Вопросы сбора, обработки и хранения для исследования биомаркеров мочи

Summary

Этот протокол направлен на то, чтобы предоставить рекомендации по сбору, обработке и хранению образцов мочи для исследований биомаркеров инфекций мочевыводящих путей.

Abstract

Существует несколько белков мочевого пузыря, которые являются многообещающими в качестве новых маркеров инфекций мочевыводящих путей. Идентификация нового биомаркера, который имеет большую прогностическую точность по сравнению с существующими методами диагностики, может значительно улучшить способность пациентов с инфекциями мочевыводящих путей. Тем не менее, сбор, обработка и хранение образцов могут потенциально повлиять на результаты исследований биомаркеров. Понимание влияния каждого из этих этапов на исследования биомаркеров необходимо для информирования будущих высококачественных исследований в этой области, а также для критического обзора других исследований в этой области. В этом исследовании представлен обзор литературы о влиянии каждого этапа обработки образцов мочи и сообщается о влиянии различных состояний на белки мочи. Протокол будет сосредоточен на методах сбора, времени и температуре хранения, методах обработки, использовании реагентов и долгосрочном замораживании стабильности биомаркеров. Основное внимание будет уделено белкам, но кратко обсудят другие материалы, которые могут быть использованы в исследованиях биомаркеров. При этом этот протокол предоставит руководство для будущих исследователей, которое поможет в планировании исследований биомаркеров мочевого пузыря.

Introduction

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одной из наиболее распространенных бактериальных инфекций как у детей, так и у взрослых¹. В то время как диагностика ИМП в некоторых популяциях может быть несложной, она может быть более сложной в других, например, у пациентов с нейропатическим мочевым пузырем². Возможность точной диагностики ИМП поможет улучшить усилия по контролю антибиотиков за счет сокращения использования ненужных антибиотиков и потенциально поможет в ранней диагностике ИМП, тем самым снижая риск заболеваемости. Учитывая распространенность ИМП, существует значительный интерес к улучшению ведения этой распространенной инфекции.

В литературе появляется все больше новых биомаркеров, которые демонстрируют многообещающую способность диагностировать ИМП 3,4,5,6,7. Тем не менее, существует несколько факторов, связанных с обработкой образцов мочи, которые могут изменить результаты. Эти факторы варьируются от методов сбора, температуры и продолжительности краткосрочного и долгосрочного хранения, методов обработки, использования реагентов и циклов замораживания-размораживания⁸. Понимание того, как изменения в каждом из них могут повлиять на показания биомаркеров, необходимо как для критической интерпретации исследований в литературе, так и для разработки высококачественных исследований, ориентированных на биомаркеры мочи.

Здесь представлен повествовательный обзор литературы о влиянии каждого фактора, включая методы сбора, краткосрочную и долгосрочную температуру и продолжительность хранения, использование реагентов и влияние циклов замораживания-размораживания, на белки, которые могут быть полезны в качестве биомаркеров мочи, и дают рекомендации по оптимальной обработке на основе этого обзора литературы. Этот протокол будет сосредоточен на белковых биомаркерах, измеренных с помощью вестерн-блоттинга или ИФА.

Protocol

Этот протокол соответствует руководящим принципам комитета по этике исследований на людях учреждения. Убедитесь, что одобрение получено от институционального наблюдательного совета (IRB) до сбора и использования биологических образцов для исследований.

1. Сбор

1. Возьмите образец мочи в стерильную чашку для образцов. Определите тип образца мочи, а также конкретные критерии включения и исключения на основе конкретного дизайна исследования. Для исследований ИМП используйте либо метод «чистой уловки», либо катетеризацию, чтобы избежать загрязнения промежности.
2. Чтобы получить чистый образец мочи, попросите участников протереть периуретральную область салфеткой, опорожнить небольшое количество мочи в унитаз, а затем помочиться в чашку для образца.
3. Проинструктируйте женщин использовать пальцы для раздвигания половых губ, а мужчин — втягивать крайнюю плоть (если применимо) перед мочеиспусканием, чтобы избежать загрязнения.
4. Запишите время сбора.
5. Соберите соответствующие клинические данные от каждого участника, в соответствии с индивидуальным дизайном исследования и вопросом исследования.
6. Рассмотрите возможность проведения анализа мочи или мочевого щупа для каждого образца перед обработкой и хранением, если эти данные ненадежно доступны из электронной медицинской карты.

2. Обработка и хранение проб

1. Немедленно обработайте образцы. Если это невозможно, храните образец при температуре 4 °C до 24 часов.
2. Если образцы нельзя хранить при температуре 4 °C или необходимо хранить при 4 °C дольше 24 часов, добавьте в образцы 0,2 М борной кислоты или 10 мМ_NaN3 . Убедитесь, что такие реагенты совместимы с запланированными последующими применениями.
3. Запишите продолжительность времени, в течение которого образцы проводят при температуре 4 °C.
4. Центрифугируйте образцы при давлении 1000-1500 x g в течение 10-20 минут. Центрифугирование не обязательно должно осуществляться при температуре 4 °C.
5. Соберите надосадочную жидкость и распределите ее по отдельным микроцентрифужным пробиркам.
6. Наклейте на пробирки несколько четких идентификаторов (например, дату и идентификацию образца (ID)). Рассмотрите возможность использования сгенерированных компьютером штрихкодов, специально разработанных для хранения биологических образцов при температуре -80 °C. Если это невозможно, убедитесь, что ручка, используемая для маркировки образцов, является водостойкой.
7. Пометьте каждую морозильную камеру так, чтобы у каждого места был определенный код. Для этого пронумеруйте каждый столбец отдельной буквой, а каждую строку — номером. Это позволит создавать карты или другие руководства для удобного определения местоположения образцов.
8. Немедленно заморозьте образцы при температуре -80 °C. Запишите время заморозки.
9. Разморозьте образцы на водяной бане при температуре 37 °C в день измерения, чтобы свести к минимуму ненужное хранение при комнатной температуре или 4 °C.
10. Запишите время и количество дополнительных циклов замораживания-оттаивания для каждой аликвоты.

3. Анализ

1. При использовании имеющихся в продаже ИФА следует следовать инструкциям производителя.
2. Запустите образцы в двух экземплярах.
3. Определите ожидаемую концентрацию интересующего белка, чтобы убедиться, что уровни белка в образцах находятся в пределах диапазона, указанного в наборе. Если ожидаемый уровень белка превышает верхнюю норму, разведите пробы.
4. После того, как будут получены данные с помощью планшетного ридера (ИФА) или вестерн-блоттинга, определите концентрацию каждого биомаркера в образце вручную (не рекомендуется) или с помощью любого программного обеспечения.
5. Проанализируйте результаты. Анализ данных зависит от индивидуального дизайна исследования.
6. Рассмотрите возможность корректировки значений биомаркеров с учетом концентрации мочи.
   Примечание: Традиционно, исследователи биомаркеров использовали креатинин мочи в качестве метода нормализации, особенно у участников с нормальной функцией почек, чтобы учесть концентрацию мочи. Тем не менее, другие сообщают, что нормализация не влияет на результаты⁴. Чтобы преодолеть это препятствие, некоторые исследователи сообщают как о нормализованных, так и о ненормализованных результатах.
7. Рекомендуется указывать в опубликованных рукописях диапазоны времени от сбора до замораживания, а также продолжительность времени при температуре 4 °C перед обработкой, чтобы можно было интерпретировать результаты в контексте обработки образцов (рис. 1)

4. Влияние различных условий хранения на нейтрофильный желатиназа-ассоциированный липокалин (NGAL).

1. Добавьте в свежую мочу 2 нг/мл рекомбинантного NGAL.
2. Аликвотируйте мочу и подвергайте ее различным условиям обработки и хранения.
   1. Центрифугируйте мочу при 1000-1500 х г в течение 10-20 минут. Центрифугирование не обязательно должно осуществляться при температуре 4 °C. Хранить при различных условиях (20 °C, 4 °C, -20 °C) в течение 24 часов, 48 часов или 72 часов.
   2. Храните аликвоту образца при температуре -80 °C для сравнения.
3. После поддержания образцов в различных условиях, как указано в шаге 4.2.1, измерьте уровни NGAL в образцах с помощью имеющегося в продаже набора ELISA, который включает в себя элементы управления в соответствии с инструкциями производителя.

Results

Центрифугирование оказало небольшое влияние на уровень NGAL. Центрифугированные пробы, хранившиеся при температуре -80 °C, имели более низкие уровни NGAL, чем нецентрифугированные образцы (2,17 нг/мл ± 0,32 нг/мл, 2,77 нг/мл ± 0,21 нг/мл). Циклы замораживания также оказывали влияние на уровни NGAL после третьего цикла замораживания-оттаивания. (Рисунок 2). Из изученных условий (центрифугирование, циклы замораживания-оттаивания и температура хранения) наибольшее влияние на уровень NGAL оказал...

Discussion

Важность получения последовательных и воспроизводимых результатов не ограничивается успехом отдельных исследований, но также позволяет лучше сравнивать результаты в рамках литературы⁹. Различия между исследованиями по ключевым процедурным этапам могут привести к необратимой систематической ошибке, которая может повлиять на сигналы биомаркеров и их интерпретацию, что может быть причиной расхождений между^{несколькими исследованиями}. Это демонс...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Борная кислота	Sigma-Aldrich	B6768	Рекомендуется для образцов, которые не могут быть быстро обработаны и заморожены
Морозильные камеры	Fisher Scientific	03-395-464
Микроцентрифужные пробирки	Thomas Scientific	1149X93
NGAL ELISA Kit	R& D Systems	DLCN20	Используется для получения репрезентативных результатов
Пипетки и наконечники	В зависимости от размера пипетки и объема жидкости.
Азид натрия	Sigma-Aldrich	S2002	Следует рассматривать для образцов, которые не могут быть быстро обработаны и заморожены
Стаканчики для сбора мочи Thermo	Scientific	3122B03ORG	Стерильные стаканчики не требуются, если они не требуются для других исследований