Методическая статья

Вопросы сбора, обработки и хранения для исследования биомаркеров мочи

DOI:

10.3791/62453

⸱

21 октября 2021 г.

 , 
1Department of Pediatrics, University of Pittsburgh

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол направлен на то, чтобы предоставить рекомендации по сбору, обработке и хранению образцов мочи для исследований биомаркеров инфекций мочевыводящих путей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует несколько белков мочевого пузыря, которые являются многообещающими в качестве новых маркеров инфекций мочевыводящих путей. Идентификация нового биомаркера, который имеет большую прогностическую точность по сравнению с существующими методами диагностики, может значительно улучшить способность пациентов с инфекциями мочевыводящих путей. Тем не менее, сбор, обработка и хранение образцов могут потенциально повлиять на результаты исследований биомаркеров. Понимание влияния каждого из этих этапов на исследования биомаркеров необходимо для информирования будущих высококачественных исследований в этой области, а также для критического обзора других исследований в этой области. В этом исследовании представлен обзор литературы о влиянии каждого этапа обработки образцов мочи и сообщается о влиянии различных состояний на белки мочи. Протокол будет сосредоточен на методах сбора, времени и температуре хранения, методах обработки, использовании реагентов и долгосрочном замораживании стабильности биомаркеров. Основное внимание будет уделено белкам, но кратко обсудят другие материалы, которые могут быть использованы в исследованиях биомаркеров. При этом этот протокол предоставит руководство для будущих исследователей, которое поможет в планировании исследований биомаркеров мочевого пузыря.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одной из наиболее распространенных бактериальных инфекций как у детей, так и у взрослых1. В то время как диагностика ИМП в некоторых популяциях может быть несложной, она может быть более сложной в других, например, у пациентов с нейропатическим мочевым пузырем2. Возможность точной диагностики ИМП поможет улучшить усилия по контролю антибиотиков за счет сокращения использования ненужных антибиотиков и потенциально поможет в ранней диагностике ИМП, тем самым снижая риск заболеваемости. Учитывая распространенность ИМП, существует значительный интерес к улучшению ведения этой распространенной инфекции.

В литературе появляется все больше новых биомаркеров, которые демонстрируют многообещающую способность диагностировать ИМП 3,4,5,6,7. Тем не менее, существует несколько факторов, связанных с обработкой образцов мочи, которые могут изменить результаты. Эти факторы варьируются от методов сбора, температуры и продолжительности краткосрочного и долгосрочного хранения, методов обработки, использования реагентов и циклов замораживания-размораживания8. Понимание того, как изменения в каждом из них могут повлиять на показания биомаркеров, необходимо как для критической интерпретации исследований в литературе, так и для разработки высококачественных исследований, ориентированных на биомаркеры мочи.

Здесь представлен повествовательный обзор литературы о влиянии каждого фактора, включая методы сбора, краткосрочную и долгосрочную температуру и продолжительность хранения, использование реагентов и влияние циклов замораживания-размораживания, на белки, которые могут быть полезны в качестве биомаркеров мочи, и дают рекомендации по оптимальной обработке на основе этого обзора литературы. Этот протокол будет сосредоточен на белковых биомаркерах, измеренных с помощью вестерн-блоттинга или ИФА.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол соответствует руководящим принципам комитета по этике исследований на людях учреждения. Убедитесь, что одобрение получено от институционального наблюдательного совета (IRB) до сбора и использования биологических образцов для исследований.

1. Сбор

  1. Возьмите образец мочи в стерильную чашку для образцов. Определите тип образца мочи, а также конкретные критерии включения и исключения на основе конкретного дизайна исследования. Для исследований ИМП используйте либо метод «чистой уловки», либо катетеризацию, чтобы избежать загрязнения промежности.
  2. Чтобы получить чистый образец мочи, попросите участников протереть периуретральную область салфеткой, опорожнить небольшое количество мочи в унитаз, а затем помочиться в чашку для образца.
  3. Проинструктируйте женщин использовать пальцы для раздвигания половых губ, а мужчин — втягивать крайнюю плоть (если применимо) перед мочеиспусканием, чтобы избежать загрязнения.
  4. Запишите время сбора.
  5. Соберите соответствующие клинические данные от каждого участника, в соответствии с индивидуальным дизайном исследования и вопросом исследования.
  6. Рассмотрите возможность проведения анализа мочи или мочевого щупа для каждого образца перед обработкой и хранением, если эти данные ненадежно доступны из электронной медицинской карты.

2. Обработка и хранение проб

  1. Немедленно обработайте образцы. Если это невозможно, храните образец при температуре 4 °C до 24 часов.
  2. Если образцы нельзя хранить при температуре 4 °C или необходимо хранить при 4 °C дольше 24 часов, добавьте в образцы 0,2 М борной кислоты или 10 мМNaN3 . Убедитесь, что такие реагенты совместимы с запланированными последующими применениями.
  3. Запишите продолжительность времени, в течение которого образцы проводят при температуре 4 °C.
  4. Центрифугируйте образцы при давлении 1000-1500 x g в течение 10-20 минут. Центрифугирование не обязательно должно осуществляться при температуре 4 °C.
  5. Соберите надосадочную жидкость и распределите ее по отдельным микроцентрифужным пробиркам.
  6. Наклейте на пробирки несколько четких идентификаторов (например, дату и идентификацию образца (ID)). Рассмотрите возможность использования сгенерированных компьютером штрихкодов, специально разработанных для хранения биологических образцов при температуре -80 °C. Если это невозможно, убедитесь, что ручка, используемая для маркировки образцов, является водостойкой.
  7. Пометьте каждую морозильную камеру так, чтобы у каждого места был определенный код. Для этого пронумеруйте каждый столбец отдельной буквой, а каждую строку — номером. Это позволит создавать карты или другие руководства для удобного определения местоположения образцов.
  8. Немедленно заморозьте образцы при температуре -80 °C. Запишите время заморозки.
  9. Разморозьте образцы на водяной бане при температуре 37 °C в день измерения, чтобы свести к минимуму ненужное хранение при комнатной температуре или 4 °C.
  10. Запишите время и количество дополнительных циклов замораживания-оттаивания для каждой аликвоты.

3. Анализ

  1. При использовании имеющихся в продаже ИФА следует следовать инструкциям производителя.
  2. Запустите образцы в двух экземплярах.
  3. Определите ожидаемую концентрацию интересующего белка, чтобы убедиться, что уровни белка в образцах находятся в пределах диапазона, указанного в наборе. Если ожидаемый уровень белка превышает верхнюю норму, разведите пробы.
  4. После того, как будут получены данные с помощью планшетного ридера (ИФА) или вестерн-блоттинга, определите концентрацию каждого биомаркера в образце вручную (не рекомендуется) или с помощью любого программного обеспечения.
  5. Проанализируйте результаты. Анализ данных зависит от индивидуального дизайна исследования.
  6. Рассмотрите возможность корректировки значений биомаркеров с учетом концентрации мочи.
    Примечание: Традиционно, исследователи биомаркеров использовали креатинин мочи в качестве метода нормализации, особенно у участников с нормальной функцией почек, чтобы учесть концентрацию мочи. Тем не менее, другие сообщают, что нормализация не влияет на результаты4. Чтобы преодолеть это препятствие, некоторые исследователи сообщают как о нормализованных, так и о ненормализованных результатах.
  7. Рекомендуется указывать в опубликованных рукописях диапазоны времени от сбора до замораживания, а также продолжительность времени при температуре 4 °C перед обработкой, чтобы можно было интерпретировать результаты в контексте обработки образцов (рис. 1)

4. Влияние различных условий хранения на нейтрофильный желатиназа-ассоциированный липокалин (NGAL).

  1. Добавьте в свежую мочу 2 нг/мл рекомбинантного NGAL.
  2. Аликвотируйте мочу и подвергайте ее различным условиям обработки и хранения.
    1. Центрифугируйте мочу при 1000-1500 х г в течение 10-20 минут. Центрифугирование не обязательно должно осуществляться при температуре 4 °C. Хранить при различных условиях (20 °C, 4 °C, -20 °C) в течение 24 часов, 48 часов или 72 часов.
    2. Храните аликвоту образца при температуре -80 °C для сравнения.
  3. После поддержания образцов в различных условиях, как указано в шаге 4.2.1, измерьте уровни NGAL в образцах с помощью имеющегося в продаже набора ELISA, который включает в себя элементы управления в соответствии с инструкциями производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Центрифугирование оказало небольшое влияние на уровень NGAL. Центрифугированные пробы, хранившиеся при температуре -80 °C, имели более низкие уровни NGAL, чем нецентрифугированные образцы (2,17 нг/мл ± 0,32 нг/мл, 2,77 нг/мл ± 0,21 нг/мл). Циклы замораживания также оказывали влияние на уровни NGAL после третьего цикла замораживания-оттаивания. (Рисунок 2). Из изученных условий (центрифугирование, циклы замораживания-оттаивания и температура хранения) наибольшее влияние на уровень NGAL оказал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важность получения последовательных и воспроизводимых результатов не ограничивается успехом отдельных исследований, но также позволяет лучше сравнивать результаты в рамках литературы9. Различия между исследованиями по ключевым процедурным этапам могут привести к необратимой систематической ошибке, которая может повлиять на сигналы биомаркеров и их интерпретацию, что может быть причиной расхождений междунесколькими исследованиями. Это демонс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ни у одного из авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Никакого внешнего финансирования для этой работы получено не было. Для получения данных в данной работе использовались институциональные средства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Борная кислотаSigma-AldrichB6768Рекомендуется для образцов, которые не могут быть быстро обработаны и заморожены
Морозильные камерыFisher Scientific03-395-464
Микроцентрифужные пробиркиThomas Scientific1149X93
NGAL ELISA KitR& D SystemsDLCN20Используется для получения репрезентативных результатов
Пипетки и наконечникиВ зависимости от размера пипетки и объема жидкости.
Азид натрияSigma-AldrichS2002Следует рассматривать для образцов, которые не могут быть быстро обработаны и заморожены
Стаканчики для сбора мочи ThermoScientific3122B03ORGСтерильные стаканчики не требуются, если они не требуются для других исследований

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: Incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, 1 SUPPL. 1 5-13 (2002).
  2. Forster, C. S., Pohl, H. Diagnosis of urinary tract infection in the neuropathic bladder: Changing the paradigm to include the microbiome. Topics in Spinal Cord Injury Rehabilitation. 25 (3), (2019).
  3. Gadalla, A. A. H., et al. Identification of clinical and urine biomarkers for uncomplicated urinary tract infection using machine learning algorithms. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  4. Shaikh, N., et al. Biomarkers that differentiate false positive urinalyses from true urinary tract infection. Pediatric Nephrology. 35 (2), 321-329 (2020).
  5. Renata, Y., Jassar, H., Katz, R., Hochberg, A., Nir, R. -R., Klein-Kremer, A. Urinary concentration of cytokines in children with acute pyelonephritis. European journal of Pediatrics. 172 (6), 769-774 (2013).
  6. Forster, C. S., Haffey, W. D., Bennett, M., Greis, K. D., Devarajan, P. Identification of urinary CD44 and Prosaposin as specific biomarkers of urinary tract infections in children with neurogenic bladders. Biomarker Insights. 14, (2019).
  7. Bitsori, M., et al. Urine IL-8 concentrations in infectious and non-infectious urinary tract conditions. Pediatric Nephrology. 26 (11), Berlin, Germany. 2003-2007 (2011).
  8. Schuh, M. P., et al. Long-term Stability of urinary biomarkers of acute kidney injury in children. American Journal of Kidney Diseases. 67 (1), 56-61 (2016).
  9. Hepburn, S., et al. An analysis of the impact of pre-analytical factors on the urine proteome: Sample processing time, temperature, and proteolysis. Proteomics - Clinical Applications. 9 (5-6), 507-521 (2015).
  10. Han, W. K., Wagener, G., Zhu, Y., Wang, S., Lee, H. T. Urinary biomarkers in the early detection of acute kidney injury after cardiac surgery. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 4 (5), 873-882 (2009).
  11. Schaub, S., et al. Urine protein profiling with surface-enhanced laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Kidney International. 65 (1), 323-332 (2004).
  12. Thongboonkerd, V. Practical points in urinary proteomics. Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).
  13. Grenier, F. C., et al. Evaluation of the ARCHITECT urine NGAL assay: Assay performance, specimen handling requirements and biological variability. Clinical Biochemistry. 43 (6), 615-620 (2010).
  14. Liu, K. D., et al. Storage time and urine biomarker levels in the ASSESS-AKI study. PLoS ONE. 11 (10), 1-9 (2016).
  15. Parikh, C. R., et al. Urine stability studies for novel biomarkers of acute kidney injury. American Journal of Kidney Diseases. 63 (4), 567-572 (2014).
  16. Van De Vrie, M., Deegens, J. K., Van Der Vlag, J., Hilbrands, L. B. Effect of long-term storage of urine samples on measurement of kidney injury molecule 1 (KIM-1) and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). American Journal of Kidney Diseases. 63 (4), 573-576 (2014).
  17. Hubel, A., Aksan, A., Skubitz, A. P. N., Wendt, C., Zhong, X. State of the art in preservation of fluid biospecimens. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 237-244 (2011).
  18. Havanapan, P. O., Thongboonkerd, V. Are protease inhibitors required for gel-based proteomics of kidney and urine. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3109-3117 (2009).
  19. Thongboonkerd, V., Saetun, P. Bacterial overgrowth affects urinary proteome analysis: Recommendation for centrifugation, temperature, duration, and the use of preservatives during sample collection. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4173-4181 (2007).
  20. Saetun, P., Semangoen, T., Thongboonkerd, V. Characterizations of urinary sediments precipitated after freezing and their effects on urinary protein and chemical analyses. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 296 (6), 1346-1354 (2009).
  21. Project, H. K. Standard Protocol for Urine Collection and Storage. , (2021).
  22. Nickolas, T. L., et al. Diagnostic and prognostic stratification in the emergency department using urinary biomarkers of nephron damage: a multicenter prospective cohort study. Journal of the American College of Cardiology. 59 (3), 246-255 (2012).
  23. Forster, C. S., Loechtenfeldt, A. M., Shah, S. S., Goldstein, S. Urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin in girls with recurrent urinary tract infections. Pediatric Nephrology. , 1-8 (2020).
  24. Forster, C. S., et al. Predictive ability of NGAL in identifying urinary tract infection in children with neurogenic bladders. Pediatric Nephrology. 33 (8), Berlin, Germany. 1365-1374 (2018).
  25. Forster, C., et al. Urinary NGAL deficiency in children with recurrent urinary tract infections. Journal of Pediatric Urology. 32, 1077-1080 (2017).
  26. Gupta, S., Preece, J., Haynes, A., Becknell, B., Ching, C. Differentiating asymptomatic bacteriuria from urinary tract infection in the pediatric neurogenic bladder population: NGAL as a promising biomarker. Topics in Spinal Cord Injury Rehabilitation. 25 (3), 214-221 (2019).
  27. Shaikh, N., et al. Host and bacterial markers that differ in children with cystitis and pyelonephritis. Journal of Pediatrics. 209, 146-153 (2019).
  28. Harpole, M., Davis, J., Espina, V. Current state of the art for enhancing urine biomarker discovery. Expert Review of Proteomics. 13 (6), 609-626 (2016).
  29. Jung, C. E., et al. Benchmarking urine storage and collection conditions for evaluating the female urinary microbiome. Scientific Reports. 9 (1), 13409(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи