРНК можно немедленно подвергнуть дальнейшей очистке, или неочищенную мРНК можно хранить при температуре -20 °C в течение ночи.
9. Очистка мРНК ИВТ
   1. Очистите мРНК путем органической экстракции/осаждения ацетата аммония, как указано в разделе 1.6 протокола.
   2. Повторно суспендируйте гранулу мРНК 60 мкл воды, не содержащей РНКазы.
10. Контроль качества очищенной мРНК
    1. Следуйте протоколу контроля качества, описанному в разделе протокола 1.7.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Полоса мРНК должна находиться выше полосы РНК из-за добавления поли-А хвоста в электрофорезе денатурирующей РНК агарозного геля (Рисунок 3). Кроме того, хвост Poly-A увеличивает выход мРНК (должен быть > концентрации РНК). После количественного определения поместите несколько аликвот мРНК в концентрацию 1 мкг/мкл и немедленно храните при -80 °C. Избегайте многократных циклов замораживания и размораживания РНК, чтобы предотвратить деградацию синтезированной мРНК.

2. Получение катионных липосом и оценка трансфекционных свойств мРНК in vitro

1. Препарат липосом
   1. Для приготовления 1 мМ катионной липосомы используют катионный липид: DOPE: холестерин в молярном соотношении 1:1:0,5.
   2. Растворите соответствующие молярные соотношения катионных липидов, холестерина и DOPE (1,2-диолеоил-sn-глицерол-3-фосфоэтаноламин) в хлороформе (200 мкл) в стеклянном флаконе.
   3. Используйте тонкую струю безвлажного газообразного азота для удаления растворителя.
   4. Высушенные липиды держать под высоким вакуумом для дальнейшей сушки в течение 2 часов.
   5. Добавьте 1 мл стерильной деионизированной воды к высушенным липидам после вакуумной сушки и дайте смеси набухнуть в течение ночи.
   6. Вортсируйте флакон при комнатной температуре, чтобы получить многоуниламеллярные везикулы (MUV).
   7. Используйте ультразвуковую обработку для ванны с последующей ультразвуковой обработкой зонда мощностью 25 Вт для создания небольших униламеллярных везикул (SUV) из многоканальных униламеллярных везикул (MUV).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внедорожники должны выглядеть как полупрозрачный раствор липосомы. Если нет, увеличьте количество 30-секундных импульсов с интервалом в 1 минуту. Гидродинамические диаметры и поверхностные потенциалы измеряются (рис. 4) в анализаторе размера частиц.
2. Формирование комплекса мРНК/липосомы и анализ замедления геля
   1. Для получения различных соотношений зарядов липид-РНК от 1:1 до 8:1 разбавляют мРНК и катионную липосому в деионизированной воде отдельно, как показано в таблице 7.
   2. Смешайте разведенную мРНК с раствором липосом, как указано в таблице 7 , и инкубируйте его в течение 10 минут при комнатной температуре для образования липоплекса.
   3. Добавьте в комплекс 20 мкл 2x РНК-загружающего красителя и загрузите в лунку. В качестве контроля служит только мРНК.
   4. Загрузите образцы на 1% агарозный гель в 1x буфер TAE и работайте при напряжении 100 В в течение 45 минут.
   5. Визуализируйте полосы РНК на приборе для документирования геля (рис. 5).
3. Трансфекция мРНК in vitro
   1. Засейте 45 000 клеток млекопитающих в лунку из 48 лунок в полноценную среду, а затем инкубируйте при 37 °C в течение 16-20 часов после трансфекции.
   2. Через 16-20 часов проверьте плотность ячеек. На момент трансфекции слияние клеток должно составлять около 80%.
   3. В пробирки объемом 0,5 мл добавьте 150 нг комплекса мРНК, кодирующего белок GFP, с соотношением зарядов катионных липосом и мРНК 1:1 в среде DMEM без сыворотки. Общий объем составляет до 20 μл.
   4. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут.
   5. Добавьте в клетки липоплекс и инкубируйте его в течение 4 часов в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 .
   6. Удалите среду, не потревожив клетки. Добавьте в каждую лунку 250 μл готового фильтрующего материала с 10% FBS (Таблица 8).
   7. Через 72 часа после трансфекции наблюдайте за экспрессией GFP под флуоресцентным микроскопом (рис. 6, 7).
   8. Чтобы количественно оценить экспрессию GFP, обработайте клетки для анализа проточной цитометрии.
   9. Снимите носитель и промойте 1x PBS дважды. Трипсинизируйте клетки и обработайте клетки для количественного определения процента GFP-положительных клеток в проточном цитометре.
   10. Получите клетки в проточном цитометре с помощью лазера 488. Проверьте живую популяцию и проанализируйте процент GFP-положительных клеток. Количественно оцените среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) (Рисунок 6, 7).

Результаты

Мы оптимизировали протокол для экспериментов по производству модифицированной мРНК me1Ψ-UTP, получению липосом и трансфекции мРНК катионными липосомами в множественные клетки млекопитающих (рис. 1). Для синтеза мРНК оптимизированный кодоном матрица eGFP IVT млекопитающих амплифицировали из вектора экспрессии mEGFP-N1 млекопитающих и очищали методом органической экстракции/осаждения этанола (рис. 2). Позже с помощью процесса IVT были получены модифицированные me1...

Обсуждение

Терапевтическое применение немодифицированных мРНК было ограничено из-за их более короткого периода полувыведения и их способности активировать внутриклеточные врожденные иммунные реакции, что, в свою очередь, приводит к плохой экспрессии белка в трансфицированных^{клетках}. Katalin et al. продемонстрировали, что РНК, содержащая модифицированные нуклеозиды, такие как m5C, m6A, ΨU и me1Ψ-UTP, может избежать активации TLR¹². Что еще более важно,...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агароза	Lonza	50004
Ультразвуковая ванна	DNMANM Industries	USC-100
Катионный липид	Синтезирован в лаборатории
Хлориз	MP biomedicals	67-66-3	"Осторожно"
Холестерин	Himedia	GRM335
DEPC вода	SRL BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA Ladder	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA Натриевая соль	MP биомедицинские	194822
этанол	Hayman	F204325	"Осторожно"
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10270
Проточная цитометрия	BD	FACS Celesta
Fluroscence Microscope	Leica	MI6000B
Система документирования геля	Cell Biosciences	Flurochem E
Ледяная уксусная кислота	Fisher Scientific	85801	Caution"
mEGFP-N1, вектор экспрессии млекопитающих	Addgene	54767
N1-Methylpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Фенол:хлороформ:изоамилалхол (25:24:1), pH 8.0	SRL BioLit	136112-00-0	Осторожно"
Фосфатный буфер (PBS), pH 7.4	CellClone	CC3041
Зонд ультразвуковой аппарат	Sonics Vibra Cells	VCX130
Лестница РНК	NEB	N0362S
Ингибитор РНКазы	Thermo Scientific	N8080119
SafeView краситель	abm	G108
Ацетат натрия	Sigma	S7545
Термоамплификатор	Применяемые биосистемы	4375786
Термомиксер	Eppendrof	22331
Трис буфер	SRL BioLit	71033
Трипсин	Gibco	25200056