Методическая статья

Конфокальный лазерный сканирующий анализ распределения Aspergillus fumigatus Conidia на основе конидии в оптически очищенном легком мыши с оптическим креплением

DOI:

10.3791/62436

⸱

18 сентября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан метод количественного анализа распределения Aspergillus fumigatus conidia (размером 3 мкм) в дыхательных путях мышей. Метод также может быть использован для анализа распределения микрочастиц и агломерата наночастиц в дыхательных путях в различных моделях патологических состояний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus conidia являются воздушно-капельными патогенами, которые могут проникать в дыхательные пути человека. Иммунокомпетентные люди без аллергии проявляют резистентность и иммунологическую толерантность, в то время как у пациентов с ослабленным иммунитетом конидии могут колонизировать дыхательные пути и вызывать тяжелые инвазивные респираторные расстройства. Различные клетки в разных отсеках дыхательных путей участвуют в иммунном ответе, который предотвращает грибковую инвазию; однако пространственно-временные аспекты элиминации патогенов до сих пор не полностью поняты. Трехмерная (3D) визуализация оптически очищенных целых органов, особенно легких экспериментальных мышей, позволяет обнаруживать флуоресцентно меченые патогены в дыхательных путях в разные моменты времени после заражения. В настоящем исследовании мы описываем экспериментальную установку для выполнения количественного анализа распределения A. fumigatus conidia в дыхательных путях. Используя флуоресцентную конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM), мы проследили расположение флуоресцентно меченых конидий в бронхиальных ветвях и альвеолярном отсеке через 6 часов после применения орофарингеальной части мышам. Описанный здесь подход ранее использовался для обнаружения точного местоположения патогена и идентификации патоген-взаимодействующих клеток на разных фазах иммунного ответа. Экспериментальная установка может быть использована для оценки кинетики элиминации возбудителя при различных патологических состояниях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ежедневно люди вдыхают воздушно-капельные патогены, в том числе споры условно-патогенных грибов Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), которые могут проникать в дыхательныепути1. Дыхательные пути млекопитающих представляют собой систему дыхательных путей разных поколений, которые характеризуются различным строением стенок дыхательных путей2,3,4. Стенки трахеобронхиальной клетки состоят из нескольких типов клеток, среди которых находятся реснитчительные клетки, обеспечивающие мукоцилиарный клиренс5. В альвеолах отсутствуют реснитительные клетки и проникающие в альвеолярное пространство патогены не могут быть устранены мукоцилиарным клиренсом6. Кроме того, каждое поколение дыхательных путей является нишей для нескольких популяций иммунных клеток, и подмножества этих популяций уникальны для определенных отсеков дыхательных путей. Таким образом, альвеолярные макрофаги находятся в альвеолярных компартментах, в то время как трахея и проводящие дыхательные пути выстланы интраэпителиальными дендритными клетками7,8.

Приблизительный размер A. fumigatus conidia составляет 2-3,5 мкм9. Поскольку диаметр мелких дыхательных путей у человека и даже у мышей превышает 3,5 мкм, было высказано предположение, что конидии могут проникать в альвеолярное пространство2,10,11. На самом деле гистологическое исследование показало грибковый рост в альвеолах пациентов, страдающих аспергиллезом12. Конидии также были обнаружены в альвеолах инфицированных мышей с использованием живой визуализации толстых срезов легких13. Одновременно конидии были обнаружены в просветной стороне эпителия бронхов мышей14.

Трехмерная (3D) визуализация оптически очищенных целых легких мыши позволяет проводить морфометрический анализ дыхательных путей15. В частности, количественный анализ распределения висцерального плеврального нерва проводили с использованием оптически очищенных образцов легких мышей15. Недавно Amich et al.16 исследовали рост грибков после интраназального применения конидий к мышам с ослабленным иммунитетом с использованием флуоресцентной микроскопии оптически очищенных образцов легких мышей. Точное расположение покоящихся конидий в дыхательных путях в разные моменты времени после заражения важно для выявления клеточных популяций, которые могут обеспечить достаточную противогрибковую защиту в определенных фазах воспаления. Однако из-за относительно небольших размеров пространственно-временные аспекты распределения A. fumigatus conidia в дыхательных путях характеризуются слабо.

Здесь мы представляем экспериментальную установку для количественного анализа распределения A. fumigatus conidia в дыхательных путях инфицированных мышей. Используя флуоресцентную конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM) оптически очищенных легких мышей, получившей орофарингеальное применение флуоресцентно меченой A. fumigatus conidia, получаем 3D-изображения и выполняем обработку изображений. Используя 3D-визуализацию всей доли легкого, мы ранее показали распределение A. fumigatus conidia в проводящих дыхательных путях мышей через 72 часа после применения конидий8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, касающиеся лабораторных животных, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Институте биоорганической химии имени Шемякина и Овчинникова Российской академии наук (протокол No 226/2017).

1. Применение A. fumigatus conidia

  1. Для получения флуоресцентно меченого A. fumigatus conidia зафиксируют 5 ×10 8 конидий путем добавления 1 мл 3% параформальдегида в гранулу конидии. Инкубировать в пробирке 50 мл в течение 2 ч на шейкере при комнатной температуре.
  2. Промыть конидии 20 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS): центрифугу при 1000 х г в течение 15 мин, аккуратно удалить супернатант и добавить свежий PBS в объеме 20 мл. Повторять.
  3. Растворяют конидии в 900 мкл 0,1 М NaHCO3.
  4. Растворяют сукцинимидиловый эфир флуоресцентного красителя 594 нм в 100 мкл диметилсульфоксида и добавляют к конидиям.
  5. Инкубировать конидии с красителем в течение 1 ч на шейкере при 150 об/мин при комнатной температуре.
  6. Промыть конидии дважды 20 мл PBS в центрифуге при 1000 х г в течение 15 мин.
  7. Развести конидии до концентрации 1 × 108 конидий/мл в PBS и хранить при 4°C.
  8. Обезболивают мышь 0,5-3% парами изофлурана. Положите мышь на держатель, зафиксируйте язык гладкими щипцами и удерживайте нары. Возьмите одноканальный пипетку и нанесите 50 мкл суспензии конидий на глоток мыши. Подождите, пока суспензия вдохнула.

2. Подготовка образца

  1. Подготовьте пробирку объемом 50 мл и заполните ее 15 мл свежего 2% параформальдегида. Поместите медицинские инструменты (15 см зубчатые рассекающие щипцы, щипцы с мелкими наконечниками 8 см и ножницы 10 см с тупыми концами) в 70% раствор этанола.
  2. Усыплите мышь в соответствии с протоколом IACUC. Затем поместите мышь в дорсальное положение и зафиксируйте лапы мыши иглами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании вывиха шейки матки для эвтаназии, обеспечьте целостность трахеи.
    1. Обработайте мышь 70% этанолом с помощью опрыскивателя.
    2. Сделайте срединный продольный разрез в вентральной коже от задних лап до предкрыльев и подбородка.
    3. Отделите кожу от подкожной клетчатки зубчатыми щипцами и закрытыми ножницами. Зафиксируйте верхние концы кожи иглами.
    4. Сделайте разрез в брюшной стенке и отделите печень от диафрагмы. Осторожно подберите диафрагму закрытыми ножницами, а затем срежьте диафрагму.
    5. Сделайте медиальную разрез соединительных тканей грудной клетки и шеи до тех пор, пока не будет видна трахея.
  3. Провести шелковую нить под трахеей и сделать хирургический узел с помощью двух щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, используйте зубную нить вместо шелковой нити.
    1. Осторожно потяните за нить и ножницами отрежьте легкие от соединительной ткани. Держите ножницы перпендикулярно столу.
    2. Поместите легкие в пробирку 50 мл с 2% параформальдегидом. Оставьте концы нити за пределами трубки, плотно положите крышку и переверните трубку, чтобы покрыть легкие параформальдегидом. Держите легкие на ночь при 4 °C.
  4. Рассекают легочные доли от сердца и друг друга скальпелем.
    1. Поместите доли легких в пластину из 24 лунок, причем каждая доля в отдельном лунку. Промыть доли легких в 1 мл трис-буферного физиологического раствора (TBS) рН 7,4, 5 раз по 1 ч каждый на шейкере при 150 об/мин.
    2. Замените 1 мл TBS на 1 мл блокирующего буфера (1% Triton X 100, 5% сухого молока в TBS) и оставьте образец на ночь при комнатной температуре на шейкере.
    3. Замените блокирующий буфер 1 мл стрептавидина-488-нм фторхромного конъюгата, разбавленного 1:30 в TBS. Оставьте образец не менее чем на 72 ч при комнатной температуре на шейкере (150 об/мин).
  5. Промыть образец 5 раз в течение 1 ч в 1 мл TBS при комнатной температуре на шейкере (150 об/мин). Перенесите образец в новые скважины и накройте его 2% параформальдегидом на ночь при 4 °C для постфиксации.

3. Оптическая очистка доли легкого мыши

  1. Поместите образец в стеклянную бутылку объемом 5 мл, наполненную 3 мл 50% раствора метанола и воды, и поместите его в смеситель для образцов при комнатной температуре в течение 1 ч.
  2. Заменить 3 мл 50% метанола на 3 мл 100% метанола и поместить его в смеситель для образцов на 2 ч. Готовят смесь бензилового спирта и бензилбензоата (БЭБ) 1:2 в/об. в общем объеме 1 мл.
  3. Переложите образец на плиту из 24 скважин и накройте 1 мл смеси BABB в течение не менее 30 мин. Не оставляйте экземпляр в БЭБ в течение длительного времени; BABB может повредить пластиковую пластину и сделать образец слишком жестким.
  4. Поместите образец в камеру для визуализации клеток со стеклом нижнего дна. Образец готов к визуализации.

4. Визуализация доли легких мыши с помощью CLSM

  1. Включите систему микроскопа. Откройте программное обеспечение микроскопа. Включите индикатор пропускания на вкладке Поиск. Выберите цель 10x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более детального анализа используйте 20-кратную цель, но это увеличивает время эксперимента и размер файла изображения.
  2. Поместите камеру с образцом в держатель крышки. Поместите держатель на ступень XY над целью. Центрируйте образец с помощью элементов управления XY сцены поверх объектива. Используйте пропускной свет и окуляр, чтобы вручную найти образец Z-плоскости.
  3. Переключите программное обеспечение на вкладку Приобретение. Выберите CLSM λ-mode. Включите лазеры 488 нм и 561 нм. Выберите дихроичное зеркало 488/561 нм. Измените спектральный диапазон детектора на 490-695 нм. Отрегулируйте мощность лазера в соответствующем диапазоне (10-50 мкВт). Отрегулируйте коэффициент усиления детектора в диапазоне 750-900.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие настройки усиления нежелательны из-за шума.
  4. Сузьте отверстие до 1 блока Airy, нажав кнопку 1 AU. Установите разрешение 512 × 512 пикселей.
  5. Включите режим Z-стека. Запустите создание изображений в реальном времени. Выберите фокальную плоскость, в которой видны оба красителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте мощность лазера для нормализации яркости двух флуоресцентных красителей. Используйте галерейный и одноканальный режимы, чтобы избежать обрезки и точно соответствовать интенсивности флуоресценции.
  6. Разверните появившуюся панель Z-стека. Используйте фокусировку и найдите самую нижнюю плоскость образца. Используйте кнопку «Первый» на панели Z-стека. Переместите фокальную плоскость вверх, чтобы найти верхнюю границу образца и сохранить положение с помощью кнопки «Последний». Проверьте представление глубины выборки на панели Z-стека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Представление глубины выборки появится на панели Z-стека после выбора позиций Первая и Последняя.
  7. Расположите объектив с помощью фокусировки в нижней части образца, взглянув на стекло Z-stack. Это примерно 20 мкм от нижней части образца.
  8. Отключите режим Z-стека и включите режим сканирования плитки. Получите изображение с соответствующим количеством плиток для размера образца. 5 × 5 плиток являются хорошей отправной точкой.
  9. Отрегулируйте количество плиток и положение образца XY до тех пор, пока все легкое не поместится внутри мозаичная плитка. Перепроверьте правильность позиций Z-стека с помощью вновь полученного положения XY центра образца.
  10. Включите режимы Z-stack и Tile Scan. Установите шаг Z (в панели Z-стека) на 5 мкм. Установите для скорости сканирования значение 6. Включите функцию автосохранения. Включите параметр Сохранение отдельных плиток. Присвою файлу имя. Нажмите кнопку Начать эксперимент.
  11. Убедитесь, что эксперимент не превышает отведенное на микроскоп время; если да, то отрегулируйте скорость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительный размер файла более 10 Гб; убедитесь, что на жестком диске достаточно места.

5. Спектральное размешивание и сшивание

  1. Используйте программное обеспечение для первоначальной обработки изображений. Для спектрального размикширования выберите параметр «Размикширование». Выберите две области, соответствующие стрептавидину/дыхательным путям и конидиям, чтобы получить спектры из изображения. Нажмите кнопку Начать размешивание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать существующие спектры для фторхромов 488 и 594 нм.
  2. Откройте файл для обработки изображения и выберите вкладку Обработка. В разделе Методы выберите Геометрические и сшивающие. В разделе Параметр выберите Новый вывод и отметьте параметр Плитки предохранителя. Используйте опорный режим с выбранным каналом, соответствующим флуоресценции дыхательных путей. Примените сшивание, нажав кнопку Применить.

6. Обработка изображений: рендеринг поверхности

  1. Откройте изображение как Surpass 3D View. Создайте поверхность дыхательных путей с помощью параметра Surface для канала, который использовался для визуализации дыхательных путей. Выберите параметр Smoothing 10 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите автоматическое пороговое значение.
  2. Визуально осмотрите поверхность. Выберите пороговые значения для уменьшения выходного сигнала. Удалите поверхности плевры и сосудов.
  3. Создайте маску для поверхности дыхательных путей с помощью опций Правка и Маска всех. Выберите канал дыхательных путей и установите значение Voxels за пределами поверхности на 0,001.
  4. Сохраните файл с маской дыхательных путей в виде серии TIFF в папку. Сохраните файл с каналом conidia как серию TIFF в отдельную папку.

7. Обработка изображений: коррекция маски

  1. Откройте файл с маской дыхательных путей на платформе с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений17 в виде 8-битного изображения. Сделайте изображение двоичным, щелкнув Обработать | Двоичные | Сделать двоичным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости исправьте маску: удалите лишние поверхности с помощью вкладки Выделение полигонов и Удаление. Кроме того, можно использовать средство заливки.
  2. Нарисуйте недостающие поверхности, используя несколько раз Dilate (3D):нажмите Плагины | | процесса Расширение (3D). Заполните отверстия, щелкнув Процесс | Двоичные | Заполните отверстия. Используйте интерполяцию выбора и менеджера ROI, чтобы вручную заполнить остаточные отверстия в маске. Примените несколько опций Erode (3D) (Плагины | | процесса Erode (3D)) для ресамплинга толщины маски.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Создание макросов с помощью плагинов | Параметры макросов для нескольких повторов Dilate (3D) и Erode (3D).
    Убедитесь, что количество Erode (3D) равно количеству приложений Dilate (3D).
  3. Сохраните маску в новой папке как серию TIFF.

8. Количественный анализ Конидии

  1. Откройте приложение в программно-числовой вычислительной платформе: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
  2. Нажмите кнопку Добавить файлы. Выберите папку маски дыхательных путей и папку conidia.
  3. Установите пользовательское пороговое значение в период от 0 до 1. Нажмите кнопку OK.
  4. Сохраните выходную таблицу в пользовательском файле .xls.
  5. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения для статистического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя протоколу выше, было получено 3D-изображение, показывающее дыхательные пути и A. fumigatus conidia в лечь легкого мыши(рисунок 1А). Стрептавидин (который использовался для визуализации дыхательных путей) помечен бронхами и бронхиолами15. Кроме того, крупные сосуды, которые легко отличить от дыхательных путей по их морфологии, и плевра визуализируются в канале дыхательных путей(рисунок 1A-C). Создание повер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D-визуализация всего органа позволяет получить данные без вскрытия образца, что имеет большое значение для исследования пространственных аспектов анатомического распределения возбудителя в организме. Существует несколько методов и модификаций оптического очищения тканей, которые помогают преодолеть рассеяние лазерного света и позволяют проводить визуализацию всего органа15,16,18,19. Один из по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят профессора Свена Краппманна (Университетская клиника Эрлангена и FUA Эрланген-Нюрнберг, Германия) за предоставление штамма Aspergillus fumigatus conidia AfS150. Авторы благодарят пресс-службу МФТИ. В.B. признает Министерство науки и высшего образования Российской Федерации (#075-00337-20-03, проект FSMG-2020-0003). Работа по визуализации и количественной оценке A. fumigatus conidia была поддержана RSF No 19-75-00082. Работа по визуализации дыхательных путей была поддержана РФФИ No 20-04-60311.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus conidiaATCC46645Штамм AfS150, производное ATCC 46645
Бензиловый спиртPanreac141081.161198.0-100 %
БензилбензоатAcrosAC10586-001099+%
C57Bl/6 мышейПущино Животное Селекционный центр (Россия)Кобель. 12 - 30 недель.
КатетерVenisystemsG715-A0118G
Камера для визуализации клеток с покровным стеклом на днеEppendorf307420284 или 8 лунок с покровным стеклом на дне
ЦентрифугаEppendorf5804RЛюбая центрифуга при условии 1000 г может быть использована
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZEISS ZEISSLSM780
ДиметилсульфоксидSigma-Aldrich276855≥ 99,9%
Пакет обработки изображений FIJIБесплатное программное обеспечение
ЗажимB. Braun AesculapBD557RЗубчатый
щипецB. Braun AesculapBD321RЩипцы с тонким наконечником
Bochem1727Гладкая
стеклянная бутылкаDURAN242101304С затертой крышкой
Графический редактор PhotoshopПрограммное обеспечение Adobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPadGraphPadPrism 8
Программное обеспечение для микроскопии ImarisOxford InstrumentsБесплатная пробная версия доступна https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
ОбъективZEISS420640-9800-000  План-Апохромат, 10 раз; (NA = 0,3)
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060Π
ДозаторProLine722020от 5 до 50 μ L
Сухое молокоRothT145.2
Смеситель образцовDynalMXIC1
НожницыB. BraunBC257RТупой
шейкерApexlabGS-2050-300 об/мин
SkalpelBochem12646
Шелковая нитьB. Braun3 USP
стрептавидин, Alexa Fluor 488 конъюгатThermoFisherS11223
ПробиркаSPL Lifesciences5005050 мл
Трис (гидроксиметиламинометан)HeliconH-1702-0.5  г-н 121.14; Номер CAS: 77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
Программное обеспечение для микроскопаZEN ZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
  2. Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
  3. Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
  4. Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
  5. Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).
  6. Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
  7. Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
  8. Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
  9. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
  10. Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
  11. Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
  12. Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
  13. Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
  14. Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085(2018).
  15. Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
  16. Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
  19. Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382(2014).
  20. Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Confocal Laser MicroscopyOptical ClearingMouse Lung ImagingAirway DistributionThree Dimensional ImagingSpectral UnmixingAirway MaskingImmune Response

Похожие статьи