Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка гомогенатов скелетных мышц крыс для измерения нитратов и нитритов

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62427

⸱

29 июля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, 2Sport and Health Sciences, College of Life and Environmental Sciences, St Luke’s Campus, University of Exeter

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протоколы для трех различных методов гомогенизации четырех различных групп мышц скелетной мышечной ткани крыс для измерения и сравнения уровней нитратов и нитритов. Кроме того, мы сравниваем различные веса образцов, чтобы выяснить, влияет ли размер образца ткани на результаты гомогенизации.

Аннотация

Ионы нитратов (NO3-) когда-то считались инертными конечными продуктами метаболизма оксида азота (NO). Тем не менее, предыдущие исследования показали, что ионы нитратов могут быть преобразованы обратно в NO у млекопитающих с помощью двухэтапного механизма восстановления: нитрат восстанавливается до нитритов (NO2-) в основном пероральными комменсальными бактериями, а затем нитрит восстанавливается до NO несколькими механизмами, в том числе с помощью белков, содержащих гем или молибден. Этот восстановительный нитратный путь способствует усилению NO-опосредованных сигнальных путей, особенно в сердечно-сосудистой системе и во время мышечных упражнений. Уровни нитратов в организме до такого использования определяются двумя различными источниками: эндогенным окислением NO и потреблением нитратов с пищей, главным образом из растений. Чтобы прояснить сложный цикл NO в физиологических условиях, мы дополнительно изучили динамику его метаболитов, нитратов и нитрит-ионов, которые относительно стабильны по сравнению с NO. В предыдущих исследованиях скелетные мышцы были идентифицированы как основной орган хранения ионов нитратов у млекопитающих, а также как прямой источник NO во время физических упражнений. Поэтому создание надежной методологии измерения уровней нитратов и нитритов в скелетных мышцах важно и должно быть полезно для расширения ее применения на другие образцы тканей. В этой статье подробно объясняется подготовка образцов скелетных мышц с использованием трех различных методов гомогенизации для измерения нитратов и нитритов и обсуждаются важные вопросы, связанные с процессами гомогенизации, включая размер образцов. Концентрации нитратов и нитритов также сравнивались по четырем различным группам мышц.

Введение

Оксид азота (NO), небольшая газообразная сигнальная молекула, играет решающую роль в физиологических и патофизиологических процессах1. NO может быть продуцирован из L-аргинина эндогенными ферментами семейства синтазы оксида азота (NOS) до быстрого окисления до нитрата (NO3-) и, возможно, нитрита (NO2-) в крови и тканях 2,3. Недавно было показано, что эти анионы восстанавливаются обратно до NO в системахмлекопитающих 4. Нитрат превращается в нитрит, главным образом, комменсальными бактериальными нитратредуктазами в полости рта, действующими на ионы, выделяемые слюнными железами и непосредственно поглощаемые 5, и в некоторой степени ферментами млекопитающих, такими как ксантиноксидоредуктаза 6,7. Нитрит может быть дополнительно восстановлен до NO несколькими механизмами, включая дезоксигемоглобин8, дезоксимиоглобин9, молибденсодержащие ферменты10 и неферментативное восстановление в присутствии протонов11,12.

Этот путь нитрат-нитрит-NO усиливается в гипоксических условиях, в которых активность NOS уменьшается, потому что NOS требует кислорода для no generation4. Во многих недавних исследованиях сообщалось о благотворном влиянии диетических нитратов на регуляцию артериального давления и физическую активность, предполагая, что пути снижения нитратов способствуют увеличению передачи сигналов NO 13,14,15. Предыдущие исследования показали, что некоторые скелетные мышцы, вероятно, являются основными местами хранения нитратов в организме16. По сравнению с кровью или другими внутренними органами, такими как печень, скелетные мышцы (ягодичная мышца) содержат значительно более высокие уровни нитратов и имеют значительную массу в организме млекопитающих. Было показано, что упражнения на беговой дорожке усиливают снижение нитратов до нитритов и до NO в ягодичной мышце у крыс в модели7. Эти результаты подразумевают, что некоторые скелетные мышцы могут быть важными источниками NO через пути снижения нитратов в физиологических ситуациях. Более поздние исследования показывают, что эти результаты, включая изменения уровня мышечных нитратов во время физических упражнений, также происходят у людей17.

Два из нынешних авторов ранее установили метод измерения уровней нитратов и нитритов в крови и других жидких образцах18. Однако, когда уровни этих анионов в тканевых гомогенатах были первоначально проанализированы, подробные протоколы были недоступны. Чтобы понять динамику нитрат-нитрит-НЕТ в нескольких различных органах, наша цель состояла в том, чтобы разработать точный и эффективный метод измерения уровней нитратов и нитритов в тканях млекопитающих, включая скелетные мышцы. В более ранних исследованиях ткани грызунов использовались для разработки надежных процессов гомогенизации, а затем анализа содержания нитратов и нитритов в этих гомогенатах 7,16,19. Использование этого метода гомогенизации было распространено на образцы биопсии скелетных мышц человека, в результате чего значения были подтверждены, и, что важно, значения, наблюдаемые для мышц по сравнению с кровью / плазмой, были в аналогичных диапазонах и соотношениях с теми, которые наблюдались у грызунов17. В последние годы другие группы также начали измерять уровни нитратов и нитритов в гомогенатах скелетных мышц, сообщая о сопоставимых значениях с теми, о которых сообщила наша группа20,21.

Целью данной протокольной работы является подробное описание получения гомогенатов скелетных мышц с использованием трех различных методов гомогенизации для последующего измерения уровней нитратов и нитритов. Кроме того, изучалось влияние массы тканей, используемой для гомогенизации, на значения нитратов и нитритов в образцах скелетных мышц. Мы считаем, что эти методы могут быть легко применены к другим типам тканей млекопитающих. В последнее время, особенно в области физиологии физических упражнений, внимание было уделено возможным различиям в физиологии нитратов/нитритов/NO в зависимости от групп мышц. Мы также сообщаем о количестве нитратов и нитритов в четырех различных мышцах грызунов и находим неравномерное распределение обоих ионов между этими различными мышцами; наблюдение, требующее дальнейшего изучения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол для животных был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных NIDDK (ASP K049-MMB-20). Животные обрабатывались и лечились в соответствии с действующим Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, свободно доступным на веб-сайте AAALAC.

1. Коллекция скелетных мышц крыс

  1. Пока крыса находится под глубокой анестезией (5% изофлурана, подтвержденная отсутствующей реакцией на защемление хвоста / ноги), начните перфузию физиологическим раствором, содержащим гепарин, поместив иглу 19 г в вершину левого желудочка и сделав кольца на правом предсердии. Дайте физиологическому раствору с гепарином перфузиться через внутренние органы до тех пор, пока через ткань не пройдет не менее 1,5 литра / кг. В этот момент животные мертвы от экссангинации, а туши готовы к обработке для сбора образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Достижение хорошей перфузии имеет решающее значение, особенно для точных измерений нитритов, потому что нитрит окисляется в нитраты любым оставшимся гемоглобином.
  2. Определите целевые мышечные ткани и иссечение их из задних ног22 с помощью чистых хирургических инструментов. Удалите как можно больше жира и соединительных тканей из мышечных тканей.
  3. Поместите нужное количество мышц в микроцентрифужную трубку, а затем поместите на сухой лед. Храните тюбики, заполненные тканью, в морозильной камере -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае образцов биопсии человека, тщательно промойте их сразу после сбора чистой марлей, чтобы удалить лишнюю кровь.

2. Подготовка к гомогенизации

  1. Приготовление нитритсодержащего раствора (стоп-раствора)
    1. Готовят прозрачный желтый раствор, содержащий 890 мМ феррицианида калия (K3Fe(CN)6) и 118 мМ NEM (N-этилмалеймид) в дистиллированной воде, обеспечивая отсутствие кристаллов. Добавьте неионное поверхностно-активное вещество (моющее средство) в соотношении 1:9 (v/v, таблица материалов) и аккуратно перемешайте, чтобы избежать вспенивания.
    2. Стоп-раствор разбавить в соотношении 1:9 дистиллированной водой. Поместите разбавленный стоп-раствор (соотношение мышечной ткани 1:5 к разбавленному стоп-раствору) в гомогенизационную трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двадцать миллиграммов ткани потребуют 100 мкл стоп-раствора, а 200 мг ткани потребуют 1000 мкл стоп-раствора в пробирке. Наличие моющего средства в добавленном растворе имеет решающее значение для разрушения клеточных мембран. Можно использовать любое неионное моющее средство, но необходимо позаботиться о том, чтобы убедиться, что оно не мешает методу хемилюминесценции.
  2. Подготовка тканей
    1. Выньте ткань из морозильной камеры при температуре -80 °C и медленно оттаивайте во льду. Удалите оставшийся жир и соединительную ткань из скелетной мышцы. Отрежьте кусочки скелетных мышц и промокайте на марле, чтобы высохнуть.
    2. Взвесьте количество ткани (20, 50 и 200 мг). Поместите предварительно взвешенную скелетную мышцу в стоп-раствор в гомогенизационных трубках или поместите предварительно взвешенную ткань в чистую микроцентрифужную трубку для последующего использования.

3. Гомогенизация

  1. Роторный гомогенизатор (рисунок 1)
    1. Поместите в машину трубку М-типа, содержащую предварительно взвешенную скелетную мышцу и предварительно измеренный стоп-раствор. Гомогенизируйте каждый образец дважды (установив наиболее разрушительный цикл гомогенизации) и поместите трубку на лед сразу после каждой гомогенизации в течение 5 минут для охлаждения.
    2. Центрифугируют кратковременно при 2000 × г и 4 °C в течение 5 мин. Поместите полный тюбик обратно на лед и добавьте соответствующий объем метанола (≥ 99,9 %, 10x веса ткани). Вихрь тщательно в течение 15 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 20 мг ткани используйте 200 мкл метанола. Метанол используется для осаждения белков из тканевого гомогената и не препятствует методу хемилюминесценции. Если используется другой метод осаждения белка, проверьте его совместимость с хемилюминесценцией.
    3. Еще раз гомогенизировать и инкубировать на льду в течение 30 мин. Центрифугирование образцов в течение 35 мин при 4 °C и 3 500 × г. Аспирируйте супернатант и измеряйте уровни нитритов/нитратов или храните при -80 °C для последующего использования.
  2. Гомогенизатор бусин (рисунок 2)
    1. Поместите скелетную мышечную ткань в шарикодержащую трубку (соотношение 1:5 для ткани: разбавленный стоп-раствор) и гомогенизируйте дважды в течение 45 с на самой высокой скорости, доступной на используемом инструменте. Поместите трубку на лед сразу после каждой гомогенизации на 5 мин для охлаждения.
    2. Кратковременно центрифугировать с помощью небольшой настольной центрифуги (2 000 x g) в течение 5 секунд. Поместите трубку обратно на лед и добавьте соответствующий объем метанола (чистота ≥ 99,9 %, 10x веса ткани). Вихрь тщательно в течение 15 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ 1: Для 20 мг ткани используйте 200 мкл метанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ 2: Метанол используется для осаждения белков из тканевого гомогената и не препятствует методу хемилюминесценции. Если используется другой метод осаждения белка, проверьте его совместимость с хемилюминесценцией.
    3. Гомогенизируйте еще раз в течение 45 с на самой высокой скорости, доступной на используемом инструменте. Инкубировать на льду в течение 30 мин. Центрифуга при 17 000 х г, 4 °C, 30 мин. Аспирируйте супернатант и измеряйте уровни нитритов/нитратов или храните при -80 °C для последующего использования.
  3. Измельчитель (рисунок 3)
    1. Подготовьте пробирки, содержащие разбавленный стоп-раствор (в 5 раз больше массы ткани) и взвесьте их. Запишите вес (трубка + стоп-раствор).
    2. Поместите инструмент для измельчения жидкого азота на сухой лед и подождите примерно 30 минут, пока он достигнет нужной температуры.
    3. Используя пинцет, охлажденный жидким азотом, перенесите один образец (вес ткани уже измерен) в пульверизатор. Добавьте небольшую ложку жидкого азота, чтобы убедиться, что ткань находится при температуре жидкого азота.
    4. После того, как 95% жидкого азота испарится, поместите дробильный инструмент поверх ткани и плотно надавите. Вы должны почувствовать раздавливание образца. С помощью молотка ударьте дробильным инструментом в 3-5 раз.
    5. Проверьте образец на наличие оставшихся кусков с помощью ложки, охлажденной жидким азотом. После охлаждения в жидком азоте используйте лист папиросной бумаги, чтобы протереть замерзшую воду, прежде чем прикасаться к ткани. Если кусок присутствует, переместите его в центр, а затем ударьте молотком еще 5-6 раз.
    6. Когда весь образец будет измельчен, используйте ложку с жидким азотным охлаждением для непосредственного переноса измельченной ткани в предварительно взвешенную трубку, содержащую разбавленный стоп-раствор (этап 3.3.1). Обязательно выполняйте этот шаг быстро, так как когда раздавленная скелетная мышца нагревается, она становится липкой и трудно переносимой.
    7. Вихрь на 15 с. Убедитесь, что никакая ткань не застряла в верхней части трубки, открыв трубку. Если есть, попробуйте выбить его, а затем снова вихрь.
    8. Центрифугирование образца в течение 2-3 с с помощью небольшой настольной центрифуги. Еще раз взвесьте трубку. Рассчитайте вес ткани, вычитая исходный вес трубки (шаг 3.3.1) из этого нового веса. Поместите трубку на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точные веса помогут определить точный вес ткани и то, сколько ткани было потеряно во время измельчения.
    9. После того, как все образцы были обработаны до этапа 3.3.8, добавьте соответствующий объем метанола (≥ 99,9%, 10x веса ткани). Тщательно вихрь в течение 15 с, и насиживайте на льду в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 20 мг ткани используйте 200 мкл метанола. Метанол используется для осаждения белков из тканевого гомогената и не препятствует методу хемилюминесценции. Если используется другой метод осаждения белка, проверьте его совместимость с хемилюминесценцией.
    10. Центрифуга при 17 000 × г, 4 °C, 30 мин. Аспирируйте супернатант и измеряйте уровни нитритов/нитратов или храните при -80 °C для последующего использования.

4. Измерение нитрит/нитрат с помощью анализатора оксида азота (NOA)

  1. Подготовьте все образцы одним из трех различных методов гомогенизации, описанных выше, и введите их в NOA для измерения нитратов и нитритов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные протоколы для использования NOA были опубликованы ранее19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для получения репрезентативных результатов использовали скелетные мышечные ткани у 8 крыс Wistar (самцов и самок, вес 250 ± 50 г). Гомогенаты скелетных мышц крыс (50 мг ягодичной мышцы для каждого метода) получали тремя различными инструментами гомогенизации (роторный гомогенизатор, гомогенизатор бусин и измельчитель). Содержание нитратов и нитритов в этих гомогенатах затем определяли с помощью анализатора оксида азота (NOA) (рисунок 4). Уровни нитратов (рисунок 4А

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Чтобы контролировать изменения в метаболитах NO, нитратах и нитритах, в зависимости от физиологических вмешательств, необходимо измерить уровни этих ионов в различных органах, которые имеют решающее значение в их метаболизме. Поскольку гемоглобин в крови будет реагировать с NO и его метаболитами, также важно как можно быстрее удалить кровь из образцов тканей. Таким образом, животных перфузировали физиологическим раствором перед сбором скелетных мышечных тканей (ягодичные, ТА, ЭДЛ, икроножные мышцы), а соединительную ткан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов. Алан Н. Шехтер числится соавтором нескольких патентов, выданных Национальным институтам здравоохранения на использование нитритных солей для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Он получает роялти на основе лицензирования NIH этих патентов для клинической разработки, но без какой-либо другой компенсации. Эти договоренности не влияют на его приверженность политике журнала JoVE.

Благодарности

Эта работа была поддержана внутренним грантом NIH / NIDDK ZIA DK 0251041-14 Алану Н. Шехтеру, MD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
диссоциатор gentleMACSMiltenyi Biotec130-093-235
щадящая трубка MACS MMiltenyi Biotec130-093-236Длина: 87 мм; Диаметр: 30 мм
Гепарин натрияHospiraNDC-0409-7620-13
ИзофлуранBaxterNDC-10019-360-60
МетанолSigma646377
Гомогенизатор шариков MinilysBertin InstrumentsP000673-MLYS0-A NEM
; N-этилмалеимидSigma4260
Анализатор оксида азотаGESievers NOA 280i
NP-40; 4-НонилфенилполиэтиленгликольSigma74385
Феррицианид калия; K3Fe(CN)6Набор702587
PrecellysBertin InstrumentsP000911-LYSK0-Aсодержит 2 пробирки объемом 2 мл с керамическими (оксид циркония) шариками диаметром 2,8 мм для гомогенизации
Набор измельчителяCellcrusherНабор
для лизинга Sigma для переработки отходов

Ссылки

  1. Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
  2. Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).
  3. Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
  4. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  5. Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
  6. Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
  7. Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
  8. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
  9. Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
  10. Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
  11. Benjamin, N., et al. Stomach NO synthesis. Nature. 368 (6471), 502(1994).
  12. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
  13. Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
  14. Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
  15. Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
  16. Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
  17. Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
  18. Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
  19. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879(2016).
  20. Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
  21. Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
  22. Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
  23. Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
  24. Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Измерение нитратовизмерение нитритовметоды гомогенизациироторный гомогенизаторшариковый гомогенизаторгомогенизация с помощью пульверизатораметаболизм оксида азотаподготовка мышечной ткани
Подготовка гомогенатов скелетных мышц крыс для измерения нитратов и нитритов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.