Method Article

Конфокальный лазерный сканирующий анализ распределения Aspergillus fumigatus Conidia на основе конидии в оптически очищенном легком мыши с оптическим креплением

DOI:

10.3791/62436

⸱

September 18th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан метод количественного анализа распределения Aspergillus fumigatus conidia (размером 3 мкм) в дыхательных путях мышей. Метод также может быть использован для анализа распределения микрочастиц и агломерата наночастиц в дыхательных путях в различных моделях патологических состояний.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus conidia являются воздушно-капельными патогенами, которые могут проникать в дыхательные пути человека. Иммунокомпетентные люди без аллергии проявляют резистентность и иммунологическую толерантность, в то время как у пациентов с ослабленным иммунитетом конидии могут колонизировать дыхательные пути и вызывать тяжелые инвазивные респираторные расстройства. Различные клетки в разных отсеках дыхательных путей участвуют в иммунном ответе, который предотвращает грибковую инвазию; однако пространственно-временные аспекты элиминации патогенов до сих пор не полностью поняты. Трехмерная (3D) визуализация оптически очищенных целых органов, особенно легких экспериментальных мышей, позволяет обнаруживать флуоресцентно меченые патогены в дыхательных путях в разные моменты времени после заражения. В настоящем исследовании мы описываем экспериментальную установку для выполнения количественного анализа распределения A. fumigatus conidia в дыхательных путях. Используя флуоресцентную конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM), мы проследили расположение флуоресцентно меченых конидий в бронхиальных ветвях и альвеолярном отсеке через 6 часов после применения орофарингеальной части мышам. Описанный здесь подход ранее использовался для обнаружения точного местоположения патогена и идентификации патоген-взаимодействующих клеток на разных фазах иммунного ответа. Экспериментальная установка может быть использована для оценки кинетики элиминации возбудителя при различных патологических состояниях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ежедневно люди вдыхают воздушно-капельные патогены, в том числе споры условно-патогенных грибов Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), которые могут проникать в дыхательныепути1. Дыхательные пути млекопитающих представляют собой систему дыхательных путей разных поколений, которые характеризуются различным строением стенок дыхательных путей2,3,4. Стенки трахеобронхиальной клетки состоят из нескольких типов клеток, среди которых находятся реснитчительные клетки, обеспечивающие мукоцилиарный клиренс5. В аль....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, касающиеся лабораторных животных, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Институте биоорганической химии имени Шемякина и Овчинникова Российской академии наук (протокол No 226/2017).

1. Применение A. fumigatus conidia

  1. Для получения флуоресцентно меченого A. fumigatus conidia зафиксируют 5 ×10 8 конидий путем добавления 1 мл 3% параформальдегида в гранулу конидии. Инкубировать в пробирке 50 мл в течение 2 ч на шейкере при комнатной температуре.
  2. Промыть конидии 20 мл фосфатного буферного физиологического раство....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя протоколу выше, было получено 3D-изображение, показывающее дыхательные пути и A. fumigatus conidia в лечь легкого мыши(рисунок 1А). Стрептавидин (который использовался для визуализации дыхательных путей) помечен бронхами и бронхиолами15. Кроме того, крупные сосуды, которые легко отличить от дыхательных путей по их морфологии, и плевра визуализируются в канале дыхательных путей(рисунок 1A-C). Создание повер.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D-визуализация всего органа позволяет получить данные без вскрытия образца, что имеет большое значение для исследования пространственных аспектов анатомического распределения возбудителя в организме. Существует несколько методов и модификаций оптического очищения тканей, которые помогают преодолеть рассеяние лазерного света и позволяют проводить визуализацию всего органа15,16,18,19. Один из по.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят профессора Свена Краппманна (Университетская клиника Эрлангена и FUA Эрланген-Нюрнберг, Германия) за предоставление штамма Aspergillus fumigatus conidia AfS150. Авторы благодарят пресс-службу МФТИ. В.B. признает Министерство науки и высшего образования Российской Федерации (#075-00337-20-03, проект FSMG-2020-0003). Работа по визуализации и количественной оценке A. fumigatus conidia была поддержана RSF No 19-75-00082. Работа по визуализации дыхательных путей была поддержана РФФИ No 20-04-60311.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus conidiaATCC46645Штамм AfS150, производное ATCC 46645
Бензиловый спиртPanreac141081.161198.0-100 %
БензилбензоатAcrosAC10586-001099+%
C57Bl/6 мышейПущино Животное Селекционный центр (Россия)Кобель. 12 - 30 недель.
КатетерVenisystemsG715-A0118G
Камера для визуализации клеток с покровным стеклом на днеEppendorf307420284 или 8 лунок с покровным стеклом на дне
ЦентрифугаEppendorf5804RЛюбая центрифуга при условии 1000 г может быть использована
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZEISS ZEISSLSM780
ДиметилсульфоксидSigma-Aldrich276855≥ 99,9%
Пакет обработки изображений FIJIБесплатное программное обеспечение
ЗажимB. Braun AesculapBD557RЗубчатый
щипецB. Braun AesculapBD321RЩипцы с тонким наконечником
Bochem1727Гладкая
стеклянная бутылкаDURAN242101304С затертой крышкой
Графический редактор PhotoshopПрограммное обеспечение Adobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPadGraphPadPrism 8
Программное обеспечение для микроскопии ImarisOxford InstrumentsБесплатная пробная версия доступна https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
ОбъективZEISS420640-9800-000  План-Апохромат, 10 раз; (NA = 0,3)
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060Π
ДозаторProLine722020от 5 до 50 μ L
Сухое молокоRothT145.2
Смеситель образцовDynalMXIC1
НожницыB. BraunBC257RТупой
шейкерApexlabGS-2050-300 об/мин
SkalpelBochem12646
Шелковая нитьB. Braun3 USP
стрептавидин, Alexa Fluor 488 конъюгатThermoFisherS11223
ПробиркаSPL Lifesciences5005050 мл
Трис (гидроксиметиламинометан)HeliconH-1702-0.5  г-н 121.14; Номер CAS: 77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
Программное обеспечение для микроскопаZEN ZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
  2. Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Re....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Laser MicroscopyAspergillus Fumigatus ConidiaOptical ClearingMouse Lung ImagingQuantitative AnalysisAirway DistributionThree Dimensional ImagingSpectral UnmixingAirway MaskingImmune Response

Related Articles