Method Article

Иммунофлуоресцентное окрашивание для визуализации гетерохроматиновых ассоциированных белков в слюнных железах дрозофилы

DOI:

10.3791/62408

⸱

August 21st, 2021

 ,  , 
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол направлен на визуализацию агрегатов гетерохроматина в клетках Drosophila polytene.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация агрегатов гетерохроматина путем иммуноокрашивания может быть сложной задачей. Многие компоненты хроматина у млекопитающих сохраняются в Drosophila melanogaster. Поэтому это отличная модель для изучения образования и поддержания гетерохроматина. Политенизированные клетки, такие как те, которые обнаружены в слюнных железах личинок третьей звезды D. melanogaster, обеспечивают отличный инструмент для наблюдения за усилением хроматина почти в тысячу раз и позволили исследователям изучить изменения в распределении гетерохроматина в ядре. Хотя наблюдение за компонентами гетерохроматина может проводиться непосредственно в политеновых хромосомных препаратах, локализация некоторых белков может быть изменена тяжестью лечения. Поэтому прямая визуализация гетерохроматина в клетках дополняет этот вид исследования. В этом протоколе мы описываем методы иммуноокрашения, используемые для этой ткани, использование вторичных флуоресцентных антител и конфокальную микроскопию для наблюдения этих гетерохроматиновых агрегатов с большей точностью и детализацией.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Начиная с ранних исследований Эмиля Хайца1,гетерохроматин считался важным регулятором клеточных процессов, таких как экспрессия генов, мейотическое и митотическое разделение хромосом и поддержание стабильности генома2,3,4.

Гетерохроматин в основном делится на два типа: конститутивный гетерохроматин, который характерно определяет повторяющиеся последовательности, и транспонируемые элементы, которые присутствуют в определенных участках хромосом, таких как теломеры и центромеры. Этот тип гетерохроматина в основном определяется ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Третья культура личинок

  1. Приготовить 1 л стандартной среды, добавив 100 г дрожжей, 100 г нерафинированного цельного тростникового сахара, 16 г агара, 10 мл пропионовой кислоты и 14 г желатина. Растворите все ингредиенты, кроме дрожжей, в 800 мл водопроводной воды, а затем растворите дрожжи. Автоклав сразу на 30 минут.
    1. После этого дайте среде остыть до 60 °C и добавьте пропионовую кислоту до конечной концентрации 0,01%. Дайте флакону постоять, пока не образуется желатин.
  2. Чтобы оптимизировать культуру 3o instar larvae, сначала соберите взрослых особей в возрасте от 5 до 10 дней и поместите 50 (25 самцов и 25 самок) в бутылку со....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативные результаты иммуноокрашивания HP1a в слюнных железах Drosophila показаны на рисунке 1. Положительным результатом является наблюдение одной фокусной точки(рисунок 1а)(гетерохроматический агрегат или конденсат). Отрицательным результатом является отсутствие сигнала или рассеянный сигнал. Иногда может наблюдаться двойной сигнал, то есть с двойной точкой(рисунок 1с),но обычно он возникает в меньших количествах.<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная функция эукариотических организмов может определять 3D-структуру внутри ядра, которая поддерживается взаимодействиями между различными белками с хроматином и различными молекулами, включая РНК. В последние три года биологические конденсаты, которые имели отношение, в том числе гетерохроматин, взяли на себя фундаментальную роль в определении разделения фаз, способствуя отчетливой ядерной пространственной организации активного и репрессивного хроматина 16,17,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Марко Антонио Росалес Вега и Абеля Сегуру за то, что они сделали некоторые из конфокальных изображений, Кармен Муньос за подготовку к сми и доктора Артуро Пиментеля, М.C Андреса Саралеги и доктора Криса Вуда из LMNA за советы по использованию микроскопов.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиAxygen MCT-150-C11351904марка не критична
16% формальдегидThermo Scientific28908
AF1 CitifluorTed pella1947025 мл
BSA, молекулярная биология МаркаRoche10735078001марка не критична
Полные, ингибиторы протеазы Ultra EDTA-free
протеаза ингибиторы		Merck5892953001
CoverslipCorningCLS285022-200EA22x22, марка не критична
DTTSigmad9779марка не критична
ЭДТАСигмаE5134марка не критична
EGTAмарка не критична
СтеклослайдЗолотая печать3011марка не критична
H3BO3Baker0084-01марка
не критична H3K9me3Abcam8889
HP1aHybridoma BankC1A9Product Form  Концентрат 0,1 мл
KClBaker3040-01марка не критичная
МетанолБейкер9070-03марка не критичная
NaClSigma71376марка не критичная
марка NaOHне критичная марка
ТРУБКИмарка не критичная
РотаторThermo Scientific13-687-12Q  Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer CEppendorf13527550SmartBlock 1,5 мл
TrisMilipore648311марка не
критична Triton X-100SigmaT8787100 мл, марка не критична
&бета;-меркаптоэтанолBio-Rad161071025 мл, марка не критична

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572(2019).
  2. Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
  3. Kasinathan, B., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immunofluorescent StainingHeterochromatin ProteinsDrosophila Salivary GlandsPolytene ChromosomesConfocal MicroscopyFluorescent AntibodiesHP1 ProteinChromatin VisualizationGenetic MutantsProtein Localization

Related Articles