Профилирование летучих соединений в плодах черной смородины с использованием твердофазной микроэкстракции в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией

Вкус является важной чертой качества для любого фрукта, влияя на принятие потребителями и, таким образом, значительно влияя на конкурентоспособность. Восприятие вкуса включает в себя сочетание вкусовой и обонятельной систем и химически зависит от наличия и концентрации широкого спектра соединений, которые накапливаются в съедобных частях растений или, в случае ЛОС, выделяются спелыми ^{плодами1,2}. В то время как традиционная селекция была сосредоточена на агрономических признаках, таких как урожайность и устойчивость к вредителям, улучшение качества фруктов, включая вкус, долгое время игнорировалось из-за генетической сложности и трудности правильного фенотипирования этих характеристик, что приводит к недовольству ^{потребителей3,4}. Последние достижения в области метаболомных платформ были успешными в выявлении и количественной оценке ключевых соединений, ответственных за вкус и аромат фруктов5,6,7,8. Кроме того, сочетание профилирования метаболитов с геномными или транскриптомными инструментами позволяет прояснить генетику, лежащую в основе фруктового аромата, что, в свою очередь, поможет селекционным программам разрабатывать новые сорта с улучшенными органолептическими характеристиками2,4,9,10,11,12,13,14.

Ягоды черной смородины (Ribes nigrum) высоко ценятся за их вкус и питательные свойства, широко культивируемые в умеренных зонах Европы, Азии и Новой ^{Зеландии15}. Большая часть продукции перерабатывается для пищевых продуктов и напитков, которые очень популярны в скандинавских странах, в основном из-за органолептических свойств ягод. Интенсивный цвет и вкус фруктов являются результатом сочетания антоцианов, сахаров, кислот и ЛОС, присутствующих в спелых плодах16,17,18. Анализ летучих веществ черной смородины восходит к 1960-м ^{годам19,20,21}. Совсем недавно несколько исследований были сосредоточены на ЛОС черной смородины, выявлении важных соединений для восприятия аромата фруктов и оценке влияния генотипа, окружающей среды или условий хранения и обработки на содержание ЛОС5,17,18,22,23.

Из-за своих многочисленных преимуществ методом выбора для высокопроизводительного летучего профилирования является HS-SPME/^GC-MS24,25. Кремнеземное волокно, покрытое полимерной фазой, монтируется на шприцевом устройстве, что позволяет адсорбировать летучие вещества в волокне до достижения равновесной фазы. Экстракция из пространства над головой защищает волокно от энергонезависимых соединений, присутствующих в ^{матрице24}. SPME может успешно изолировать большое количество ЛОС, присутствующих в сильно варьирующихся концентрациях (от частей на миллиард до частей на миллион)²⁵. Кроме того, это метод без растворителей, который требует ограниченной обработки образцов. Другими преимуществами HS-SPME являются простота автоматизации и ее относительно низкая стоимость.

Однако его успех может быть ограничен в зависимости от химической природы ЛОС, протокола экстракции (включая время, температуру и концентрацию соли), стабильности пробы и наличия достаточного количества плодовой ^{ткани26,27}. В данной статье представлен протокол для ЛОС черной смородины, выделенных HS-SPME и проанализированных газовой хроматографией в сочетании с масс-спектрометром ионной ловушки. Был достигнут баланс между количеством растительного материала, стабильностью образца и продолжительностью экстракции и хроматографии, чтобы иметь возможность обрабатывать большое количество образцов черной смородины, некоторые из которых представлены в этом исследовании. В частности, в качестве примеров данных будут представлены и обсуждены профили ЛОС и/или хроматограммы пяти сортов ("Андега", "Бен Трон", "Бен Гэрн", "Бен Тирран" и "Тихоуп"). Кроме того, этот же протокол был успешно внедрен в практику для измерения ЛОС у других видов фруктовых ягод, таких как клубника (Fragaria x ananassa), малина (Rubusidaeus) и черника (Vaccinium spp.).

1. Сбор фруктов

1. Выращивайте от 4 до 6 растений на генотип и /или обработку, чтобы обеспечить достаточный плодовой материал и изменчивость.
2. Если возможно, соберите образцы в тот же день; если фруктового материала недостаточно, объедините образцы, собранные в разные даты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы время сбора урожая (утро, полдень, вторая половина дня) оставалось примерно идентичным, поскольку на профили ЛОС влияет дневной/циркадный ^{ритм28,29,30,31}.
3. Оцените стадию созревания плодов путем визуального ^{наблюдения32}. Пул плодов из одной и той же стадии созревания, поскольку статус созревания сильно влияет на выбросы ЛОС. Выбросьте любые поврежденные или зараженные патогеном фрукты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей оценки спелости плодов можно выполнить анализ ^{текстуры33}. Кроме того, подсчет дней после цветения может быть использован для того, чтобы объединенные плоды принадлежали к аналогичной стадии созревания.
4. Включите минимум 10-15 плодов на биологическую реплику (от 3 до 5) для анализа ЛОС.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь три отдельных бассейна из 13-20 плодов (биологических реплик) сортов 'Andega', 'Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran' и 'Tihope' были собраны в двух местах (Польша и Шотландия) летом 2018 года и непосредственно заморожены в жидком азоте. Затем образцы были отправлены в лабораторию и обработаны, как описано ниже.
5. После сбора урожая заморозьте все плоды сразу в жидком азоте, а затем храните их при -80 °C до обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, плоды могут быть непосредственно обработаны после сбора урожая. В этом случае свежие фрукты могут быть гомогенизированы в миксере, взвешены и непосредственно проанализированы (шаг 3.1 и далее). Однако, чтобы предотвратить плоды от дальнейших послеуборочных деградационных процессов, свежий материал следует хранить в охладителе (4 °C) и обрабатывать как можно быстрее. При неправильном обращении жидкий азот может вызвать холодные ожоги и вызвать удушье в плохо проветриваемых помещениях.

2. Подготовка образцов фруктов и реагентов

1. Измельчите плоды в мелкий порошок, заботясь о том, чтобы всегда держать их замороженными с помощью жидкого азота. Используйте криогенную мельницу, бисероплетение или ступку и пестик для гомогенизации. Предварительно холодные нержавеющие шлифовальные банки или ступка и пестик с жидким азотом, чтобы избежать размораживания образцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно гомогенизировать образцы в мелкодисперсный порошок, чтобы обеспечить надлежащую экстракцию ЛОС.
2. Взвесьте 1 г замороженного материала (из стадии 2.1.) в пробирке объемом 5 мл, которая предварительно охлаждается в жидком азоте, и обратите внимание на точный вес. Держите материал при температуре -80 °C до этапа обработки 3.1.
3. Включите в анализ «эталонные» или «контрольные» образцы для проверки технических вариаций, включая извлечение ЛОС и производительность HS-SPME/GC-MS. Для этого объедините смесь случайно выбранных образцов фруктов и включите по меньшей мере один контрольный образец в день для анализа ЛОС. Кроме того, используйте внутренний стандарт, как описано на этапе 2.5, для сведения к минимуму воздействия дрейфа интенсивности.
4. Готовят 20% (мас./об.) раствор натрия хлорида в высокоэффективной воде класса жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (далее именуемой раствором NaCl). Растворяют NaCl с помощью магнитной мешалки; обеспечить наличие 1 мл раствора на образец.
5. Готовят 1 ppm раствор в метаноле класса ВЭЖХ N-пентадекана (D32, 98%) из чисто коммерческого стандарта (далее именуемого внутренним стандартом).
   ПРИМЕЧАНИЕ: N-пентадекан-d32 будет использоваться в качестве внутреннего стандарта, и потребуется 5 мкл на образец. Метанолом следует манипулировать под дымовым капотом.
6. Подготовка 1 ppm раствора в метаноле класса ВЭЖХ чистых коммерческих стандартов для идентификации ЛОС (см. Таблицу 1 для перечня коммерческих стандартов, используемых в настоящем исследовании).
7. Приготовьте флаконы с завинчивающейся крышкой 10 мл, добавив 0,5 г NaCl в каждый необходимый флакон. Убедитесь, что винтовые колпачки включают перегородку, состоящую из мягкого материала, то есть силикона, с тонкой политетрафторэтиленовой пленкой на внутренней стороне, чтобы избежать загрязнения.

3. Пробоподготовка

1. Добавьте 1 мл раствора NaCl в пробирку объемом 5 мл, содержащую взвешенный замороженный образец. Встряхните пробирку до тех пор, пока образец полностью не разморозится и не гомогенизируется.
2. Центрифуга при 5000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Перенесите супернатант с наконечником пипетки объемом 1000 мкл во флакон с NaCl-содержащим пространство для головы. Вырежьте конец наконечника, чтобы облегчить этот процесс.
4. Добавьте 5 мкл внутреннего стандарта к каждому флакону, содержащему образец.

4. Сбор данных HS-SPME/GC-MS

1. Поместите флакон с закрытым пространством над головой в автопробоотборник GC-MS при комнатной температуре для автоматического запуска HS-SPME/GC-MS, который описан в разделе 4. Не размещайте биологические реплики в последовательных положениях в автопробоотборнике; вместо этого распределите их случайным образом, чтобы свести к минимуму влияние дрейфа интенсивности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 10-12 флаконов могут быть помещены одновременно в автопробоотборник, не влияя на стабильность образца.
2. Предварительно продублируйте флаконы с пространством над головой через 10 мин при 50 °C с перемешиванием при 17 х г.
3. Вставьте устройство SPME во флакон, чтобы подвергнуть волокно наддуву для экстракции ЛОС в течение 30 мин при 50 °C с перемешиванием при 17 х г.
4. Вводят волокно в порт впрыска в течение 1 мин при 250 °C в бесплитном режиме для летучей десорбции.
5. Очистите волокно на станции очистки SPME азотом (1 бар _N2, ≥ 99,8% чистоты) в течение 5 минут при 250 °C. Повторно используйте волокно примерно в 100 раз.
6. Анализ ЛОС с помощью газового хроматографа, соединенного с масс-спектрометром ионной ловушки (см. Таблицу материалов), и выполнение хроматографии при постоянном потоке гелия (он ≥ чистотой 99,9999%) 1 мл/мин, с колонкой толщиной 60 м х 0,25 мм х 1 мкм. Используйте температурную программу духовки, которая является изотермической при 40 °C в течение 3 минут, затем рампа 8 °C / мин до 250 ° C и выдержка при 250 ° C в течение 5 минут. Для масс-спектрометрии установите температуру передаточной линии и источника ионов на уровне 260 °C и 230 °C соответственно. Установите энергию ионизации на 70 эВ и зарегистрированный диапазон масс на м/з 35-220 при 6 сканировании в с.
7. Извлеките и проанализируйте 1 ppm раствора коммерческих стандартов, как описано выше. Кроме того, перед получением пробы запустите смесь, содержащую все разбавленные коммерческие стандарты, смешанные с раствором NaCl 300 мкл и водой класса ВЭЖХ 900 мкл, чтобы проверить правильную калибровку оборудования. Кроме того, включите в каждую партию пустой образец, содержащий только раствор NaCl.

5. Анализ хроматограмм профиля GC-MS: идентификация ЛОС и полукватинификация

1. Откройте необработанные файлы профиля GC-MS с помощью программного обеспечения, предоставленного производителем. Для идентификации соединений сравните время их удержания и масс-спектры и линейные показатели удержания Коваца, определенные по хроматограммам образцов, с показателями удержания, полученными из аутентичных эталонов. Для каждого коммерческого стандарта аннотируйте время удержания и наиболее распространенные ионы m/z . Затем выберите определенный m/z ион для каждого ЛОС (таблица 1).
2. Автоматическая интеграция пиков ЛОС на основе стандартного времени удержания и выбранных m/z ионов выбранных необработанных файлов GC-MS. Для этого предоставьте список для каждого ЛОС со временем удержания и выбранным ионом m/z . Хотя программное обеспечение автоматически интегрирует пиковую область, соответствующую тому же времени удержания и иону м/з , как указано в настройке последовательности, проверьте правильную интеграцию каждого пика и при необходимости исправьте его вручную.
3. Рассчитайте пиковую площадь каждого ЛОС относительно площади внутреннего стандарта, чтобы свести к минимуму инструментальные изменения и дрейф интенсивности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе плодов различных генотипов или условий роста и хранения настоятельно рекомендуется определять содержание ЛОС по отношению к содержанию сухого веса плодов, чтобы исключить эффекты разбавления из-за различий в содержании воды.
4. Для коррекции пакетного эффекта нормализуйте пиковую область ЛОС каждого образца до соответствующей пиковой области в контрольном образце, проанализированном в том же прогоне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Получена относительная количественная оценка ЛОС; однако для целей эксперимента содержание ЛОС может быть затем определено относительно любого образца (например, необработанных плодов для сравнения влияния хранения на уровни ЛОС).

Для точного аромафенотипирования необходимо высокопроизводительное профилирование ЛОС в большом наборе плодовых культур, выращенных в различных условиях или местах или принадлежащих к различным генотипам. Здесь представлена быстрая и полуавтоматизированная платформа HS-SPME/GC-MS для относительной количественной оценки ЛОС в сортах черной смородины. Обнаружение и идентификация ЛОС были основаны на библиотеке, которая была разработана для профилирования видов ягодных фруктов (таблица 1). Типичный спелый летучий профиль плодов черной смородины (общая ионная хроматограмма), полученный HS-SPME/GC-MS в вышеупомянутых условиях, показан на рисунке 1А. В общей сложности было идентифицировано 63 ЛОС, принадлежащих к нескольким химическим классам, большинство из которых являются эфирами (27), альдегидами (12), спиртами (8), кетонами (7), терпенами (5) и фуранами (3) (таблица 1).

Было описано, что терпеноидные соединения, сложные эфиры и соединения C6 доминируют в волатиломе черной смородины и важны для аромата свежих фруктов5,17. В соответствии с этими предыдущими исследованиями, некоторые из наиболее распространенных пиков, наблюдаемых на рисунке 1А, соответствуют двум монотерпенам (линалоол и терпинеол) и двум соединениям C6 ((E)-2-гексеналь и (Z)-3-гексеналь). Примеры масс-спектров, полученных из профилей черной смородины, и их сравнение со спектрами чистых коммерческих эталонов показаны для (Е)-2-гексенала и терпинеола на Фиг.1В и Фиг.1С соответственно.

Рисунок 1: Репрезентативные хроматограммы из спелых плодов черной смородины, полученные HS-SPME/GC-MS (из сорта 'Andega'). (A) Общая ионная хроматограмма. (Z)-3-гексенальный (время удержания 14,33 мин), (E)-2-гексенальный (15,86 мин), линалоол (21,65 мин) и терпинеол (24,01 мин) пики обозначаются числами 1, 2, 3 и 4 соответственно. (B) Масс-спектр, соответствующий (E)-2-гексенальному пику из профиля черной смородины и сравнение с чистым коммерческим стандартом. (C) Масс-спектр, соответствующий пику терпинеола из профиля черной смородины и сравнение с чистым коммерческим стандартом. Аббревиатура: HS-SPME/GC-MS = твердофазная микроэкстракция пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В то время как терпены были изображены как индикаторы свежести плодов черной смородины, соединения C6 известны как «летучие вещества зеленых листьев», придавая «зеленые» ноты фруктовому и овощному аромату34. Таким образом, полукватерификация этих ЛОС, выделяемых спелыми плодами различных сортов черной смородины, может стать первым шагом в улучшении вкусовых признаков. Кроме того, поскольку окружающая среда и условия роста растений сильно влияют на содержание лос в плодах, что является одним из основных недостатков для аромабридирования, одной из целей этого исследования было подтверждение гипотезы о том, что полукватерификация идентифицированных ЛОС в тех же сортах («Бен Трон», «Бен Гэрн», «Бен Тирран» и «Тихоуп») была воспроизводимой в диаметрально противоположных европейских местах, таких как Польша и Шотландия. Как и ожидалось, анализ главных компонентов (PCA) профилей ЛОС четырех различных сортов черной смородины показал, что окружающая среда сильно влияет на содержание летучих веществ, поскольку основной компонент (ПК) 1 разделяет образцы на основе их местоположения (рисунок 2). Тем не менее, эффект генотипа можно наблюдать с PC2, так как 'Ben Tirran' четко отделен от остальных сортов (рисунок 2).

На рисунке 3 показано относительное содержание линалоола и (Е)-2-гексенала в четырех оцененных сортах черной смородины. Для обоих мест содержание ЛОС было нормализовано до одного и того же контрольного образца, для которого полуквантовая оценка подтвердила, что содержание линалоола в Польше, как правило, выше, чем в Шотландии, тогда как (E)-2-гексеналь показывает противоположную тенденцию (рисунок 3). Этот результат демонстрирует воздействие на окружающую среду содержания ЛОС в плодах черной смородины, хотя доля двух летучих веществ, присутствующих в четырех оцененных сортах, была постоянной, причем сорта "Бен Тирран" и "Бен Трон" показали наибольшее количество линалоола и (Е)-2-гексенала, соответственно (рисунок 3). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что предложенный метод действителен к содержанию ФЕНОтипа ЛОС и в сочетании с генетическими подходами может быть использован с целью селекции качества плодов.

Рисунок 2: PCA для оценки дисперсии между профилями ЛОС в четырех сортах черной смородины, выращенных в Польше и Шотландии. PC1 (окружающая среда) объясняет 46,2% изменчивости, в то время как PC2 (генотип) вносит 24,8% дисперсии в набор данных. Сокращения: PCA = анализ главных компонентов; PC1 = первый основной компонент; PC2 = второй основной компонент; ЛОС = летучее органическое соединение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Относительное содержание двух репрезентативных ЛОС в аромапрофилях черной смородины - линалоол и (Е)-2-гексеналь, собранных в Шотландии и Польше. Были оценены четыре различных сорта черной смородины («Бен Гэрн», «Бен Тирран», «Бен Трон» и «Тихоуп»). Столбцы представляют средние значения двух биологических реплик, а полосы ошибок представляют стандартное отклонение. Статистические сравнения проводились с помощью одностороннего ANOVA, за которым последовал пост-специальный тест Туки для определения значительных различий в содержании ЛОС между сортами и странами. Для содержимого ЛОС с одинаковыми строчными буквами (a, ab, b) не наблюдалось существенных различий при P < 0,05. Сокращения: ЛОС = летучие органические соединения; ANOVA = дисперсионный анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Перечень ЛОС, идентифицированных HS-SPME/GC-MS в плодах черной смородины. Указывается время удержания (мин), выбранный м/з ион для идентификации и полуквафинификации ЛОС, описание аромата, химический класс и формула, а также номер CAS. Сокращения: HS-SPME/GC-MS = твердофазная микроэкстракция пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией; ЛОС = летучие органические соединения; КРИ = индекс удержания Коваца; Номер CAS = регистрационный номер службы рефератов по химическим веществам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.