В этой статье описывается изоляция клеток аортального клапана мыши с помощью двухэтапной коллагеназы. Изолированные клетки мышиного клапана важны для выполнения различных анализов, таких как этот анализ кальцификации in vitro, и для исследования молекулярных путей, ведущих к минерализации аортального клапана.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение клеток интерстициального клапана мыши для изучения кальцификации аортального клапана in vitro
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кальцификация клеток аортального клапана является отличительной чертой аортального стеноза и связана с фиброзом клапанного куспида. Клапанные интерстициальные клетки (ВИК) играют важную роль в процессе кальцификации при стенозе аорты путем активации их программы дедифференциации к остеобластоподобным клеткам. Мышиные ВИК являются хорошим инструментом in vitro для выяснения сигнальных путей, приводящих к минерализации клетки аортального клапана. Способ, описанный в настоящем описании, успешно используемый этими авторами, объясняет, как получить свежеизолированные клетки. Двухэтапная процедура коллагеназы проводилась с 1 мг/мл и 4,5 мг/мл. Первый шаг имеет решающее значение для удаления слоя эндотелиальных клеток и предотвращения любого загрязнения. Вторая инкубация коллагеназы предназначена для облегчения миграции ВИК из ткани в пластину. Кроме того, обсуждается процедура иммунофлуоресцентного окрашивания для фенотипной характеристики изолированных клеток мышиного клапана. Кроме того, анализ кальцификации проводили in vitro с использованием процедуры измерения кальциевого реагента и окрашивания ализарином красным цветом. Использование первичной культуры клеток мышиного клапана имеет важное значение для тестирования новых фармакологических мишеней для ингибирования минерализации клеток in vitro.
Введение
Кальцинированная болезнь аортального клапана (CAVD) является наиболее распространенным заболеванием клапанного сердца в западных популяциях, затрагивающим почти 2,5% пожилых людей старше 65 лет1года. CAVD поражает более шести миллионов американцев и связан с изменениями механических свойств листочков, которые ухудшают нормальный кровоток -1,2. В настоящее время не существует фармакологического лечения, чтобы остановить прогрессирование заболевания или активировать минеральную регрессию. Единственной эффективной терапией для лечения CAVD является замена аортального клапана хирургическим ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры для животных, описанные здесь, были одобрены Медицинской школой Икана в Институциональном ядре и комитете по использованию горы Синай.
1. Подготовка перед изоляцией клеток клапана у взрослых мышей
- Очистите и стерилизуйте все хирургические инструменты, показанные на рисунке 1А, используя 70% v/v этанола и впоследствии автоклавируя их в течение 30 мин. очистите хирургическое рабочее пространство 70% этанолом.
- Добавьте 500 мкл пенициллина-стрептомицина к 50 мл 10 мм HEPES. Приготовьте аликвоту в 50 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Держите раств....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Поскольку мышиные аортальные клапаны обычно имеют диаметр 1 мм, по крайней мере три клапана должны быть объединены, чтобы собрать миллион жизнеспособных клеток для различных экспериментальных процедур. Различные этапы процесса изоляции ВМЦ показаны на рисунках 1 и 2. Поскольку трудно вручную соскоблить ткань клапана, предпочтительно использовать сдвиговое напряжение, создаваемое вихрем, для удаления VEC. Действительно, результаты иммунофлуоресцентного окрашивани.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье представлен подробный протокол изоляции клеток мышиного клапана для первичной культуры. Три аортального клапана у 8-недельных мышей были объединены для получения достаточного количества клеток. Кроме того, этот протокол описывает характеристику фенотипа ВИЦ и анализ минерализации in vitro. Метод был адаптирован из ранее описанного протокола из Mathieu et al.7.
Во время изоляции аортальных клапанов необходимо соблюдать осторожность, чтобы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ножницы с режущей кромкой 3 мм | F.S.T | 15000-00 | |
| Антиальфа гладкие мышцы Антитело к актину | abcam | ||
| Анти-мышь, Alexa Fluor 488 конъюгат | Cell Signaling | 4412 | |
| Набор реагентов Arsenazo-III | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | Набор для измерения концентрации кальция |
| Боннские ножницы | F.S.T | 14184-09 | |
| Кальция гидроксид | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase тип I (125 единиц/мг) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Сверхтонкие щипцы | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Тонкие щипцы | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M раствор | СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ТЕХНОЛОГИИ | ||
| L-глютамин 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Реагент для элиминации микоплазмы |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| пенециллин стрептомицин 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| пируват натрия 100 мМ | Thermofisher Scientific | ||
| Щипцы стандартной схемы | F.S.T | 11000-12 | |
| Хирургические ножницы - острые-тупые | F.S.T | 14008-14 | |
| Трипсин 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
Ссылки
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the Amer....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
