Методическая статья

Иммунофлуоресцентное окрашивание для визуализации гетерохроматиновых ассоциированных белков в слюнных железах дрозофилы

DOI:

10.3791/62408

⸱

21 августа 2021 г.

 ,  , 
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол направлен на визуализацию агрегатов гетерохроматина в клетках Drosophila polytene.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация агрегатов гетерохроматина путем иммуноокрашивания может быть сложной задачей. Многие компоненты хроматина у млекопитающих сохраняются в Drosophila melanogaster. Поэтому это отличная модель для изучения образования и поддержания гетерохроматина. Политенизированные клетки, такие как те, которые обнаружены в слюнных железах личинок третьей звезды D. melanogaster, обеспечивают отличный инструмент для наблюдения за усилением хроматина почти в тысячу раз и позволили исследователям изучить изменения в распределении гетерохроматина в ядре. Хотя наблюдение за компонентами гетерохроматина может проводиться непосредственно в политеновых хромосомных препаратах, локализация некоторых белков может быть изменена тяжестью лечения. Поэтому прямая визуализация гетерохроматина в клетках дополняет этот вид исследования. В этом протоколе мы описываем методы иммуноокрашения, используемые для этой ткани, использование вторичных флуоресцентных антител и конфокальную микроскопию для наблюдения этих гетерохроматиновых агрегатов с большей точностью и детализацией.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Начиная с ранних исследований Эмиля Хайца1,гетерохроматин считался важным регулятором клеточных процессов, таких как экспрессия генов, мейотическое и митотическое разделение хромосом и поддержание стабильности генома2,3,4.

Гетерохроматин в основном делится на два типа: конститутивный гетерохроматин, который характерно определяет повторяющиеся последовательности, и транспонируемые элементы, которые присутствуют в определенных участках хромосом, таких как теломеры и центромеры. Этот тип гетерохроматина в основном определяется эпигенетически специфическими гистоновыми метками, такими как ди- или триметилирование лизина 9 гистона H3 (H3K9me3) и связывание белка гетерохроматина 1a (HP1a)5,6. С другой стороны, факультативный гетерохроматин локализуется через руки хромосомы и состоит в основном из генов, заглушающих развитие7,8. Иммуноокрашивание блоков гетерохроматина в метафазных клетках или наблюдение за агрегатами гетерохроматина в межфазных клетках открыло много света в понимании формирования и функции гетерохроматических областей9.

Использование дрозофилы в качестве модельной системы позволило разработать необходимые инструменты для изучения гетерохроматина без использования электронной микроскопии10. С момента описания изменения эффекта положения и открытия гетерохроматин-ассоциированных белков, таких как HP1a, и постпереводных модификаций гистона многие группы разработали несколько иммуногистохимических методов, которые позволяют визуализировать эти гетерохроматическиеобласти 10,11.

Эти методы основаны на использовании специфических антител, которые распознают гетерохроматин-ассоциированные белки или гистоновые метки. Для каждого типа клеток и антител условия фиксации и пермеабилизации должны быть определены эмпирически. Кроме того, условия могут варьироваться, если используются дополнительные механические процессы, такие как методы раздавливания. В этом протоколе мы описываем использование слюнных желез Drosophila для изучения гетерохроматических очагов. Слюнные железы имеют политенизированные клетки, которые содержат более 1000 копий генома, что обеспечивает усиленное представление о большинстве особенностей хроматина, за исключением спутниковой ДНК и некоторых гетерохроматических областей, которые недостаточно реплицируются. Тем не менее, области гетерохроматина легко визуализируются в препаратах политеновых хромосом, но методы раздавливания могут иногда нарушать характерные хроматин-связанные комплексы или архитектуру хроматина. Поэтому иммунолокализация белков в целой ткани слюнных желез может превзойти эти нежелательные эффекты. Мы использовали этот протокол для обнаружения нескольких связанных с хроматином белков, и мы продемонстрировали, что этот протокол в сочетании с мутантными запасами дрозофилы может быть использован для изучения нарушения гетерохроматина12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Третья культура личинок

  1. Приготовить 1 л стандартной среды, добавив 100 г дрожжей, 100 г нерафинированного цельного тростникового сахара, 16 г агара, 10 мл пропионовой кислоты и 14 г желатина. Растворите все ингредиенты, кроме дрожжей, в 800 мл водопроводной воды, а затем растворите дрожжи. Автоклав сразу на 30 минут.
    1. После этого дайте среде остыть до 60 °C и добавьте пропионовую кислоту до конечной концентрации 0,01%. Дайте флакону постоять, пока не образуется желатин.
  2. Чтобы оптимизировать культуру 3o instar larvae, сначала соберите взрослых особей в возрасте от 5 до 10 дней и поместите 50 (25 самцов и 25 самок) в бутылку со стандартными носителями с широким горлышком.
  3. Поместите бутылку с мухами в инкубатор с контролируемой температурой при 25 °C до тех пор, пока количество отложенных яиц не сойдет на 50 (примерно 12 часов для штамма дикого типа).
  4. После того, как время инкубации закончится, удалите взрослых и перенесите их в новый флакон, чтобы повторить процедуру. Дайте эмбрионам расти при 18 °C в течение 72 часов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной о состоянии обслуживания запасов дрозофилы см. Tennessen & Thymmel13.

2. Сбор личинок

  1. Для сбора личинок выбирают блуждающих личинок, у которых нет вечно хихищевиц. После выворота дыхальца личинка переходит в препупальную стадию, сохраняя при этом отличные политеновые хромосомы, пригодные для анализа. Только через 12 часов клетки слюнных желез начинают готовиться к запрограммированной гибели клеток14,15.
  2. Возьмите пятнадцать личинок звезды 3° и положите их в стакан для часов, чтобы промыть их. Затем переложите их в ледяной солевой раствор или PBS (1x PBS: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4,2 мМ KH2PO4,отрегулируйте рН до 7,4).
  3. Рассечение от 15 до 30 пар слюнных желез (или как можно больше за 30 минут) в холодном PBS с ингибиторами протеазы под стереоскопическим микроскопом. Перенесите слюнные железы в трубку 1,5 мл с ледяным PBS.
  4. Промыть один раз 1 мл PBS плюс ингибиторы протеазы. Подождите, пока ткань достигнет дна трубки.
  5. После стирки удалите PBS пипеткой 1000 мкл. Позаботьтесь о том, чтобы не прикасаться к ткани.
    1. Альтернативно, рассекните слюнные железы в 5 мл PBS, чтобы устранить необходимость в этом этапе промывания, и перейдите к шагу 3, переведя слюнные железы в 0,5 мл фиксирующего буфера Ruvkun, описанного ниже.

3. Фиксация тканей слюнных желез

  1. После удаления PBS с последней ступени непосредственно добавляют 0,5 мл 1x фиксирующего буфера Ruvkun, с 50% метанола (добавляют 0,5 мл метанола) и 2% формальдегида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2x раствор Ruvkun составляет 160 мМ KCl, 40 мМ NaCl, 20 мМ EGTA, 30 мМ ТРУБЫ при рН 7,4.
  2. Инкубировать в течение 2 часов при 4 °C с легким вращением.

4. Промывание тканей слюнных желез

  1. Проводят одну 5-минутную ротационную промывку с 1 мл буфера Tris/Triton (100 мМ Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 и 1 мМ ЭДТА).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите, пока ткань достигнет дна трубки.

5. Пермеабилизация

  1. Инкубировать слюнные железы в 1 мл Tris/Triton X-100 (так же, как и выше). Для некоторых белков может потребоваться добавить 1% β-меркаптоэтанола.
  2. Инкубировать в течение 2 часов при 37°С при легком встряхивании (300 об/мин).

6. Шаг сохранения (опционально)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если не приступаем непосредственно к инкубации с антителом, сохраните ткань следующим образом.

  1. Промыть 1 мл буфера BO3 (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) и затем инкубировать в BO3 /10мМ DTT при 37 °C с легким встряхиванием (300 об/мин) в течение 15 минут.
  2. В конце инкубационного периода выполните промывку 1 мл только буфера BO3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите, пока ткань достигнет дна трубки.
  3. Добавьте 1 мл PBS. Сохраняйте ткань в этом растворе при 4 °C в течение 72 часов, а затем переходите к следующему шагу. Этот шаг особенно полезен при работе с различными мутантными штаммами, которые могут представлять собой замедленный жизненный цикл, поэтому иммунодетекция может быть выполнена одновременно с контролем.

7. Блокировка тканей

  1. Инкубируют слюнные железы в 1 мл буфера B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 мМ ЭДТА) в течение 2 часов при комнатной температуре с вращением.

8. Иммуноокрашивание

  1. Удалите весь буфер B и добавьте буфер A (PBS + 0,1% BSA) плюс интересующих антитела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем HP1a C1A9c (концентрированное антитело) от Hybridoma Bank до 1:3000. При использовании C1A9s (супернатанта) мы попробовали от 1:100 до 1:500 разбавления, и любое разведение между этим рангом работает хорошо) ночью при 4 oC с вращением. В этот момент важно, чтобы встряхивание не поднимало пузырьки, которые могут повредить антитело.

9. Иммуноокрашивание промывки

  1. Выполняйте 3 х 15-минутные промывки с буфером B при перемешивании при комнатной температуре, используя 1 мл каждый раз.
  2. Перенос желез в буфер В вместе с вторичным антителом, соединенным с флуорофором в течение 2 часов при вращении при 4 oC (вторичное антитело Alexa fluor 568 Invitrogen использовали 1:3000).
    1. Накройте трубку алюминиевой бумажной фольгой, чтобы защитить вторичное антитело от света.
  3. Проводите 2 х 15-минутные стирки при комнатной температуре при вращении с 1 мл буфера B.
  4. Инкубировать с ДНК-маркером, таким как Sytox (взять 2 мкл из 5 мМ запаса и растворить в 1 мл буфера B) или Hoechst (взять 1 мкл из 10 мг / мл и растворить в 1 мл буфера B) в течение 10 минут при комнатной температуре с вращением.
  5. Провести одну стирку с буфером B и один раз с PBS, каждая стирка длится 10 минут при вращении при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте защитить его от света.

10. Визуализация

  1. Установите слюнные железы на горку, сделав бассейн с укрытием.
  2. Поместите слюнные железы в середину бассейна и накройте AF1 citifluor, чтобы избежать образования пузырьков, распространяющих вязкую жидкость по всему месту. Затем запечатайте все стороны прозрачным лаком для ногтей.
  3. Наблюдают под флуоресцентным или конфокальным микроскопом. Если образец не будет наблюдаться в тот же день, храните вдали от света при 4 °C.
  4. Используйте GraphPad Prism 6 для создания всех графиков и статистического анализа.
  5. Проанализируйте данные распределения HP1a в слюнных железах с помощью теста Крускала-Уоллиса. Статистическая значимость установлена на уровне (p < 0,05*, < 0,01**, < 0,001***, < 0,0001****).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативные результаты иммуноокрашивания HP1a в слюнных железах Drosophila показаны на рисунке 1. Положительным результатом является наблюдение одной фокусной точки(рисунок 1а)(гетерохроматический агрегат или конденсат). Отрицательным результатом является отсутствие сигнала или рассеянный сигнал. Иногда может наблюдаться двойной сигнал, то есть с двойной точкой(рисунок 1с),но обычно он возникает в меньших количествах.<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная функция эукариотических организмов может определять 3D-структуру внутри ядра, которая поддерживается взаимодействиями между различными белками с хроматином и различными молекулами, включая РНК. В последние три года биологические конденсаты, которые имели отношение, в том числе гетерохроматин, взяли на себя фундаментальную роль в определении разделения фаз, способствуя отчетливой ядерной пространственной организации активного и репрессивного хроматина 16,17,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Марко Антонио Росалес Вега и Абеля Сегуру за то, что они сделали некоторые из конфокальных изображений, Кармен Муньос за подготовку к сми и доктора Артуро Пиментеля, М.C Андреса Саралеги и доктора Криса Вуда из LMNA за советы по использованию микроскопов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиAxygen MCT-150-C11351904марка не критична
16% формальдегидThermo Scientific28908
AF1 CitifluorTed pella1947025 мл
BSA, молекулярная биология МаркаRoche10735078001марка не критична
Полные, ингибиторы протеазы Ultra EDTA-free
протеаза ингибиторы		Merck5892953001
CoverslipCorningCLS285022-200EA22x22, марка не критична
DTTSigmad9779марка не критична
ЭДТАСигмаE5134марка не критична
EGTAмарка не критична
СтеклослайдЗолотая печать3011марка не критична
H3BO3Baker0084-01марка
не критична H3K9me3Abcam8889
HP1aHybridoma BankC1A9Product Form  Концентрат 0,1 мл
KClBaker3040-01марка не критичная
МетанолБейкер9070-03марка не критичная
NaClSigma71376марка не критичная
марка NaOHне критичная марка
ТРУБКИмарка не критичная
РотаторThermo Scientific13-687-12Q  Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer CEppendorf13527550SmartBlock 1,5 мл
TrisMilipore648311марка не
критична Triton X-100SigmaT8787100 мл, марка не критична
&бета;-меркаптоэтанолBio-Rad161071025 мл, марка не критична

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572(2019).
  2. Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
  3. Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
  4. Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
  5. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  6. Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
  7. Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
  8. Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039(2002).
  9. Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
  10. Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
  11. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  12. Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
  13. Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
  14. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
  15. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).
  16. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  17. Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
  18. Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
  19. Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
  20. Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
  21. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  22. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  23. Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
  24. Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
  25. Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
  26. Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
  27. Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
  28. Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
  29. Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
  30. Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
  31. Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HP1

Похожие статьи