Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Скрининг пептидов, которые активируют MRGPRX2 с использованием инженерных HEK-клеток

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62448

⸱

6 ноября 2021 г.

 ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, Donadeo Innovation Centre for Engineering, University of Alberta, 2School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

В этой статье

Краткое содержание

Описаны методы генерации библиотеки коротких пептидов, которые могут активировать тучные клетки через рецептор MRGPRX2. Связанные методы просты, недороги и могут быть распространены на другие клеточные рецепторы.

Аннотация

Идентификация лигандов, специфичных для терапевтически значимых клеточных рецепторов, имеет решающее значение для многих применений, включая проектирование и разработку новых терапевтических средств. Связанный с Mas рецептор G-белка-X2 (MRGPRX2) является важным рецептором, который регулирует активацию тучных клеток и, таким образом, направляет общий иммунный ответ. Многочисленные лиганды для MRGPRX2 были идентифицированы и включают эндогенные пептиды, такие как PAMP, defensins, LL-37 и другие фрагменты белка (т.е. деградированный альбумин). Дальнейшая идентификация специфических лигандов MRGPRX2 требует скрининга большого количества пептидов (т.е. пептидной библиотеки); однако тучные клетки трудно и дорого поддерживать in vitro и, следовательно, не экономично использовать для скрининга большого количества молекул. В настоящей статье демонстрируется способ проектирования, разработки и экранирования библиотеки небольших пептидных молекул с использованием MRGPRX2, экспрессивных HEK-клеток. Эта клеточная линия относительно проста и недорога в обслуживании и может быть использована для высокопроизводительного анализа in vitro. Чувствительный к кальцию флуоресцентный краситель Fura-2 для маркировки внутриклеточного потока кальция при активации использовался для мониторинга активации. Для расчета концентрации кальция использовалось отношение интенсивности флуоресценции Fura-2 при 510 нм к длинам волн возбуждения 340 и 380 нм. Пептидная библиотека, используемая для проверки этой системы, была основана на секретагоге эндогенного проадреномедуллина N-терминала 12 (PAMP-12), который, как известно, связывает MRGPRX2 с высокой специфичностью и аффинностью. Последующие пептиды были получены с помощью методов усечения аминокислот и аланина, примененных к PAMP-12. Метод, описанный здесь, прост и недорог, но при этом надежен для скрининга большой библиотеки соединений для идентификации связующих доменов и других важных параметров, которые играют важную роль в активации рецепторов.

Введение

Тустовые клетки являются неотъемлемой частью иммунной системы и играют решающую роль как во врожденных, так и в адаптивных иммунных реакциях. Тучные клетки в основном активируются либо связыванием антигена с иммуноглобулином E (IgE) - рецепторным комплексом FcεRI, либо недавно обнаруженным mas-родственным рецептором G-белка-X2 (MRGPRX2)1. Активация MRGPRX2 была связана с несколькими иммунными и воспалительными заболеваниями, и, следовательно, важно понимать механизм связывания рецептора с его лигандами2. Для этого была разработана библиотека небольших пептидных молекул, которые были экранированы против рецепторов MRGPRX2, которые были чрезмерно экспрессированы в клетках HEK. В ходе исследования библиотека пептидов была построена с использованием простых и универсальных методов сканирования аланина и усечения аминокислот. Сканирование аланина включает в себя замену определенных аминокислот остатком аланина. Аланин, будучи малым и нейтральным, лишает пептид специфических свойств, придающихся замененным остатком, и последовательно подчеркивает значение соответствующих физико-химических свойств аминокислоты в рецепторных взаимодействиях. Напротив, при усечении аминокислот пептидные последовательности устроены таким образом, что в нем отсутствует один или несколько аминокислотных остатков от N-терминала, С-терминала или обоих. Этот набор пептидов был использован для идентификации аминокислотных последовательностей, имеющих решающее значение для связывания MRGPRX2.

Опыт работы с линиями тучных клеток человека (LAD-2) показал, что эти клетки трудно культивировать и поддерживать in vitro:время удвоения в две недели, дорогостоящие средние добавки и прямое внимание, требуемое во время пассажа3. Эти атрибуты делают клетки непригодными для крупномасштабного скрининга потенциальных лигандов. В настоящем описании стабильно трансфектированные HEK-клетки, экспрессивающие рецептор MRGPRX2 (HEK-X2), использовали для скрининга пептидной библиотеки1. Клетки HEK-293 широко используются и изучаются для гетерологии экспрессии поверхностных рецепторов из-за их высокой эффективности трансфекции, более быстрой скорости удвоения и необходимости культивирования недорогих средних добавок в лаборатории4. Протокол трансфекта клеточной линии HEK-293 был продемонстрирован и хорошо известен5. Клетки HEK-293, стабильно экспрессирующие рецептор MRGPRX2 (пассаж 13-19), были активированы пептидами, полученными посредством N-усечения, C-усечения, N+C-усечения и сканирования аланина1. В качестве контроля использовались клетки ДИКОГО ТИПА HEK (HEK-WT) (пассаж 16-21). Внутриклеточное высвобождение кальция при активации контролировали для изучения активации на основе MRGPRX2.

Активация клеток MRGPRX2 сопровождается цитозольной мобилизацией кальция. Это регулируемое внутриклеточное высвобождение кальция в тучных клетках регулируется поступлением кальция в хранилище (SOCE), координируемым молекулой стромального взаимодействия 1 (STIM1); и занимает центральное место в каскаде иммунного ответа6,7. Для определения внутриклеточной концентрации кальция были использованы различные методы, в том числе пластырные зажимы и флуоресцентные красители8. Из всех доступных методов широко используются флуорометрические красители кальция в конъюгации с различными методами обнаружения9. Два типа флуорометрических красителей, которые приобрели интерес, а именно: одноволновые красители, такие как Fluo-4, и логометрические красители с двойной длиной волны, такие как Indo -1 и Fura-2. Преимущество, которое приносят логометрические красители с двумя длинами волн по сравнению с одноволновые красители, заключается в том, что ратиометрические красители корректируют экспериментальные ошибки, такие как загрузка красителя, фотоотбеливание и фокусировка10,11.

Фура-2 ацетоксиметиловый эфир (Fura-2 AM) представляет собой проникающий в клетку зелено-флуоресцентный краситель, возбуждение которого смещается на более низкую длину волны при связывании кальция. Экспериментально Fura-2 возбуждается при 340 и 380 нм, в то время как излучение регистрируется на 510 нм. При связывании кальция интенсивность флуоресценции при 340 нм увеличивается, а интенсивность 380 нм уменьшается, как показано на рисунке 1. Данные представлены в виде отношения интенсивности флуоресценции после возбуждения при 340 нм (F340) к интенсивности после возбуждения при 380 нм (F380), т.е. F340/F380. Соотношение F340/F380 пропорционально внутриклеточному кальцию, значение которого может быть рассчитано по уравнению Гринкевича12. Поскольку флуоресцентный сигнал получается от возбуждения красителя на двух длинах волн (340 нм и 380 нм), отношение флуоресцентных сигналов корректируется для экспериментальных факторов, таких как загрузка красителя, утечка красителя, фотоотбеливание и плотность клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Проектирование и разработка библиотеки пептидов

  1. Чтобы идентифицировать лиганды рецептора MRGPRX2 тучных клеток на основе известного лиганда, т.е. PAMP-1213,выполните следующие действия.
    1. Генерация N-усеченной пептидной библиотеки путем усечения N-концевых аминокислотных остатков лиганда последовательно путем синтеза твердофазных пептидов (SPPS).
    2. Генерация библиотеки С-усеченных пептидов путем усечения С-концевые аминокислотные остатки известного лиганда последовательно с помощью SPPS.
    3. Основываясь на результатах 1.1.1 и 1.1.2, генерируйте N+C-усеченную пептидную библиотеку с использованием SPPS путем усечения желаемых остатков от N и C-терминалов соответственно.
    4. Используют синтез твердофазных пептидов для синтезапептидов 13.
    5. Модифицируйте N-терминал в ацетиловую (Ac) группу, а С-терминал в амидную группу.
    6. Охарактеризовать пептид по чистоте с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) и по массе с помощью масс-спектрофотометра.
  2. Чтобы изучить значение конкретных аминокислот в родительской молекуле PAMP-12, выполните следующие шаги.
    1. Генерируйте библиотеку пептидов сканирования аланина, заменяя соответствующие аминокислотные остатки в молекуле пептида аланином, по одному с использованием SPPS. Модифицируйте N-терминал в ацетиловую (Ac) группу, а С-терминал в амидную группу.
    2. Охарактеризовать пептид по чистоте с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) и по массе с помощью масс-спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что синтезированные пептиды имеют высокую чистоту. Охарактеризовать пептиды можно с помощью масс-спектроскопии и ВЭЖХ.

2. Культура клеток in vitro

  1. Культивируйте клетки HEK-X2 и HEK-WT, выполнив следующие действия.
    1. Готовят культуральную среду, дополняя высокий уровень глюкозы DMEM 10% фетальной бычим сывороткой (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
    2. Проходя клетки в тканевой культуре (ТС), обработанной Т-75, культурой колб и растут в инкубаторе при 37 °C, содержащем 5% CO2,до тех пор, пока они не будут на 75-80% слиться.
    3. Как только 75% сливаются, промывают клетки и добавляют 2-3 мл трипсина в течение 2 - 3 мин. Инкубируют в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 для отсоединения клеток.
    4. Как только клетки отделятся, соберите клетки в трипсин. Добавить 6-9 мл свежей среды.
    5. Центрифугировать клетки при 1620 х г в течение 3-5 мин.
    6. После центрифугирования выбросьте супернатант для сбора гранул. Повторно суспендирует клетки в свежей питательной среде. Разбавьте клетки в соответствии с желаемой концентрацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: КЛЕТКИ HEK являются быстрорастущими клетками и, следовательно, оптимизируют добавки клеточной среды. Клетки HEK являются адгезив-клетками; пропускать их в обработанные ТС колбы для культивирований для поддержки адгезии.
  2. Подготовьте для эксперимента 96-хорошую пробирную пластину.
    1. Добавьте 200 мкл клеточной суспензии в каждую скважину с концентрацией 200 000 клеток/мл, чтобы посеять 40 000 клеток/колодец.
    2. Выращивайте клетки в течение 24 ч в инкубаторе 37 °C, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте плотность ячеек на скважину в зависимости от размера пластины и типа деформации ячейки. Проведите эксперимент в тройных сечениях в черной обработанной ТС 96 скважинной пластине с плоским прозрачным дном.

3. Фура-2 АМ кальциевый анализ

  1. Подготовьте краситель, выполнив следующие действия.
    1. Используйте краситель Fura-2 AM для эксперимента.
    2. Приготовьте буферный буфер HEPES-Tyrode (HTB), содержащий 25 мМ буфера HEPES, 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мг/мл глюкозы, 1 мг/мл бытового сывороточного альбумина (BSA) и свежевы добавленные 1,8 мМCaCl2 в автоклавной стерилизованной воде.
    3. Добавьте 50 мкл ДМСО во флакон Fura-2 AM по 50 мкг для приготовления 1 мМ раствора красителя Fura-2 AM. Добавьте 1 мкл 1 мМ красителя Fura-2 AM на мл свежей среды для приготовления питательной среды с концентрацией красителя 1 мкМ.
    4. Извлеките плиту из 96 скважин из инкубатора и выбросьте среду. Замените среду на среду для загрузки свежего красителя. Добавьте 200 мкл красильную среду в каждую скважину. Инкубируют клетки в течение 30-40 мин в инкубаторе 37 °C, 5% CO2.
    5. После 40 мин инкубации удалите среду. Промывайте ячейки с помощью буфера HTB. Добавьте 100 мкл буфера HTB для считывания флуоресценции. Возьмите пластину для флуоресцентных показаний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизировать концентрацию красителя в среде загрузки красителя. Утечка красителя и фотоотбеливание являются возможными проблемами, связанными с красителем. Добавьте CaCl2 свежим в буфер HTB, чтобы избежать осадков.

4. Активация клеток и флуоресцентное считывание

ПРИМЕЧАНИЕ: Считыватель флуоресцентных пластин с автоматизированной системой пипетирования позволяет автоматически переносить соединения из источника соединения на пробирную пластину без выведения пластины из считывателя пластин.

  1. Пока клетки инкубируются, установите считыватель пластин.
    1. Установите температуру на 37 °C.
    2. В разделе Параметрывыберите Flex.
    3. Установите режим чтения на Флуоресценция и Нижнее чтение.
    4. В области Длины волн установите число длин волн в 2. Установите для возбуждения значение 340 нм и 380 нм. Установите значение Emission (Излучение) на 510 нм.
    5. Оставьте значение Чувствительность по умолчанию.
    6. В области Синхронизацияустановите для установки значение Интервал равным 3,9 с. Установите время выполнения на 94 с, чтобы получить 25 с чтения.
    7. Затем выберите Тип пробирной пластины.
    8. Затем выберите Колодцы для чтения.
    9. В составном переносе установите передачу на 1 и начальный объем на 100 мкл. Установите высоту пипетки на 100 мкл, объем на 50 мкл и временную точку на 36 с, чтобы добавить соединение при 10-м чтении.
    10. Затем выберите тип пластины «Составной источник».
    11. Оставьте Triturate не использовать.
    12. Выберите подсказки в макете «Наконечники пипетки».
    13. Для составных и кончиковых колонокубедитесь, что переносимые соединения находятся в колонке 1 составной пластины. Установите для столбца Tip значение 1, а для столбца Compound — значение 1.
    14. Оставьте автокалибровку как ВКЛ.
    15. Нажмите кнопку ОК.
  2. Когда температура достигнет 37 °C, загрузите пластины в считыватель пластин.
    1. Нажмите камеру считывания, чтобы поместить пробирную пластину в считывательфлуоресцентных пластин.
    2. Нажмите кнопку Источник, чтобы поместить составную пластину. Готовят составную пластину, добавляя 200 мкл соответствующих пептидов, растворы иономицина и этиленгликоля-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА)-Тритон X-100.
    3. Нажмите на стойку для подсказок, чтобы положить наконечник. Используйте черный наконечник, чтобы избежать автофлуоресценции наконечника.
    4. После загрузки пластин просмотрите настройки программного обеспечения и нажмите Read.

5. Анализ данных

  1. Определение концентрации кальция из коэффициента флуоресценции по уравнению Гринкевича -
    figure-protocol-1
    где Kd - константа диссоциации Fura-2 AM, R - коэффициент излучения после возбуждения при 340 нм и 380 нм (F340/F380) для соответствующих пептидов,Rmax - максимальный коэффициент флуоресценции, наблюдаемый добавлением 50 мкл 30 мкМ иономицина, Rmin - минимальная флуоресценция, наблюдаемая добавлением 50 мКл 100 мМ EGTA/2,5% Тритона X-100, и F380min и F380max являются абсолютной интенсивностью флуоресценции Fura-2 AM в свободном и связанном состоянии кальция соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Машина дозирует жидкость с некоторой силой. Не устанавливайте высоту дозирования пептидов слишком близко к нижней части пластины; он может отсоегорать клетки. Используйте черные наконечники пипеток, чтобы избежать автофлуоресценции. Считайте максимальную флуоресценцию и минимальную флуоресценцию для каждой пластины для каждого эксперимента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Таблица 1 содержит пептидные последовательности, генерируемые путем терминального усечения аминокислот и сканирования аланина. Как показано в таблице 1, пептиднаяпоследовательность RKKWNKWALSR не содержит N-концевой фенилаланин (F) по отношению к своему родительскому PAMP-12 и, следовательно, является репрезентативным пептидом в N-усеченной библиотеке. Аналогичным образом, в FRKKWNKWALS был удален C-концевой серин PAMP-12, представляющий собой библиотеку пептидов, полученную из PAMP-12. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Передача сигналов кальция занимает центральное место в дегрануляции тучных клеток и широко используется в изучении взаимодействий рецептор-лиганд, идентификации лигандов и открытии лекарств14. MRGPRX2 является недавно обнаруженным рецептором тучных клеток, который, как было установлено, играет ключевую роль во многих воспалительных заболеваниях, таких как зуд, астма и атопический дерматит, среди прочих2. Кроме того, было показано, что несколько одобренных препаратов вызываю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

SR и LDU хотели бы отметить грант Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC и NSERC-Discovery для этого проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бычий сывороточный альбуминSigma Aldrich5470
Хлорид кальцияSigma Aldrich793939
Corning 96 WellSigma AldrichCLS3603
черный полистирол МикропластинаSigma AldrichCLS3603
DMEMThermo Fischer11995065высоким содержанием
глюкозы DMSOThermo FischerD12345Стерильная, биологическая степень
EGTASigma AldrichE3889
Фетальная бычья сывороткаThermo Fischer12483-020
Flexstation 3Молекулярные устройстваFV06060
Fura-2 AMThermo FischerF1221
ГлюкозаSigma AldrichD8270
HEPES буферThermo Fischer15630-080
ИономицинSigma AldrichI9657
L ГлутаминThermo Fischer25030-081
Pen StrepThermo Fischer15140122
пептидыRS SyntehsisCustom≥ 95% чистоты;
N терминал - ацетильная группа
C терминал - амидная группа
Хлорид калияSigma Aldrich12636
Хлорид натрияSigma AldrichS9888
TritonX-100DOW Chemical166704

Ссылки

  1. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
  2. Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
  3. Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
  4. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  5. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568(2015).
  6. Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143(2020).
  7. Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
  8. Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
  9. Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527(2015).
  10. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  11. Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  13. Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
  14. Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
  15. Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628(2018).
  16. Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
  17. Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MRGPRX2Fura 2
Скрининг пептидов, которые активируют MRGPRX2 с использованием инженерных HEK-клеток
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.