Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение клеток первичного клапана человека для моделирования заболеваний in vitro

3.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62439

⸱

16 апреля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, and the Pittsburgh Heart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Cardiothoracic Surgery, University of Pittsburgh and Heart and Vascular Institute, University of Pittsburgh Medical Center, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает коллекцию аортальных клапанов человека, извлеченных во время хирургических процедур замены аортального клапана или из трупной ткани, и последующую изоляцию, расширение и характеристику специфических для пациента эндотелиальных и интерстициальных клеток первичного клапана. Включены важные детали, касающиеся процессов, необходимых для обеспечения жизнеспособности клеток и специфичности фенотипа.

Аннотация

Заболевание кальцифицированного аортального клапана (CAVD) присутствует почти у трети пожилого населения. Утолщение, жесткость и кальцификация аортального клапана вызывает стеноз аорты и способствует сердечной недостаточности и инсульту. Патогенез заболевания является многофакторным, и такие стрессы, как воспаление, ремоделирование внеклеточного матрикса, турбулентное течение, а также механическое напряжение и деформация способствуют остеогенной дифференцировке эндотелиальных и клапанных интерстициальных клеток. Однако точные инициирующие факторы, которые управляют остеогенным переходом здоровой клетки в кальцифицирующую клетку, не полностью определены. Кроме того, единственной текущей терапией для CAVD-индуцированного аортального стеноза является замена аортального клапана, при которой нативный клапан удаляется (хирургическая замена аортального клапана, SAVR) или полностью складной замещающий клапан вводится через катетер (транскатетерная замена аортального клапана, TAVR). Эти хирургические процедуры сопряжены с высокой стоимостью и сопряжены с серьезными рисками; таким образом, определение новых терапевтических мишеней для открытия лекарств является обязательным. С этой целью настоящее исследование разрабатывает рабочий процесс, в котором хирургически удаленные ткани пациентов и донорские трупные ткани используются для создания специфических для пациента первичных линий клапанных клеток для моделирования заболеваний in vitro. Этот протокол вводит использование раствора холодного хранения, обычно используемого при трансплантации органов, для уменьшения ущерба, вызванного часто длительным временем закупок между иссечением ткани и лабораторной обработкой с пользой для значительной стабилизации клеток иссеченной ткани. Результаты настоящего исследования показывают, что изолированные клетки клапана сохраняют свою пролиферативную способность и эндотелиальные и интерстициальные фенотипы в культуре в течение нескольких дней после удаления клапана у донора. Использование этих материалов позволяет собирать контрольные и CAVD-клетки, из которых устанавливаются как контрольные, так и болезнетворные клеточные линии.

Введение

Заболевание кальцифицированного аортального клапана (CAVD) является хронической патологией, характеризующейся воспалением, фиброзом и макрокальцификацией листочков аортального клапана. Прогрессирующее ремоделирование и кальцификация листочков (так называемый склероз аорты) может привести к обструкции кровотока (аортальный стеноз), что способствует инсульту и приводит к сердечной недостаточности. В настоящее время единственным методом лечения CAVD является хирургическая или транскатетерная замена аортального клапана (SAVR и TAVR соответственно). Не существует нехирургического варианта остановить или обратить вспять прогрессирование CAVD, и без замены клапана показатели смертности приближаются к 50% в течение 2-3 лет 1,2,3. Определение основных механизмов, приводящих к этой патологии, позволит выявить потенциальные новые терапевтические подходы.

У здорового взрослого человека листочки аортального клапана имеют толщину примерно в один миллиметр, и их основная функция заключается в поддержании однонаправленного потока крови из левого желудочка4. Каждая из трех листовок состоит из слоя эндотелиальных клеток клапана (VEC), который выстилает внешнюю поверхность листка и функционирует как барьер. VEC поддерживают гомеостаз клапана, регулируя проницаемость, адгезию воспалительных клеток и паракринную сигнализацию 5,6,7. Клапанные интерстициальные клетки (VIC) составляют большинство клеток внутри створки клапана8. VIC расположены в трех отличительных слоях листовки. Эти слои известны как желудочковый, губчатый и фиброза9. Желудочек обращен к левому желудочку и содержит коллагеновые и эластиновые волокна. Средний слой, spongiosa, содержит высокое содержание протеогликанов, что обеспечивает гибкость сдвига во время сердечного цикла. Наружный слой фиброзы расположен близко к поверхности оттока на стороне аорты и богат фибриллярным коллагеном типа I и типа III, которые обеспечивают силу для поддержания коаптации во время диастолы 10,11,12. VIC находятся в состоянии покоя, однако такие факторы, как воспаление, ремоделирование внеклеточного матрикса (ECM) и механическое напряжение, могут нарушить гомеостазVIC 8,9,13,14,15,16. При потере гомеостаза VIC активируют и приобретают миофибробластоподобный фенотип, способный к пролиферации, сокращению и секреции белков, которые ремоделируют внеклеточный миллие17. Активированные VIC могут переходить в кальцифицирующие клетки, что напоминает дифференцировку мезенхимальной стволовой клетки (MSC) в остеобласт 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

Кальцификация, по-видимому, инициируется в богатом коллагеном слое фиброзы от вклада как VEC, так и VIC, но расширяется и вторгается в другие слои листка8. Таким образом, ясно, что и VEC, и VIC реагируют на стимулы, чтобы повысить экспрессию остеогенных генов, однако точные события, приводящие к активации остеогенных генов, а также сложное взаимодействие между клетками и внеклеточным матриксом листка остаются неопределенными. Мышиные модели не являются идеальным источником для изучения негенетических факторов патогенеза CAVD, поскольку у мышей не развивается CAVD de novo26,27, поэтому необходимо использование первичных тканей человека и первичных клеточных линий, выделенных из этих тканей. В частности, получение этих клеток в большом количестве и хорошем качестве является обязательным, поскольку область 3D-клеточных культур и органоидного моделирования расширяется и, вероятно, станет альтернативой ex vivo человеческим моделям мышей.

Целью настоящего метода является совместное использование рабочего процесса, который создал условия для эффективной изоляции и выращивания VEC и VIC, полученных из хирургически удаленных клапанов у доноров-людей. Предыдущие исследования показали успешное выделение VEC и VIC из свиных28 и мышиных клапанов29, насколько нам известно, это первое, что описывает выделение этих клеток в тканях человека. Протокол, описанный здесь, применим к иссеченным клапанам человека и значительно обходит и улучшает повреждение, вызванное часто длительным временем закупок между иссечением тканей и лабораторной обработкой, путем введения использования раствора холодного хранения, буферного раствора, клинически используемого в трансплантации органов, который значительно стабилизирует клетки иссеченной ткани. Протокол, описанный здесь, также показывает, как определить фенотип клетки и гарантировать высокую эффективность выживания клеток при минимальном перекрестном загрязнении клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все образцы пациентов собираются у лиц, включенных в исследования, одобренные институциональным наблюдательным советом Университета Питтсбурга в соответствии с Хельсинкской декларацией. Трупные ткани, полученные через Центр восстановления органов и образования (CORE), были одобрены Комитетом по надзору за исследованиями и клинической подготовкой с участием умерших (CORID) Университета Питтсбурга.

1. Одобрение и безопасность

  1. Получить одобрение Институционального наблюдательного совета (IRB) или освобожденную записку для любого сбора образцов пациентов или трупных тканей в соответствии с Хельсинкской декларацией.
  2. Пройти необходимую институциональную подготовку для работы с тканями человека, такую как обучение патогенам, передающимся через кровь, биомедицинские исследования людей, конфиденциальность и информационная безопасность, а также транспортировка и доставка биологических материалов.

2. Логистика и подготовка

  1. Хирургические образцы
    1. Убедитесь, что холодильник доступен и расположен рядом с операционной. Храните конические трубки объемом 50 мл, предварительно маркированные деидентифицированной номенклатурой, содержащей 40 мл стерильных аликвот холодного раствора для хранения, в этом холодильнике для использования хирургическим персоналом. Эти тубы стабильны при температуре 4 °C до истечения срока годности на оригинальной упаковке.
    2. После экстракции поместите ткань клапана в эти трубки. Поместите трубки в герметичный вторичный контейнер, такой как герметичный пластиковый пакет или пластиковый контейнер, который маркирован этикеткой биологической опасности. Ткани подбираются и транспортируются на льду в соответствии с институциональными протоколами транспортировки биологических опасностей.
  2. Трупные образцы
    1. Погружайте извлеченные органы в раствор для холодного хранения, помещайте в герметичный вторичный защитный сосуд и транспортируйте по льду в соответствии с институциональными протоколами транспортировки биологических опасностей.

3. Подготовка реагентов

  1. Сделайте пластины с коллагеновым покрытием, по крайней мере, накануне.
    1. В конической пробирке объемом 50 мл смешайте 5 мл изопропилового спирта, 8,7 мл уксусной кислоты и 0,5 мкг порошка коллагена I. Довести до 50 мл стерильной водой. Перемешайте и процедите через фильтр 0,45 мкм.
    2. Под вытяжку для стерильной культуры клеток добавьте достаточное количество раствора коллагена в 6 луночных пластин и 10 см посуды, чтобы просто покрыть все дно. Накройте тарелку крышкой и оставьте на 4-6 ч при комнатной температуре. Удалите лишний раствор стерильной пипеткой, поместите в новую стерильную коническую трубку объемом 50 мл и сохраните при 4 °C, чтобы сделать дополнительные пластины. Раствор можно хранить при 4 °C в течение нескольких месяцев.
    3. Высушите пластины в инкубаторе при температуре 37 °C в течение ночи, а затем храните их в запечатываемом пакете при 4 °C. Покрытые коллагеном тарелки и посуда могут храниться в течение нескольких месяцев.
  2. Автоклав следующие предметы: тканевые щипцы, тканевые ножницы, ватные тампоны и марлевые прокладки.
  3. Питательная среда VEC: Подготовка и использование среды для роста эндотелиальных клеток в соответствии с протоколами производителя. Хранить в темноте при температуре 4 °C. Нагреть до 37 °C непосредственно перед использованием на клетках, не оставлять среду в согревающей ванне дольше, чем это необходимо (достаточно 10-15 мин). Используйте средства массовой информации в течение одного месяца после подготовки.
  4. Питательные среды VIC: добавка DMEM базовая среда (4,5 г / л глюкозы, добавка L-глутамина, 110 мг / л пирувата натрия)30 с 10% термоинактивированным FBS и 100 I.U./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Хранить в темноте при температуре 4 °C до 3 месяцев. Нагреть до 37 °C непосредственно перед использованием на клетках, не оставлять среду в согревающей ванне дольше, чем это необходимо (достаточно 10-15 мин).
  5. Сделайте стерильный раствор для полоскания непосредственно перед использованием. Дополнить стерильный PBS фунгицидом 2,5 мкг/мл, гентамицином 0,05 мг/мл и бактерицидом 5 мкг/мл.
  6. Сделайте стерильный раствор коллагеназы непосредственно перед использованием. Добавьте 5 мг коллагеназы II к 5 мл стерильной свежей базовой среды ДМЭМ. Хорошо перемешайте и стерилизуйте раствор, пройдя через фильтр 0,45 мкм. Держите на льду до использования.

4. Подготовка и обработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Институциональное разрешение на использование тканей человека должно быть получено до начала работы. При обращении с салфетками необходимо носить следующие средства индивидуальной защиты (СИЗ): одноразовый жидкий барьерный халат или специальное лабораторное пальто на пуговицах с жидкобарьерной оберткой вокруг фартука и одноразовые рукавные клеверы; анфасный щиток или защитные очки с хирургической маской; двойные перчатки; обувь с узким носком; и одежда для покрытия ног. Комплексные рабочие схемы подготовки тканей к оценке кальцификации (раздел 5) и изоляции клеток (разделы 6 и 7) проиллюстрированы на рисунке 1A, B соответственно.

  1. При получении образца трупного органа иссечение корня аорты и погружение в коническую трубку стерильного промывочного раствора объемом 50 мл. При получении хирургического образца удаляют из транспортных сосудов и погружают в коническую трубку объемом 50 мл стерильного промывочного раствора. Поместите пробирку, содержащую ткань, в ведро со льдом на коромысле и перемешайте в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка тканей как можно ближе ко времени экстракции даст наилучшее восстановление клеток, однако жизнеспособные клетки могут быть собраны в течение 61 ч после иссечения, и данные показывают, что VIC более надежны, чем VEC с увеличением времени. Если ткань не может быть обработана немедленно, когда это возможно, удалите ткань, выполните этап 4.1, а затем поместите ткань обратно в свежий стерильный холодный раствор для хранения и держите при 4 °C до готовности к продолжению. Клапаны, собранные во время ночных или выходных операций, могут храниться в 40 мл холодного хранилища при 4 ° C и все еще способны давать жизнеспособные клетки более 2 дней после экстракции.
  2. Распылите трубки с 70% этанолом и переместите в стерильную вытяжку. Удалите ткань и иссейте две клапанные вкладыши (рисунок 2А). Поместите один листочек в криогенный флакон (или 2-3 флакона, если для будущего анализа потребуется несколько более мелких кусочков) и заморозьте, опустив в жидкий азот, а затем храните при -80 °C.
    1. Если клапан двустворчатый, иссечь только один листочек. С помощью ножниц разрежьте листок пополам от узелка до шарнира. Используйте одну половину листовки для замораживания, а другую половину для шага 4.3.
  3. Обработайте второй листок для встраивания парафина для оценки содержания кальцификации, разрезав его пополам от узелка до шарнира. Поместите оба кусочка в кассету, погруженную в 4% параформальдегид (PFA), затем поместите на коромысло при RT минимум на 2 ч, но не более 4 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время фиксации создает больше фона с иммунофлуоресцентным окрашиванием. После выполнения шагов 4.2 и 4.3 немедленно перейдите к разделу 6 и вернитесь к шагу 4.4 после шага 6.12.
  4. После фиксации промыть салфетки погружением в свежий ПБС на 1 ч 3-4 раза. После этих промывок образцы могут оставаться в PBS при 4 °C в течение нескольких месяцев, если это необходимо. Перейдите к следующему шагу непосредственно перед внедрением.
  5. Постепенно переходят с PBS на 70% этанол. Промывайте 30-60 мин каждый шаг с 1:4 70% этанолом:PBS; 1:1 70% этанол: PBS, 4: 1 70% этанол: PBS; 70% этанола.
  6. Встроить ткань таким образом, чтобы срезы раскрывали три слоя листка (фиг.1А) в соответствии с установленными протоколами31. В качестве альтернативы, и если это возможно, доведите ткань до ядра патологии для встраивания и разрезания.
  7. После обработки салфеток утилизируйте или храните СИЗ по мере необходимости и немедленно мойте руки. Обеззараживайте все оборудование, поверхности, а также твердые и жидкие отходы с помощью разбавления отбеливателя или моющего дезинфицирующего средства в соотношении 1:10. Подождите 20 минут для обеззараживания, затем проведите 70% промывку этанолом. Обработайте вытяжку клеточной культуры спреем от микоплазмы в соответствии с инструкциями производителя.

5. Окрашивание фон Косса на содержание кальция

ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть сделано хорошо после изоляции клеток и установления линии, но обязательно свяжите уровень кальцификации ткани с документами, относящимися к установленной первичной клеточной линии.

  1. Нарежьте ломтики парафина толщиной 5 или 10 мкм на стеклянных слайдах и выпекайте слайды при 65 °C в течение 1 часа, затем остыйте до RT.
  2. Используя свежие растворы, депарафинизируйте слайды, погружая в воду следующим образом: 100% ксилол в течение 30 мин, 2x; 100% этанол в течение 3 мин, 2х; 90% этанол в течение 3 мин; 80% этанол в течение 3 мин; 70% этанол в течение 3 мин; 50% этанол в течение 3 мин; сверхчистая вода в течение 3 мин; хранить в сверхчистой воде до следующих шагов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время выше минимально, каждый шаг может идти дольше.
  3. Приступайте к окрашиванию Von Kossa в соответствии с протоколами производителя.
  4. Оцените полную площадь клапана микроскопически и назначьте контрольную ткань (без признаков кальцификации) или CAVD (любые доказательства кальцификации, рисунок 2B).

6. Изоляция, расширение и подтверждение эндотелиальных клеток клапана (VEC)

  1. В стерильной вытяжке для культивирования клеток откройте коническую трубку, содержащую оставшуюся створку клапана, и поместите листок в новую коническую трубку объемом 50 мл, заполненную ледяным холодом PBS. Колпачок трубки аккуратно перевернуть или поместить на коромысле на 2 мин при RT.
  2. Выньте ткань в 60-миллиметровую посуду, наполненную 5-7 мл холодного раствора коллагеназы. Используя щипцы, окуните обе стороны листочка в раствор 3-4 раза. Инкубируют ткань в течение 5-10 мин в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C, мягко раскачивая ткань каждые 2 мин 3-4 раза.
  3. Вынуть из посуды 2 мл раствора и поместить в стерильную коническую трубку объемом 15 мл. Поместите щипцы в узелок и используйте сухой стерильный ватный тампон, чтобы провести от щипцов к шарниру, закручивая тампон, перемещая его вдоль листа. Между каждым свайпом смахните тампон в растворе в конической трубке объемом 15 мл, чтобы удалить клетки. Повторите, чтобы полностью промазать поверхность ткани, затем перевернитесь и повторите на другой стороне.
  4. Держа в одной руке створку клапана с щипцами, а в другой пипетку объемом 1 мл, промойте поверхности листка раствором в посуде. После промывки переложите весь раствор, содержащий VEC в чашке, в ту же коническую трубку объемом 15 мл с клетками из тампона и перейдите к этапу 6.5. Поместите оставшуюся ткань клапана в новую коническую трубку объемом 15 мл с 7 мл стерильного раствора коллагеназы и перейдите к шагу 7.1.
  5. Центрифугируйте трубку, содержащую VEC при 180 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать изолированные VEC. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать в 3 мл среды роста VEC. Центрифуг еще раз и удалите супернатант. Повторно суспендируют клетки в 1 мл ростовых сред и определяют количество клеток с помощью гемоцитометра и трипана синего цвета.
  6. Повторно суспендируйте гранулу VEC в 2 мл питательной среды VEC и обложите клетки в коллагеновом предварительно покрытом колодце из 6 лунок примерно 5 х 105 клеток /см2. Дайте клеткам расти не менее 3-4 дней, затем удалите среду и пополните ее свежими. Повторяйте смену носителя каждые 4 дня. VEC будут расти в булыжниках (рисунок 3B, левые панели).
  7. Когда пластыри VEC покрывают >80% пластины, расщепляют клетки примерно на 1,3 х 104 клетки /см2 в зависимости от того, насколько быстро они растут (если они достигают 80% менее чем за 1 неделю, расщепляются при немного меньшем количестве клеток /см2).
  8. Чтобы разделить, промыть клетки два раза с 2 мл DPBS, затем добавить достаточно реагента диссоциации, чтобы просто покрыть поверхность клеток. Инкубируйте в течение 2-3 мин при 37 °C, проверяя, чтобы убедиться, что клетки не переинфлюзированы. Остановите пищеварение, добавив равный объем среды роста VEC и переместив жидкость в пробирку объемом 15 мл. Центрифуга при 180 х г в течение 5 мин, удаляет супернатант и повторно суспендирует в соответствующем объеме среды для количества необходимых скважин /пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После расширения в 10-сантиметровую пластину VEC могут иногда терять свою морфологию и изменять фенотип по мере их размножения. Это, как правило, происходит, когда VEC засеиваются при низкой слиянии во время установления и расширения клеточной линии.
  9. Чтобы гарантировать чистую культуру, рассмотрите возможность использования суперпарамагнитных бусин CD31 + при каждом расщеплении.
  10. Для 1 х 108 или менее ячеек (одна тарелка 10 см или менее) приготовьте 25 мкл суперпарамагнитных шариков путем мытья в соответствии с протоколами производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 6.10 рекомендуется выполнять перед трипсинизацией VEC.
  11. Отсоедините клетки, как на стадии 6,8, но повторно суспендируйте в 500 мкл PBS с 0,1% BSA, рН 7,4 и поместите в центрифужную трубку объемом 2 мл. Добавьте 500 мкл промытых и повторно суспендированных шариков в 2 мл клеток и инкубируйте на ротаторе в течение 20 мин при 4 °C.
  12. Поместите трубки на магнит на 2 мин. Пока трубка еще находится в магните, осторожно удалите супернатант. Снимите трубку с магнита, добавьте 1 мл свежего PBS с 0,1% BSA, пипетку аккуратно 2-3 раза, затем поместите обратно на магнит на 2 мин. Повторите еще 2 раза. После окончательного удаления буфера повторно суспендируют клетки в ростовых средах в объеме, необходимом для повторного покрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки по-прежнему будут иметь бусины, но они не повлияют на рост и будут удалены в последующих проходах.
  13. После того, как клетки были расширены, в дополнение к морфологии, подтверждают фенотип VEC положительным окрашиванием для иммунофлуоресцентных маркеров, таких как фактор фон Виллебранда (vWF), кадгерин 5 (CDH5) или PECAM-1 / CD31, и отрицательным окрашиванием для маркеров VIC, таких как кальпонин 1 (CNN) или альфа-2 гладкомышечный актин (αSMA, рисунок 4, левые панели).

7. Изоляция, расширение и хранение интерстициальной ячейки клапана (VIC)

  1. Как указано на этапе 6.4, после удаления VEC из ткани клапана листок помещают в коническую трубку объемом 15 мл с 7 мл раствора коллагеназы. Инкубируют в течение 12 ч в инкубаторе клеточной культуры со слегка открытой крышкой, чтобы обеспечить газообмен. Успешное выделение VIC все еще может произойти с 18 ч в растворе коллагеназы.
  2. После инкубации в стерильной вытяжке для культивирования клеток аккуратно перемешайте ткань путем пипетки серологической пипеткой, чтобы обеспечить высвобождение VIC из ткани листочка.
  3. Снимите клеточную суспензию и пропустите через фильтр 0,70 мкм в коническую трубку объемом 50 мл.
  4. Добавьте 7 мл питательной среды ВМЦ в пробирку объемом 50 мл и центрифугу при 180 х г в течение 5 мин. Аспиратный супернатант и повторно суспендированная клеточная гранула в 1 мл среды роста ВМЦ и определяют количество клеток. Выложите VIC в 60-миллиметровую посуду, обработанную культурой ткани, при 1,3 x 104 клетках/см2.
  5. Дайте клеткам вырасти по крайней мере за 1-2 дня до замены среды. Удалите среду и дважды вымойте DPBS, чтобы удалить остаточный мусор и заменить свежей питательной средой. Пополняйте среднюю каждые 2-3 дня. ВИК будут расти в форме фибробластов (рисунок 3B, правые панели).
  6. Когда VIC достигают слияния >90%, дважды мойте DPBS для удаления избытка среды и отделяйте клетки, добавляя соответствующий объем предварительно подогретого диссоциационного реагента для покрытия пластины (т. Е. 2-3 мл на посуду размером 10 см). Высиживайте блюдо в инкубаторе при температуре 37 °C. ВИК отделяются от блюда через 2-3 мин инкубации. Добавьте 4-6 мл предварительно нагретой среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеткам требуется более 3 минут, чтобы подняться с пластины, реагент диссоциации, возможно, потерял потенцию. При необходимости можно использовать клеточный скребок для осторожного подъема ячеек.
  7. Переложите клеточную суспензию в трубку и аккуратно центрифугируйте при 180 х г в течение 5 мин. После удаления супернатанта осторожно повторно суспендируют клеточную гранулу в предварительно подогретой среде роста ВМЦ и определяют количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра и трипана синего цвета. Засейте жизнеспособные клетки при плотности 1:2 исходного блюда (т.е. ~ 1 × 106 ячеек на тарелку размером 10 см или 1,3 х 104 клеток/см2).
  8. Оцените фенотип ВМЦ путем положительного окрашивания для иммунофлуоресцентных маркеров, таких как αSMA, CNN или SM22α, и отрицательного окрашивания для маркеров VEC, таких как CD31, CDH5 или vWF (рисунок 4, правые панели).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный здесь рабочий процесс протокола непредвзято выбирает одну брошюру для изоляции VEC и VICs, в то время как остальные листовки используются для окрашивания Von Kossa (раздел 5) и замораживания.

8. Длительное хранение клеток

  1. После расширения заморозьте клетки для длительного хранения. Промыть клетки дважды с помощью 2-5 мл DPBS, затем добавить достаточное количество реагента диссоциации для отделения клеток, как на этапах 6.8 и 7.6. Остановите пищеварение, добавив равный объем питательной среды VEC или VIC и переместив клеточную суспензию в трубку объемом 15 мл.
  2. Определите количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра и трипана синего цвета.
  3. Центрифуга при 180 х г в течение 5 мин.
  4. Повторное суспендирование клеток в охлажденных кондиционированных питательных средах до плотности клеток ~ 3 × 106 клеток/мл.
  5. Аккуратно с закручиванием добавьте равный объем охлажденной 2-кратной криоконсервационной среды. Это доведет концентрацию клеток до ~ 1,5 × 106 клеток/мл.
  6. Аликвот 1 мл в криоконсервационные флаконы. Поместите флаконы в контейнер для замораживания клеток, закройте и переверните 5-6 раз, чтобы клетки оставались взвешенными. Поместите контейнер при температуре -80 °C в течение 6-72 ч или в соответствии с протоколом замораживания контейнера. Снимите флаконы при температуре -80 °C и переведите в жидкий азот для длительного хранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В приведенном выше протоколе описываются шаги, необходимые для обработки тканей клапана человека и выделения и установления жизнеспособных клеточных линий из этих тканей. Листочки аортального клапана обрабатывают для встраивания парафина, замораживают для длительного хранения для биохимического или генетического анализа и переваривают для выделения ВЭК и ВИТК (рисунок 1). В то время как хирургические образцы, вероятно, будут иметь клинический диагноз стеноза аорты и могут проявлять тяжелые у...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Получение контрольных и болезненных тканей от человека имеет решающее значение для моделирования заболеваний in vitro и ex vivo; однако, в то время как часто говорят о проблемах преодоления разрыва между скамьей и кроватью, обратный порядок - переход от хирургического кабинета к скамье - часто столь же обескураживает разрыв. Важным для базового ученого для получения первичных образцов тканей человека является сотрудничество с ученым-хирургом, у которого есть команда медсестер, хирургических техников, помощников врачей, с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

IS получает институциональную исследовательскую поддержку от Atricure и Medtronic и выступает в качестве консультанта Medtronic Vascular. Ни один из этих конфликтов не связан с этой работой. Всем остальным Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Джейсона Доббинса за проницательное обсуждение и критическое прочтение этой рукописи. Мы хотели бы поблагодарить Центр восстановления органов и образования за их помощь и поддержку, а также поблагодарить доноров тканей и их семьи за то, что они сделали это исследование возможным. Все образцы пациентов собираются у лиц, включенных в исследования, одобренные институциональным наблюдательным советом Университета Питтсбурга в соответствии с Хельсинкской декларацией. Трупные ткани, полученные через Центр восстановления органов и образования (CORE), были одобрены Комитетом по надзору за исследованиями и клинической подготовкой с участием умерших (CORID) Университета Питтсбурга.

Некоторые фигуры созданы с помощью Biorender.com.

CSH поддерживается Национальным институтом сердца, легких и крови K22 HL117917 и R01 HL142932, Американской кардиологической ассоциацией 20IPA35260111.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,45 мкм; m фильтрThermo Scientific7211345Подготовительная пластина с коллагеновым покрытием
10 см Пластина для клеточной культурыGreiner Bio-One664160Клеточная культура/расширение клеточной линии
10 мл серологическая пипеткаFisher14955234VEC/VIC выделение, клеточная культура, расширение клеточной линии
1000 μ L фильтрующие наконечникиVWR76322-154Клеточная культура/расширение клеточной линии
10XL Фильтрующие наконечникиVWR76322-132Клеточная культура/расширение клеточной линии
15 мл конические пробиркиThermo Scientific339650Хранение тканей, выделение VIC/VEC
16% параформальдегидный водный растворЭлектронная микроскопия Sciences15710SФиксатор тканей и клеток
190 proof этанолDecon2801Дезинфекция
1x DPBS: без кальция, без магнияGibco14190250физиологического раствора. Изоляция VIC/VEC
1x PBSFisherBP2944100солевом растворе. Препарирование тканей, выделение VIC/VEC
20 μ L фильтровальные наконечникиVWR76322-134Клеточная культура/расширение клеточной линии
200 пруф этанолDecon2701Депарафинизация образцов тканей
2-пропанолFisherA416P 4Изготовление пластин с коллагеновым покрытием
5 мл серологическая пипеткаFisher14955233VEC/VIC выделение, клеточная культура, расширение клеточной линии
50 мл конические пробиркиThermo Научная339652Хранение тканей, изоляция VIC/VEC
60 мм чашкаGenClone25-260Изоляция VEC
6-луночная клеточная культуральная пластинаCorning3516Клеточная культура/расширение клеточной линии
Уксусная кислота, ледянаяFisherBP2401 500Изготовление пластин с коллагеновым покрытием
AlexaFluor 488 фаллоидинInvitrogenA12379Флуоресцентный f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage TransplantSolution Bridge to LifeBUW0011LТканевый раствор для хранения
Бычья сыворотка Альбумин, фракция V - Жирные кислоты без 25 гBioworld220700233подтверждением VEC с антителами CD31+ Dynabeads
Calponin 1 Abcamab46794Первичное антитело (VIC положительное окрашивание)
CD31 (PECAM-1) (89C2)Cell Signaling3528Первичное антитело (VEC положительное окрашивание)
CD31+ DynabeadsInvitrogen11155DVEC подтверждение с CD31+ Dynabeads
CDH5Cell Signaling2500Первичное антитело (VEC положительное окрашивание)
Клеточный фильтр с 0,70 μ m порыCorning431751выделение VIC
Коллаген 1, белок крысиного хвостаGibcoA1048301Изготовление пластин с коллагеновым покрытием
Коллагеназа IIWorthington Biochemical CorporationLS004176Переваривание тканей. Подготовка тканей, изоляция VIC/VEC
Conflikt Готовый к использованию дезинфицирующий спрейDecon4101Дезинфекция
Countess II Автоматизированный счетчик клетокInvitrogenA27977Автоматический счетчик клеток
Countess II многоразовые скользящие покровные стеклаInvitrogen2026hАвтоматизированный счетчик клеток Требуется скользящая крышка
CoverslipsFisher125485EОбразцы монтажных
клапанов Криогенные флаконыOlympus Plastics24-202Замораживание клеток/образцов тканей
Дезинфицирующий отбеливатель с CLOROMAX - Концентрированная формула CloroxN/AДезинфекция
DMEMGibco10569044Питательные среды. Расширение VIC
EBM - среда эндотелиальных клеток, базальная среда, фенол красный свободный 500Lonza WalkersvilleCC3129Питательная среда. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 набор SingleQuot KitLonza WalkersvilleCC4176Добавка к питательной среде. Расширение VEC Микроскоп
EVOS FLLife TechnologiesНомер модели: AME3300Флуоресцентная визуализация
EVOS XL МикроскопLife TechnologiesAMEX1000Визуализация клеток во время расширения клеточной линии
Фетальная бычья сыворотка - Premium SelectR& D SystemsS11550VIC expansion
Тонкие ножницыFine Science Tools14088-10Подготовка тканей, выделение VIC/VEC
Скребки для клеток Fisherbrand Fisher08-100-241VIC expansion
FungizoneGibco15290-026Противогрибковые: Тканевой препарат, выделение VIC/VEC
GentamicinGibco15710-064Антибиотик: Тканевой препарат, изоляция VIC/VEC
Стеклянные слайдыGlobe Scientific Inc1358Lобразцы монтажного клапана
Goat anti-Mouse 488InvitrogenA11001Флуоресцентное вторичное антитело
Goat Anti-Mouse 594InvitrogenA11005Флуоресцентное вторичное антитело
Goat Anti-rabbit 488InvitrogenA11008Флуоресцентный вторичное антитело
Goat anti-Rabbit 594InvitrogenA11012Флуоресцентное вторичное антитело
Invitrogen Countess II FL Многоразовое горлоInvitrogenA25750Требуется автоматизированный счетчик клеток
слайд Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)InvitrogenR37606Флуоресцентное противоокрашивание ядра
LM-HyCryo-STEM - 2X Криоконсервационный материал для стволовых клетокHyClone Laboratories, Inc.SR30002Хранение замороженных клеток
Монтаж MediumFisher Chemical PermountSP15-100Монтажный клапан для образцов
Mr. Frosty Контейнер для заморозкиNalgene51000001Контейнер для контролируемой заморозки образцов
Mycoplasma-ExS SprayPromoCellPK-CC91-5051Дезинфекция
Пенициллин-СтрептомицинGibco15140163Антибиотик. Расширение VIC
PlasmocinInvivogenANTMPTAnti-mycoplasma. Выделение и экспансия VIC/VEC
SM22a антителоAbcamab14106Первичное антитело (VIC положительное окрашивание)
Ножницы стандартного типаFine Science Tools14001-14Подготовка тканей, изоляция VIC/VEC
Стерильный ватный тампонPuritan25806 10WCVEC изоляция
Swingsette кассета для тканей человекаSimport ScientificM515-2Контейнер для встраивания тканей
Taylor Щипцы (17 см)Fine Science Tools11016-17Подготовка тканей, выделение VIC/VEC
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibcoраствор дляподсчета 15250061 клеток
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Расщепление VIC/VECs
Набор фон Косса Polysciences246331Окрашивание парафиновых срезов тканей для кальцификации
антитела фактора ВиллебрандаAbcamab68545Первичное антитело (VEC положительное окрашивание)
КсилолыFisher ChemicalX3S-4Депарафинизирующие образцы тканей
&альфа;SMA антителаAbcamab7817Первичное антитело (VIC положительное окрашивание)
крови

Ссылки

  1. Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
  2. Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
  3. Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
  4. Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
  5. Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
  6. Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419(2011).
  7. Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
  8. Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
  9. Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
  10. Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
  11. Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
  12. Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
  13. Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
  14. Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
  15. Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
  16. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
  17. Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
  18. Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
  19. Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
  20. Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
  21. Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
  22. Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465(2003).
  23. Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934(2019).
  24. Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
  25. Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
  26. Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
  27. Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).
  28. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158(2010).
  29. Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860(2014).
  30. Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  32. Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
  33. Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
  34. St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
  35. Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Изоляция клеток клапанакальцифицированный аортальный клапанэндотелиальные клетки клапанаинтерстициальные клетки клапанаколлагеназное перевариваниеиммунофлуоресцентное окрашиваниераствор для холодного хранениякультура тканейокрашивание по фон Косса
Выделение клеток первичного клапана человека для моделирования заболеваний in vitro
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.