Скрининг пептидов, которые активируют MRGPRX2 с использованием инженерных HEK-клеток

Тустовые клетки являются неотъемлемой частью иммунной системы и играют решающую роль как во врожденных, так и в адаптивных иммунных реакциях. Тучные клетки в основном активируются либо связыванием антигена с иммуноглобулином E (IgE) - рецепторным комплексом FcεRI, либо недавно обнаруженным mas-родственным рецептором G-белка-X2 (MRGPRX2)^1. Активация MRGPRX2 была связана с несколькими иммунными и воспалительными заболеваниями, и, следовательно, важно понимать механизм связывания рецептора с его лигандами^2. Для этого была разработана библиотека небольших пептидных молекул, которые были экранированы против рецепторов MRGPRX2, которые были чрезмерно экспрессированы в клетках HEK. В ходе исследования библиотека пептидов была построена с использованием простых и универсальных методов сканирования аланина и усечения аминокислот. Сканирование аланина включает в себя замену определенных аминокислот остатком аланина. Аланин, будучи малым и нейтральным, лишает пептид специфических свойств, придающихся замененным остатком, и последовательно подчеркивает значение соответствующих физико-химических свойств аминокислоты в рецепторных взаимодействиях. Напротив, при усечении аминокислот пептидные последовательности устроены таким образом, что в нем отсутствует один или несколько аминокислотных остатков от N-терминала, С-терминала или обоих. Этот набор пептидов был использован для идентификации аминокислотных последовательностей, имеющих решающее значение для связывания MRGPRX2.

Опыт работы с линиями тучных клеток человека (LAD-2) показал, что эти клетки трудно культивировать и поддерживать in vitro:время удвоения в две недели, дорогостоящие средние добавки и прямое внимание, требуемое во время пассажа^3. Эти атрибуты делают клетки непригодными для крупномасштабного скрининга потенциальных лигандов. В настоящем описании стабильно трансфектированные HEK-клетки, экспрессивающие рецептор MRGPRX2 (HEK-X2), использовали для скрининга пептидной библиотеки^1. Клетки HEK-293 широко используются и изучаются для гетерологии экспрессии поверхностных рецепторов из-за их высокой эффективности трансфекции, более быстрой скорости удвоения и необходимости культивирования недорогих средних добавок в лаборатории^4. Протокол трансфекта клеточной линии HEK-293 был продемонстрирован и хорошо известен^5. Клетки HEK-293, стабильно экспрессирующие рецептор MRGPRX2 (пассаж 13-19), были активированы пептидами, полученными посредством N-усечения, C-усечения, N+C-усечения и сканирования аланина^1. В качестве контроля использовались клетки ДИКОГО ТИПА HEK (HEK-WT) (пассаж 16-21). Внутриклеточное высвобождение кальция при активации контролировали для изучения активации на основе MRGPRX2.

Активация клеток MRGPRX2 сопровождается цитозольной мобилизацией кальция. Это регулируемое внутриклеточное высвобождение кальция в тучных клетках регулируется поступлением кальция в хранилище (SOCE), координируемым молекулой стромального взаимодействия 1 (STIM1); и занимает центральное место в каскаде иммунного ответа^6,7. Для определения внутриклеточной концентрации кальция были использованы различные методы, в том числе пластырные зажимы и флуоресцентные красители^8. Из всех доступных методов широко используются флуорометрические красители кальция в конъюгации с различными методами обнаружения^9. Два типа флуорометрических красителей, которые приобрели интерес, а именно: одноволновые красители, такие как Fluo-4, и логометрические красители с двойной длиной волны, такие как Indo -1 и Fura-2. Преимущество, которое приносят логометрические красители с двумя длинами волн по сравнению с одноволновые красители, заключается в том, что ратиометрические красители корректируют экспериментальные ошибки, такие как загрузка красителя, фотоотбеливание и фокусировка^10,11.

Фура-2 ацетоксиметиловый эфир (Fura-2 AM) представляет собой проникающий в клетку зелено-флуоресцентный краситель, возбуждение которого смещается на более низкую длину волны при связывании кальция. Экспериментально Fura-2 возбуждается при 340 и 380 нм, в то время как излучение регистрируется на 510 нм. При связывании кальция интенсивность флуоресценции при 340 нм увеличивается, а интенсивность 380 нм уменьшается, как показано на рисунке 1. Данные представлены в виде отношения интенсивности флуоресценции после возбуждения при 340 нм (F340) к интенсивности после возбуждения при 380 нм (F380), т.е. F340/F380. Соотношение F340/F380 пропорционально внутриклеточному кальцию, значение которого может быть рассчитано по уравнению Гринкевича^12. Поскольку флуоресцентный сигнал получается от возбуждения красителя на двух длинах волн (340 нм и 380 нм), отношение флуоресцентных сигналов корректируется для экспериментальных факторов, таких как загрузка красителя, утечка красителя, фотоотбеливание и плотность клеток.

1. Проектирование и разработка библиотеки пептидов

1. Чтобы идентифицировать лиганды рецептора MRGPRX2 тучных клеток на основе известного лиганда, т.е. PAMP-12^13,выполните следующие действия.
   1. Генерация N-усеченной пептидной библиотеки путем усечения N-концевых аминокислотных остатков лиганда последовательно путем синтеза твердофазных пептидов (SPPS).
   2. Генерация библиотеки С-усеченных пептидов путем усечения С-концевые аминокислотные остатки известного лиганда последовательно с помощью SPPS.
   3. Основываясь на результатах 1.1.1 и 1.1.2, генерируйте N+C-усеченную пептидную библиотеку с использованием SPPS путем усечения желаемых остатков от N и C-терминалов соответственно.
   4. Используют синтез твердофазных пептидов для синтеза^{пептидов 13.}
   5. Модифицируйте N-терминал в ацетиловую (Ac) группу, а С-терминал в амидную группу.
   6. Охарактеризовать пептид по чистоте с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) и по массе с помощью масс-спектрофотометра.
2. Чтобы изучить значение конкретных аминокислот в родительской молекуле PAMP-12, выполните следующие шаги.
   1. Генерируйте библиотеку пептидов сканирования аланина, заменяя соответствующие аминокислотные остатки в молекуле пептида аланином, по одному с использованием SPPS. Модифицируйте N-терминал в ацетиловую (Ac) группу, а С-терминал в амидную группу.
   2. Охарактеризовать пептид по чистоте с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) и по массе с помощью масс-спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что синтезированные пептиды имеют высокую чистоту. Охарактеризовать пептиды можно с помощью масс-спектроскопии и ВЭЖХ.

2. Культура клеток in vitro

1. Культивируйте клетки HEK-X2 и HEK-WT, выполнив следующие действия.
   1. Готовят культуральную среду, дополняя высокий уровень глюкозы DMEM 10% фетальной бычим сывороткой (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
   2. Проходя клетки в тканевой культуре (ТС), обработанной Т-75, культурой колб и растут в инкубаторе при 37 °C, содержащем 5% CO_2,до тех пор, пока они не будут на 75-80% слиться.
   3. Как только 75% сливаются, промывают клетки и добавляют 2-3 мл трипсина в течение 2 - 3 мин. Инкубируют в инкубаторе 37 °C, 5% CO₂ для отсоединения клеток.
   4. Как только клетки отделятся, соберите клетки в трипсин. Добавить 6-9 мл свежей среды.
   5. Центрифугировать клетки при 1620 х г в течение 3-5 мин.
   6. После центрифугирования выбросьте супернатант для сбора гранул. Повторно суспендирует клетки в свежей питательной среде. Разбавьте клетки в соответствии с желаемой концентрацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: КЛЕТКИ HEK являются быстрорастущими клетками и, следовательно, оптимизируют добавки клеточной среды. Клетки HEK являются адгезив-клетками; пропускать их в обработанные ТС колбы для культивирований для поддержки адгезии.
2. Подготовьте для эксперимента 96-хорошую пробирную пластину.
   1. Добавьте 200 мкл клеточной суспензии в каждую скважину с концентрацией 200 000 клеток/мл, чтобы посеять 40 000 клеток/колодец.
   2. Выращивайте клетки в течение 24 ч в инкубаторе 37 °C, 5% CO_2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте плотность ячеек на скважину в зависимости от размера пластины и типа деформации ячейки. Проведите эксперимент в тройных сечениях в черной обработанной ТС 96 скважинной пластине с плоским прозрачным дном.

3. Фура-2 АМ кальциевый анализ

1. Подготовьте краситель, выполнив следующие действия.
   1. Используйте краситель Fura-2 AM для эксперимента.
   2. Приготовьте буферный буфер HEPES-Tyrode (HTB), содержащий 25 мМ буфера HEPES, 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мг/мл глюкозы, 1 мг/мл бытового сывороточного альбумина (BSA) и свежевы добавленные 1,8 мМ_CaCl2 в автоклавной стерилизованной воде.
   3. Добавьте 50 мкл ДМСО во флакон Fura-2 AM по 50 мкг для приготовления 1 мМ раствора красителя Fura-2 AM. Добавьте 1 мкл 1 мМ красителя Fura-2 AM на мл свежей среды для приготовления питательной среды с концентрацией красителя 1 мкМ.
   4. Извлеките плиту из 96 скважин из инкубатора и выбросьте среду. Замените среду на среду для загрузки свежего красителя. Добавьте 200 мкл красильную среду в каждую скважину. Инкубируют клетки в течение 30-40 мин в инкубаторе 37 °C, 5% CO_2.
   5. После 40 мин инкубации удалите среду. Промывайте ячейки с помощью буфера HTB. Добавьте 100 мкл буфера HTB для считывания флуоресценции. Возьмите пластину для флуоресцентных показаний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизировать концентрацию красителя в среде загрузки красителя. Утечка красителя и фотоотбеливание являются возможными проблемами, связанными с красителем. Добавьте CaCl₂ свежим в буфер HTB, чтобы избежать осадков.

4. Активация клеток и флуоресцентное считывание

ПРИМЕЧАНИЕ: Считыватель флуоресцентных пластин с автоматизированной системой пипетирования позволяет автоматически переносить соединения из источника соединения на пробирную пластину без выведения пластины из считывателя пластин.

1. Пока клетки инкубируются, установите считыватель пластин.
   1. Установите температуру на 37 °C.
   2. В разделе Параметрывыберите Flex.
   3. Установите режим чтения на Флуоресценция и Нижнее чтение.
   4. В области Длины волн установите число длин волн в 2. Установите для возбуждения значение 340 нм и 380 нм. Установите значение Emission (Излучение) на 510 нм.
   5. Оставьте значение Чувствительность по умолчанию.
   6. В области Синхронизацияустановите для установки значение Интервал равным 3,9 с. Установите время выполнения на 94 с, чтобы получить 25 с чтения.
   7. Затем выберите Тип пробирной пластины.
   8. Затем выберите Колодцы для чтения.
   9. В составном переносе установите передачу на 1 и начальный объем на 100 мкл. Установите высоту пипетки на 100 мкл, объем на 50 мкл и временную точку на 36 с, чтобы добавить соединение при 10-м чтении.
   10. Затем выберите тип пластины «Составной источник».
   11. Оставьте Triturate не использовать.
   12. Выберите подсказки в макете «Наконечники пипетки».
   13. Для составных и кончиковых колонокубедитесь, что переносимые соединения находятся в колонке 1 составной пластины. Установите для столбца Tip значение 1, а для столбца Compound — значение 1.
   14. Оставьте автокалибровку как ВКЛ.
   15. Нажмите кнопку ОК.
2. Когда температура достигнет 37 °C, загрузите пластины в считыватель пластин.
   1. Нажмите камеру считывания, чтобы поместить пробирную пластину в считывательфлуоресцентных пластин.
   2. Нажмите кнопку Источник, чтобы поместить составную пластину. Готовят составную пластину, добавляя 200 мкл соответствующих пептидов, растворы иономицина и этиленгликоля-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА)-Тритон X-100.
   3. Нажмите на стойку для подсказок, чтобы положить наконечник. Используйте черный наконечник, чтобы избежать автофлуоресценции наконечника.
   4. После загрузки пластин просмотрите настройки программного обеспечения и нажмите Read.

5. Анализ данных

1. Определение концентрации кальция из коэффициента флуоресценции по уравнению Гринкевича -
   
   где K_d - константа диссоциации Fura-2 AM, R - коэффициент излучения после возбуждения при 340 нм и 380 нм (F340/F380) для соответствующих пептидов,_Rmax - максимальный коэффициент флуоресценции, наблюдаемый добавлением 50 мкл 30 мкМ иономицина, R_min - минимальная флуоресценция, наблюдаемая добавлением 50 мКл 100 мМ EGTA/2,5% Тритона X-100, и F380_min и F380_max являются абсолютной интенсивностью флуоресценции Fura-2 AM в свободном и связанном состоянии кальция соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Машина дозирует жидкость с некоторой силой. Не устанавливайте высоту дозирования пептидов слишком близко к нижней части пластины; он может отсоегорать клетки. Используйте черные наконечники пипеток, чтобы избежать автофлуоресценции. Считайте максимальную флуоресценцию и минимальную флуоресценцию для каждой пластины для каждого эксперимента.

Таблица 1 содержит пептидные последовательности, генерируемые путем терминального усечения аминокислот и сканирования аланина. Как показано в таблице 1, пептиднаяпоследовательность RKKWNKWALSR не содержит N-концевой фенилаланин (F) по отношению к своему родительскому PAMP-12 и, следовательно, является репрезентативным пептидом в N-усеченной библиотеке. Аналогичным образом, в FRKKWNKWALS был удален C-концевой серин PAMP-12, представляющий собой библиотеку пептидов, полученную из PAMP-12. В библиотеке N+C-усеченных пептидов аминокислоты как из N,так и из C-терминала удаляются. Усечение 4 аминокислот из N-терминала и 1 остатка из С-терминала PAMP-12 приводит к WNKWALS. Пептидная библиотека, полученная из сканирования аланина, имеет одну аминокислоту, замененную аланином, как в ARKKWNKWALSR, где N-концевой фенилаланин заменяется аланином. Краситель Fura-2 AM был использован для изучения потенциала активации пептидов против трансфектированных HEK-клеток MRGPRX21. Данные были записаны на флуоресцентную пластинчатую считыватель. Если пептидный лиганд активирует клетку, флуоресценция, перекачиваемая при 340 нм (F340), увеличивается, в то время как та же уменьшается для длины волны 380 нм (F380)(рисунок 1a). Однако для пустого (или, если на то пошло, неактивирующего пептида или контроля HEK-WT) относительное увеличение и уменьшение будут соответственно низкими, как показано на рисунке 2a. Концентрация кальция, однако, представлена соотношением F340/F380, как показано на рисунке 1b,2b. Соотношение F340/F380 может быть дополнительно заменено в уравнении Гринкевича для получения концентрации кальция с использованием калибровки in situ(рисунок 3). Пептиды, перечисленные в таблице 1, характеризовались масс-спектроскопией(рисунок 4a)и ВЭЖХ(рисунок 4b)и были признаны высокой чистотой.

Таблица 1: Репрезентативные пептидные последовательности, генерируемые после N, C и N+C - усечения и сканирования аланина. N-терминал пептидов был модифицирован ацетилом, в то время как С-терминал содержал амидную группу.

Рисунок 1:Репрезентативные данные для активирующего пептида. (a)Флуоресцентные сигналы для активирующего пептида. Представленные данные соответствуют ПАМП-12 (FRKKWNKWALSR). Пептид был добавлен после генерации базового уровня для 10 циклов считывания (36 с), как показано стрелкой. b)Отношение флуоресцентного излучения после возбуждения при 340 нм (F340) к соотношению флуоресцентного излучения после возбуждения при 380 нм (F380) (F340/F380). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Репрезентативные данные для пустого. (a)Флуоресцентные сигналы для бланка. HTB был добавлен после создания базового уровня для 10 циклов чтения (36 с), как показано стрелкой. b)Отношение флуоресцентного излучения после возбуждения при 340 нм (F340) к соотношению флуоресцентного излучения после возбуждения при 380 нм (F380) (F340/F380). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Репрезентативные данные для стандартов калибровки красителей. (a) Иономицин добавляли при 10-м показаниях, как показано стрелкой, чтобы получить максимальную флуоресценцию в связанном состоянии Ca+ 2. EGTA-Triton X-100 был добавлен после 20 показаний, как показано стрелкой, чтобы получить минимальный сигнал. b)Отношение флуоресцентного излучения после возбуждения при 340 нм (F340) к соотношению флуоресцентного излучения после возбуждения при 380 нм (F380) (F340/F380). Эти значения далее помещаются в уравнение Гринкевича, чтобы получить внутриклеточную концентрацию кальция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Характеристика репрезентативного пептида для подтверждения последовательности и чистоты. (a)Теоретическая масса репрезентативной пептидной последовательности WNKWAL составляла 857,90 Да, что было показано соотношением m/z в масс-спектроскопии. (b)Чистота пептида 99%, подтвержденная ВЭЖХ. Этот пептид относится к N+C-усеченной библиотеке пептидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.