Инструменты для оценки в режиме реального времени модели инфекции Pseudomonas aeruginosa

Summary

Синтетическая среда мокроты при муковисцидозе (SCFM2) может быть использована в сочетании как с конфокальной лазерной сканирующей микроскопией, так и с флуоресцентно-активированной сортировкой клеток для наблюдения бактериальных агрегатов с высоким разрешением. В этой статье подробно описываются методы оценки совокупных популяций во время антимикробного лечения в качестве платформы для будущих исследований.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (Pa) является одним из наиболее распространенных условно-патогенных микроорганизмов, связанных с муковисцидозом (МВ). Как только колонизация Па установлена, большая часть инфекционных бактерий образует биопленки в мокроте дыхательных путей. Было показано, что биопленки Па, выделенные из мокроты муковисцидного средства, растут в небольших, плотных агрегатах ~ 10-1000 клеток, которые пространственно организованы и демонстрируют клинически значимые фенотипы, такие как устойчивость к противомикробным препаратам. Одной из самых больших проблем при изучении того, как агрегаты Pa реагируют на изменение среды мокроты, является отсутствие питательных и надежных систем, которые способствуют образованию агрегатов. Используя синтетическую среду мокроты CF (SCFM2), историю жизни агрегатов Pa можно наблюдать с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) и анализа изображений с разрешением одной клетки. Эта система in vitro позволяет наблюдать тысячи агрегатов различного размера в режиме реального времени, трех измерениях и в микроном масштабе. На индивидуальном и популяционном уровнях способность группировать агрегаты по фенотипу и положению облегчает наблюдение агрегированных агрегатов на разных стадиях развития и их реакцию на изменения в микросреде, такие как лечение антибиотиками, которые должны быть дифференцированы с точностью.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (Pa) является оппортунистическим патогеном, который устанавливает хронические инфекции у людей с ослабленным иммунитетом. Для людей с генетическим заболеванием муковисцидоз (МВ) эти инфекции могут охватывать всю жизнь. Муковисцидоз вызывает накопление вязкой, богатой питательными веществами мокроты в дыхательных путях, которая со временем колонизируется различными микробными патогенами. Па является одним из наиболее распространенных патогенов муковисцидоза, колонизируя дыхательные пути в раннем детстве и устанавливая трудноизуемые инфекции¹. Па остается значительной клинической проблемой и считается ведущей причиной смертности у лиц с муковисцидозом, несмотря на улучшение схем терапии в последние^годы2,3. Этот фенотип персистенции и повышение толерантности к антибиотикам принесли Па место в группе патогенов, идентифицированных как Центрами по контролю и профилактике заболеваний (CDC), так и Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в качестве исследовательских приоритетов для разработки новых терапевтических стратегий - патогенов ESKAPE^4.

Как и другие патогены ESKAPE, приобретенная устойчивость к антибиотикам распространена в Pa,но есть также много внутренних свойств, которые способствуют антимикробной толерантности Pa. Среди них способность Па образовывать агрегаты — высокоплотные кластеры из ~10-1000 клеток, которые могут наблюдаться при множественных инфекциях, в том числе при МВ мокроте больного^5,6. Подобно Pa, изученным в других системах биопленки, агрегаты Pa демонстрируют клинически значимые фенотипы, такие как повышенная устойчивость к антибиотикам и активация клеточно-клеточной коммуникации (кворум-зондирование (QS)). Например, было показано, что агрегаты Па используют QS-регулируемое поведение для борьбы с другими микробами, а также переносят антимикробные методы лечения, такие как производство пиоцианина^7. Способность изучать такое поведение дает захватывающее представление о бактериальных экосистемах в среде, подобной той, в которой они существуют в организме человека.

Одной из самых больших проблем при изучении того, как агрегаты Pa реагируют на изменение среды мокроты, является отсутствие питательных и надежных систем, которые способствуют образованию агрегатов. Многое из того, что известно о Па, было обнаружено с использованием систем in vitro, в которых клетки растут планктонально или в характерной поверхностно-прикрепленной, «грибной» архитектуре, которая не наблюдалась in vivo^8. В то время как классические модели роста биопленки, такие как прототочные клетки или твердый агар, дали обширные и ценные знания о поведении бактерий и механизмах толерантности к антибиотикам, эти результаты не всегда переводятся in vivo. Многие модели in vitro имеют ограниченную способность имитировать среду роста места инфекции человека, что требует дорогостоящих исследований in vivo. В свою очередь, многим моделям in vivo не хватает гибкости и разрешения, предоставляемых методами in vitro.

Синтетический муковисцидоз мокроты (SCFM2) предназначен для обеспечения среды для роста Па, аналогичной той, которая наблюдается во время хронической инфекции в легких муковисцидоза. SCFM2 включает источники питания, идентифицированные в отхаркиваемой смуте CF в дополнение к муцину, липидам и ДНК. Рост Pa в SCFM2 требует почти идентичного набора генов, необходимых для роста фактической мокроты, и поддерживает естественное образование агрегата Pa ^9,10. После инокуляции планктонные клетки образуют агрегаты, которые увеличиваются в размерах за счет расширения. Отдельные клетки (называемые мигрантами) высвобождаются из агрегатов, мигрируют в неколонизированные районы и образуют новые агрегаты^10. Эту историю жизни можно наблюдать с помощью CLSM и анализа изображений с разрешением одной клетки. Агрегаты Па, образующиеся в SCFM2, имеют размеры, аналогичные тем, которые наблюдаются в легком^{CF 10.} Эта модель позволяет наблюдать несколько агрегатов различного размера в режиме реального времени и в трех измерениях в микроновом масштабе. Покадровая микроскопия позволяет отслеживать тысячи (~50 000) агрегатов в одном эксперименте. Использование программного обеспечения для анализа изображений позволяет количественно оценить совокупные фенотипы по микроснимкам, включая совокупный объем, площадь поверхности и положение в трех измерениях до ближайших 0,1 мкм, как на индивидуальном агрегированном, так и на популяционном уровнях. Наличие способности группировать агрегаты по фенотипу и положению позволяет с точностью дифференцировать агрегаты на разных стадиях развития, а также их реакцию на изменение^{микросреды 6,11.}

Применение SCFM2 для изучения агрегатов Pa в анализах с низким объемом и высокой пропускной способностью делает его гибкой и экономически эффективной моделью. В качестве определенной среды SCFM2 обеспечивает однородность и воспроизводимость на нескольких платформах, обеспечивая питательную и физически релевантную методику изучения агрегатов Pa in vitro^9. Приложения включают его использование в сочетании с CLSM для наблюдения пространственной организации и толерантности к антибиотикам при высоком разрешении (как описано в этой статье о методах). Возможность проводить эксперименты, которые предоставляют данные в микроновом масштабе в режиме реального времени, позволяет изучать внутривидовые и межвидовые взаимодействия, поскольку они могут происходить in vivo. Например, SCFM2 ранее использовался для изучения пространственной динамики клеточно-клеточной коммуникации в совокупных популяциях через сеть систем, используемых Pa для регулирования нескольких генов, которые способствуют вирулентности и патогенезу^6.

Рисунок 1:Графическое изображение основных экспериментальных этапов. (A)SCFM2 инокулируют Па-клетками и позволяют формировать агрегаты в чашке со стеклянным дном. (B) Агрегаты переносятся в конфокальный микроскоп и добавляют антибиотик. Изображены три технические реплики (камеры 1-3) и контрольная скважина (4) инокулированного SCFM2 без лечения антибиотиками. Агрегаты визуализируются с использованием CLSM в течение 18 ч. (C) После первоначальной 18-ч визуализации агрегаты обрабатывают йодидом пропидия для визуализации мертвых клеток и визуализируют с помощью CLSM (D) Агрегаты с желаемым фенотипом отделяют от SCFM2 с помощью FACS. Сокращения: SCFM2 = синтетический муковисцидоз мокроты; Pa = Синегнойная палочка; CLSM = конфокальная лазерная сканирующая микроскопия; FACS = флуоресцентная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Здесь демонстрируется полезность SCFM2 для изучения влияния лечения антибиотиками на агрегаты Pa в режиме реального времени, за которым следует использование клеточного подхода для выделения популяций агрегатов с различными фенотипами для последующего анализа(рисунок 1).

Protocol

1. Подготовьте синтетическую среду муковисцидоза (SCFM2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка SCFM2 состоит из трех основных этапов, описанных ниже(рисунок 2). Для получения полной информации и ссылок см.^9,10,12.

Рисунок 2:Подготовка и инокуляция среды SCFM2. (А)Буферное основание получают с использованием солей и аминокислот, перечисленных в Таблице 1 и Таблице 2. Буферизованная основа может храниться при 4 °C до 30 дней, но должна быть защищена от воздействия света. (B)Муцин и ДНК добавляют к аликвоте буферного основания и растворяют в растворе на ночь при 4 °C.(C)Липиды и дополнительные запасы добавляют в ночной раствор и инкубируют при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин в течение 20 мин. Затем SFCM2 инокулируют промытыми, логарифматическими клетками при OD₆₀₀ = 0,05. Сокращения: SCFM2 = синтетический муковисцидоз мокроты среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Стерилизация муцина свиней
   1. Готовят стерильный муцин в конечной концентрации 5 мг/мл в SCFM2. Например, для объема SCFM2 объемом 5 мл взвесьте 25 мг муцина типа II в стерильной чашке Петри и поместите в ультрафиолетовый (УФ) стерилизатор на 4 ч, осторожно перемешивая каждый час.
   2. Через 4 ч переведите обработанный УФ-излучение муцин в аутоклавные пробирки по 1,7 мл в стерильных условиях и храните при -20 °C.
   3. Чтобы подтвердить полную стерилизацию, растворите образец муцина в стерильной жидкости, такой как вода или бульон Luria Bertani (LB), и наблюдайте под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизованный муцин можно хранить при -20 °C до 6 месяцев.
2. Подготовка буферного основания
   1. Приготовьте растворы солей и аминокислот, добавив соответствующие количества по весу в деионизированную воду, как указано в таблице 1. Фильтруйте и стерилизуйте все стандартные растворы с помощью фильтра 0,22 мкм, заверните в фольгу для защиты от легкой деградации и храните при 4 °C до одного месяца.
   2. Готовят буферное основание путем объединения 190 мл деионизированной воды с растворами аминокислот и солей по объемам, перечисленным в таблице 1. Отрегулируйте раствор до рН 6,8 и увеличьте до конечного объема 250 мл. Фильтруют-стерилизуют с помощью фильтра 0,22 мкм и хранят при 4 °C до 30 дней.
   3. Вечером перед экспериментом аликвотируйте нужное количество буферного основания в стеклянную культурную колбу и добавляйте муцин (5 мг/мл, как описано на этапе 1.1.1) и очищенную ДНК сперматозоидов лосося (0,6 мг/мл). Осторожно перемешать, завернуть в фольгу и оставить при 4 °C на ночь, чтобы муцин и ДНК растворились в растворе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты ДНК сперматозоидов лосося следует размораживать на льду, вихрь и добавлять в буферное основание и муцин. Растворы триптофана, аспарагина и тирозина необходимо готовить в растворах NaOH (см. таблицу 1 для концентраций) вместо деионизированной воды. Храните буферизованный фундамент и все склады растворов, обернутые в фольгу для защиты от воздействия света. Большинство акций будут стабильными до месяца. Запасы, которые обесцвечиваются, не должны использоваться и должны быть заменены перед использованием.
3. Добавление дополнительных запасов
   1. В день эксперимента добавьте запасы, перечисленные в таблице 2, к буферной основе, содержащей муцин и ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят свежий раствор FeSO₄ в день эксперимента, но все остальные запасы можно сделать заранее и хранить в течение 30 дней при 4 °C. 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC) содержит хлороформ. Относитесь с осторожностью и не используйте близкое открытое пламя. После добавления DOPC инкубируют SCFM2 при 37 °C с встряхиванием (250 об/мин) в течение не менее 20 мин (для культуры 5 мл). Этот инкубационный период позволяет хлороформу в DOPC испаряться. Колба не должна быть герметичной; вместо этого накройте отверстие колбы свободно фольгой.

2. Оценка толерантности к противомикробным препаратам в бактериальных агрегатах в режиме реального времени

1. Подготовка культур на ночь
   1. Вечером перед экспериментом привить 5 мл бульона LB несколькими колониями Pa PAO1-pMRP9-1¹³ из пластины агара LB, содержащей антибиотик (карбенициллин 300 мкг/мл). Расти в течение ночи при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивать ночные культуры с добавлением антибиотиков, необходимых для отбора необходимых плазмид (здесь плазмида экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP), pMRP9-1). Обратите внимание, что Па-клетки должны быть промыты перед инокуляцией SCFM2. LB может быть заменен другими богатыми лабораторными средами для ночных культур. Все бактериальные изоляты должны обрабатываться с использованием соответствующих руководящих принципов BSL-2 на протяжении всего этого протокола.
2. Инокулировать SCFM2
   1. В день эксперимента обратно разбавляют ночные культуры Па 1:10 (культура: жидкие среды) путем инокуляции 500 мкл в 5 мл свежего бульона LB. Выращивают клетки до логарифмической фазы (60-90 мин) при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин.
   2. Центрифуга log phase культуры при 10 000 × г в течение 5 мин. Промывайте клетки путем удаления супернатанта и повторного использования в 3 мл стерилизованного фильтром фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, pH 7,0). Повторите дважды и повторно суспендируют гранулу в конечном объеме 1 мл PBS.
   3. Измерьте абсорбируемость промытых клеток с помощью спектрофотометра при 600 нм (OD₆₀₀₎и рассчитайте объем культуры, необходимый для начального OD₆₀₀ 0,05 в 5 мл SCFM2. Инокулируют Па в SCFM2 и осторожно вихрь распределяют клетки по всему. Пипетка 1 мл инокулированного SCFM2 в каждую камеру 4-х скважин, стеклянного дна, оптической чашки и инкубировать в течение 4 ч статически при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время удвоения па-культур зависит от штамма и доступности кислорода. В SCFM2, в условиях, описанных здесь, время удвоения Pa составляет ~1,4 ч^10.

3. Визуализация агрегатов во время лечения антибиотиками с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается использование конфокального лазерного сканирующего микроскопа и программного обеспечения для захвата изображений для визуализации агрегатов Pa в SCFM2. Цель состоит в том, чтобы наблюдать и охарактеризовать оставшуюся (толерантную) бактериальную биомассу после лечения антибиотиками. Описанные шаги могут быть успешно выполнены на других конфокальных микроскопах, хотя руководство по эксплуатации прибора должно быть упомянуто для конкретного руководства.

1. Изображение культур Pa с использованием либо нагретой камеры, либо нагретой микропластины, установленной на сцене микроскопа, для поддержания температуры окружающей среды 37 °C. Запустите инкубационный модуль по меньшей мере за 2 ч до начала эксперимента, чтобы позволить всему аппарату достичь желаемой температуры и уменьшить дальнейшее расширение и движение во время сбора данных.
2. Через 4 ч перекладывать культуры SCFM2, содержащие Па-клетки, на стадию нагретого микроскопа. Назначьте 3 из 4 скважин в качестве технических реплик для лечения антибиотиками, а^4-ю скважину рассмотрите как необочевой контроль, содержащую только Па-клетки в SCFM2, без антибиотика. Идентифицируйте агрегаты с помощью микроскопии яркого поля на вкладке «Местоположение» перед любым возбуждением флуоресцентных репортеров. Определите область для визуализации в пределах каждой скважины и сохраните ее положение (координаты x-y-z) с помощью модуля «Позиции» в программном обеспечении для визуализации.
3. Используйте 63-кратный масляный объектив для визуализации культур Pa, содержащих плазмиду экспрессии GFP pMRP9-1 в SCFM2 с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны излучения 509 нм. Снимайте снимки с помощью опции z-stack в модуле Acquisition с интервалом 1 мкм (всего 60 фрагментов). Используйте модуль линейного усреднения для уменьшения фоновой флуоресценции в канале GFP в пределах общего объема изображений z-стека 60 мкм (1 093,5 мм^3). Получение контрольных изображений неинокулированного SCFM2 с использованием идентичных настроек для определения фоновой флуоресценции для анализа изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения получены путем создания 512 пикселей x 512 пикселей (0,26 мкм x 0,26 мкм пикселей) 8-битных изображений z-стека, которые находятся на 60 мкм от основания крышки.
4. Используйте опцию временных рядов в программном обеспечении для визуализации, чтобы захватить 60 срезов в каждом положении (скважине) с интервалом 15 минут в течение 18 часов. Используйте определенную стратегию фокусировки в программном обеспечении для хранения фокальной плоскости для каждой позиции, которая возвращается в каждую точку времени на протяжении всего эксперимента.
5. После в общей сложности 4,5 ч инкубации визуйте каждую позицию, используя вышеуказанные настройки, чтобы определить совокупную биомассу в каждой из четырех скважин до добавления антибиотика.
6. После 6 ч полной инкубации добавляют антибиотик в 2 раза ниже минимальной ингибирующей концентрации (МИК) к каждой реплике. Пипетка прямо и осторожно в середину колодца, чуть ниже воздушно-жидкой межфазы. Храните все культуры в отапливаемой конфокальной камере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовался колистина сульфат в концентрации 140 мкг/мл.
7. Начните визуализацию после лечения антибиотиками, нажав на опцию Начать эксперимент в программе визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая концентрация антибиотика зависит от антибиотика, изолята Па, и от того, хочет ли пользователь изучить убийственные или переносимые эффекты. В этом эксперименте используется одна доза. Дополнительные дозы могут быть добавлены без разрушения культур, если это необходимо.

4. Окрашивание йодида пропидия агрегатов Pa

ПРИМЕЧАНИЕ: Йодид пропидия (PI) обычно используется в качестве окрашивающего реагента для идентификации нежизнеспособных (мертвых) бактериальных клеток в культуре. Здесь он используется для выявления агрегатов, чувствительных к лечению антибиотиками, применяемым в разделе 3. На протяжении всего этого протокола экспрессия и обнаружение GFP в Па-клетках используется в качестве основного прокси для жизнеспособности клеток. Этот заключительный этап позволяет еще раз использовать конфокальную визуализацию для определения пространственного позиционирования живых/мертвых агрегатов по отношению друг к другу. Кроме того, агрегаты идентифицируются как живые/мертвые для дальнейшей последующей сортировки ячеек в разделе 5.

1. Через 18 ч добавляют PI в каждую скважину четырехкамерной оптической донных тарелок, содержащей культуры SCFM2. Следуйте инструкциям производителя по объему ПИ и времени инкубации(например,~2 мкл на мл культуры, ~20-30 мин).

5. Изоляция живых клеток от агрегатов с использованием подхода FACS

ПРИМЕЧАНИЕ: FACS представляет собой мощную платформу для сортировки и изоляции групп клеток в соответствии с флуоресцентно помеченным фенотипом. Здесь FACS используется для выделения живых (устойчивых к антибиотикам) агрегатов из нежизностных агрегатов.

1. После окрашивания йодидом пропидия удаляют культуры из инкубации и переносят на прибор FACS в изолированном контейнере для поддержания 37 °C.
2. Запустите 1 мл аликвот SCFM2, содержащих агрегаты Pa, с наименьшим расходом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая аликвота будет содержать ~15 000 агрегатов.
3. Чтобы обнаружить GFP, осветите ячейки лазером 488 нм и запишите высоту флуоресцентного сигнала на уровне 530/30 нм. Визуализируйте окрашивание PI путем возбуждения с помощью лазера 561 нм и запишите высоту флуоресцентного сигнала на уровне 610/20 нм. Выполните сортировку с помощью 70-еу сопла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отсортированные агрегаты могут быть объединены в пул несколькими способами в зависимости от приложения пользователя. В этом случае FACS использовался для сортировки жизнеспособных агрегатов Pa для последующего секвенирования РНК. Альтернативные приложения обсуждаются ниже.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Покадровая микроскопия генерирует большие объемы данных. 18-часовой эксперимент по наблюдению агрегатов Па в SCFM2 выявил ~50 000 агрегатов с течением времени, которые могут быть охарактеризованы для объемного и пространственного позиционирования. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки совокупной динамики в SCFM2:

1. Для агрегированных исследований в SCFM2 количественно оцените фоновую флуоресценцию GFP путем создания гистограммы количеств в канале GFP, которая производится для неинокуляционных SCFM2 и SCFM2, привитых штаммом Pa PAO1, несущим pMRP9-1. Чтобы убедиться, что обнаруженные вокселы GFP коррелируют с биомассой Pa, определите воксель GFP+ как ≥1,5x значения фонового количества GFP.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фоновая флуоресценция определяется как наибольшее значение вокселя из трех случайно выбранных позиций, усредненное. Количество фона, как стандартная мера, вычитается из всех пикселей экспериментальных изображений программным обеспечением для анализа изображений.
2. После вычитания фона в модуле Surpass создайте изоповерхности для всех оставшихся вокселей.
3. Чтобы обнаружить отдельные агрегаты, включите параметр «Разделенные объекты» и определите агрегаты как объекты с объемами ≥5 мкм³. Используйте модуль Vantage в программном обеспечении для анализа изображений для расчета объема, x-y-z и суммы вокселей GFP для каждого отдельного объекта. Экспортируйте эти данные на внешнюю статистическую платформу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые программы для анализа изображений позволяют экспортировать несколько количественных фентоайпов одновременно, что позволяет рассчитывать корреляции.
4. Фильтруйте данные, экспортируемые из модуля Vantage, по размеру, чтобы гарантировать, что не останется объектов <0,5^мкм3 (дисперсная биомасса). Для каждого отдельного объекта в пределах изображения рассчитайте расстояние от себя по отношению к другим объектам (агрегатам) с помощью модуля Vantage программного обеспечения для анализа изображений или вручную с помощью следующего уравнения.
   d = sqrt((x₂− x₁)² + (y₂− y₁)² + (z₂− z₁)²) (1)
5. Используйте расчеты SUM и AVERAGE, чтобы найти общую биомассу и средний совокупный объем. В качестве альтернативы можно экспортировать данные в другие статистические платформы или сценарии, например,распределение агрегатов по биомассе, как обсуждается в репрезентативных результатах (сценарий не опубликован в сотрудничестве с лабораторией Уайтли, Технологический институт Джорджии).

Results

В этой работе подробно описываются методы наблюдения агрегатов Па в высоком разрешении и в среде, аналогичной хронической инфекции^{легкого МВ 9,10,12.} SCFM2 обеспечивает систему in vitro, которая способствует естественной агрегации Па-клеток в размерах, аналогичных тем, которые наблюдаются во время фактической инфекции^10. Адаптивность SCFM2 в качестве определенной среды может быт...

Discussion

Эта работа представила методологии, которые могут быть объединены для изучения бактериальных совокупных популяций при наличии и отсутствии лечения антибиотиками. CLSM с высоким разрешением позволяет визуализировать изменения в совокупной биомассе и структурной ориентации агрегатов в режиме реального времени при воздействии антибиотиков. Кроме того, физические и структурные особенности биомассы, которые остаются после лечения антибиотиками, могут быть количественно определены с целью корреляции этих наблюдений с будущими ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Аминокислоты
Аланин	Acros Organics	56-41-7
Аргинин HCl	MP	1119-34-2
Аспарагин	Acros Organics	56-84-8	Приготовленный в 0,5 м NaOH
Цистин HCl	Альфа Aesar	L06328
Глутаминовая кислота HCl	Acros Organics	138-15-8
Глицин	Acros Organics	56-40-6
Гистидин HCl H2O	Alfa Aesar A17627
Изолейцин	Acros Organics	73-32-5
Лейцин	Alfa Aesar A12311
Лизин HCl	Alfa Aesar	J62099
Метионин	Acros Organics	63-68-3
Орнитин гидрохлорид	Альфа Аэсар	А12111
Фенилаланин	Акрос Органикс	63-91-2
	Пролин Альфа Аэсар	А10199
Серин	Альфа Аесар	А11179
Треонин	Акрос Органикс	72-19-5
Триптофан	Акрос Органикс	73-22-3	Приготовлено в 0,2 м NaOH
тирозин	Альфа Аесар	А11141	приготовлен в 1,0 м NaOH
валин	Акрос Органикс	72-18-4
антибиотик
карбенициллин	альфа аэсар	J6194903
день запасов
CaCl<суб>2 * 2H<суб>2О	Fisher Chemical	C79-500
Декстроза (D-глюкоза)	Fisher Chemical	50-99-7
1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC)	Фишер (Avanti Polar Lipids)	4235-95-4	встряхнуть 15-20 мин при 37 °°; C для выпаривания хлороформа
FeSO4 * 7H2O	Acros Organics	7782-63-0	этот запас равен 1 мг/мл, ДОЛЖЕН сделать свежую
L-молочную кислоту	Alfa Aesar	L13242	запас pH до 7 с NaOH
MgCl2 * 6H2O	Acros Organics	7791-18-6
N-ацетилглюкозамин	TCI	A0092
Готовые твердые вещества
Свиной муцин	Sigma	M1778-100G	УФ-стерилизация
Сперма лосося ДНК	Invitrogen	15632-011
Краситель
Пропидиум йодид	Альфа Аэсар	J66764MC
солей
K2SO4	Alfa Aesar Aesar A13975
KCl	Alfa Aesar	J64189	добавить твердое вещество непосредственно в буферное основание
KNO3	Acros Organics	7757-79-1
MOPS	Alfa Aesar A12914		добавить твердое вещество непосредственно в буферное основание
NaCl	Fisher Chemical	S271-500	добавить твердое вещество непосредственно в буферизованное основание
Na2HPO4	RPI	S23100-500.0
2PO4	RPI	S23120-500.0
NH4Cl	Acros Organics	12125-02-9	добавляйте твердое вещество непосредственно в буферизованное основание
Расходные материалы
Конические пробирки (15 мл)	Olympus plastics	28-101
Конические пробирки (50 мл)	Olympus plastics	28-106
Пробирки для культивирования с крышкой воздушного	потока Olympus plastics	21-129
35 мм четырехкамерная чашка со стеклянным дном	CellVis	NC0600518
Luria Bertani (LB) бульон	Genessee Scientific	11-118
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Биореагенты Fisher	BP2944100
наконечники для пипеток (p200)	Пластмассы Olympus	23-150RL
Наконечники для пипеток (p1000)	Пластмассы Olympus	23-165RL
Серологические пипетки (5 мл)	Пластмассы Olympus	12-102
Серологические пипетки (25 мл)	Пластмассы Olympus	12-106
Серологические пипетки (50 мл)	Olympus plastics	12-107
Сверхчистая вода (без РНКазы/ДНКазы); наночистая вода	Genessee Scientific	18-194	Наночистая вода, используемая для приготовления растворов в таблице 1
Шприцы (10  mL)	BD	794412
Шприцы (50 мл)	BD	309653
0,22 мм PES шприцевой фильтр	Olympus plastics	25-244
PS кювета полумико	Olympus plastics	91-408
Программное обеспечение
Biorender			Для подготовки фигурок
FacsDiva6.1.3	Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния
Imaris	Bitplane		версия 9.6
Zen Black
Оборудование
FacsAriallu	Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния
LSM 880 конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Zeiss