Method Article

Визуализация и количественная оценка коричневых и бежевых жировых тканей у мышей с использованием [18F]FDG Micro-PET/MR Визуализация

DOI:

10.3791/62460

⸱

July 1st, 2021

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, The University of Hong Kong, 2Department of Medicine, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 3Department of Diagnostic Radiology, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 4School of Biomedical Sciences, Institute of Vascular Medicine, Chinese University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функциональная визуализация и количественное определение термогенных жировых депо у мышей с использованием подхода, основанного на микро-ПЭТ/МР визуализации.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коричневые и бежевые адипоциты в настоящее время признаны потенциальными терапевтическими мишенями для ожирения и метаболических синдромов. Неинвазивные методы молекулярной визуализации необходимы для обеспечения критического понимания этих термогенных жировых депо. Здесь в протоколе представлен метод визуализации ПЭТ/МР для оценки активности коричневых и бежевых адипоцитов в межлопаточной коричневой жировой ткани мыши (iBAT) и паховой подкожной белой жировой ткани (iWAT). Визуализация и количественная оценка термогенных жировых депо были достигнуты с использованием [18F]FDG, неметаболизируемого аналога глюкозы, в качестве радиоиндикатора, в сочетании с точной анатомической информацией, предоставленной МР-визуализацией. Пэт/МР-визуализация проводилась через 7 дней после холодной акклиматизации, а количественное определение сигнала [18F]FDG в различных жировых депо проводилось для оценки относительной мобилизации термогенных жировых тканей. Удаление iBAT существенно увеличивало поглощение [18F]FDG в iWAT мышей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ответ на изменение потребностей в питании жировая ткань служит энергетическим кэшем для принятия либо хранения липидов, либо режима мобилизации для удовлетворения потребностей организма1. Кроме того, жировая ткань также играет ключевую функцию в терморегуляции с помощью процесса, называемого недрожащим термогенезом, также называемым факультативным термогенезом. Это обычно достигается коричневой жировой тканью (BAT), которая экспрессирует обильный уровень разъединяющего белок мембраны митохондрий 1 (UCP1). В качестве протонного носителя UCP1 генерирует тепло, разъединяя перенос протонов и производство АТФ2. При холодной стимуляции термогенез в БАТ приводится в движение активацией симпатической нервной системы (СНС) с последующим высвобождением норадреналина (NE). NE связывается с β3 адренергическими рецепторами и приводит к повышению внутриклеточного циклического АМФ (цАМФ). Как следствие, цАМФ/ПКК-зависимое вовлечение CREB (белка, связывающего элемент ответа цАМФ), стимулирует транскрипцию Ucp1 посредством прямого связывания с элементами CREB-ответа (CRE)2. В дополнение к BAT, коричневые адипоциты также находятся в белой жировой ткани и поэтому называются бежевыми или бритовыми (коричневыми в белом) клетками1,3. В ответ на специфические раздражители (такие как холод) эти в противном случае покоящиеся бежевые клетки реконструируются, чтобы проявлять множественные коричневые черты, включая многолокулярные липидные капли, плотно упакованные митохондрии и увеличенную экспрессию UCP13,4,5.

Исследования на животных показали, что коричневые и бежевые адипоциты обладают множественными метаболическими преимуществами, помимо их эффекта снижения жира, включая сенсибилизацию к инсулину, снижение уровня липидов, противовоспалительное и антиатеросклерозное 6,7. У людей количество бежевого/бурого жира обратно коррелирует с возрастом, индексом резистентности к инсулину и кардиометаболическими расстройствами8. Кроме того, активация бежевых/коричневых адипоцитов у человека либо путем холодной акклиматизации, либо агониста β3-адренергических рецепторов обеспечивает защиту от ряда метаболических нарушений4,9,10. Эти доказательства в совокупности указывают на то, что индукция коричневой и бежевой жировой ткани является потенциальной терапевтической стратегией для лечения ожирения и связанных с ним медицинских осложнений8.

Интересно, что, хотя они имеют сходную функцию, бежевые и классические коричневые адипоциты получены из разных предшественников и активируются перекрывающимися, но различными механизмами1. Поэтому визуализация in vivo и количественная оценка коричневых и бежевых адипоцитов необходимы для достижения лучшего понимания молекулярного контроля этих жировых тканей. В настоящее время 18F-фтордезоксиглюкоза ([18F]FDG) позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) в сочетании с компьютерной томографией (КТ) остается золотым стандартом для характеристики термогенных коричневых и бежевых клеток в клинических исследованиях8. Магнитно-резонансная томография (МРТ) использует мощные магнитные поля и радиочастотные импульсы для создания подробных анатомических структур. По сравнению с КТ, МРТ генерирует изображения органов и мягких тканей с более высоким разрешением. Здесь представлен протокол для визуализации и количественной оценки функциональных коричневых и бежевых жиров в мышиных моделях после акклиматизации к воздействию холода, распространенный и наиболее надежный способ вызвать потемнение жировой ткани. Этот метод может быть применен для характеристики термогенных жировых депо в моделях мелких животных с высокой точностью.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный ниже, следует руководящим принципам по уходу за животными Университета Гонконга. Животные, использованные в исследовании, были 8-недельными мышами C57BL / 6J.

1. Хирургические процедуры для животных и холод

  1. Выполните межлопастную рассечение BAT (iBAT).
    1. Анестезируют мышей внутрибрюшинной инъекцией кетамина/ксилазина (100 мг/кг кетамина массы тела и ксилазина массы тела 10 мг/кг массы тела). После анестезии сбрите волосы мыши от шеи до чуть ниже лопаток.
    2. Поместите мышей на грелку после дезинфекции и сделайте разрез 2 см вдоль спинной средней линии мышей.
    3. Снимите прокладки iBAT (двусторонние). В фиктивной группе сделайте тот же разрез, но оставьте прокладки iBAT нетронутыми.
    4. Закройте разрез с помощью 7 мм намотанных зажимов из нержавеющей стали после остановки кровотечения.
    5. После операции дайте мелоксикам (5 мг / кг в питьевой воде) мышам в течение 6 дней и поместите их в отделение интенсивной терапии (ОИТ) в течение 14 дней. Снимите зажимы, как только рана заживет (7-10 дней).
  2. Холодный вызов мышей: Развивайте мышей при термонейтральности (30 ° C) в течение 14 дней. На 13-й день предварительно охладите клетки животных в холодную (6 °C) ночью. На 14-й день поместите мышей при 6 °C в экологическую камеру на 7 дней. Поместите двух мышей в каждую клетку.

2. Калибровка Micro-PET/MR и настройка рабочего процесса

ПРИМЕЧАНИЕ: Микро-ПЭТ/МР визуализация выполняется с использованием последовательной системы ПЭТ/МРТ (см. Таблицу материалов). Каждая мышь помещается на кровать для визуализации; сначала сканирование с помощью MR для анатомической ссылки (скаутский вид), прежде чем перейти к центру поля зрения ПЭТ (FOV) для статического [18F]FDG ПЭТ-получения, а затем МР-визуализация для анатомической ссылки. Рабочий процесс визуализации создается в программном обеспечении, работающем со сканером (см. Таблицу материалов), для обеспечения автоматизированного последовательного сканирования ПЭТ/МРТ до сеанса визуализации.

  1. Создайте рабочий процесс визуализации в операционном программном обеспечении, который включает в себя статическое получение ПЭТ, получение МРТ для коррекции затухания и анатомическую ссылку с использованием 3D-визуализации T1-weigthed и 2D-визуализации T2-взвешенной визуализации соответственно.
  2. Для получения ПЭТ установите дискриминацию уровня 400-600 кэВ, изотоп исследования F-18, режим совпадения 1-5 и 20-минутное сканирование.
  3. Для получения Т1-взвешенного МР (для коррекции затухания) устанавливают Градиент Эхо-3D (ТЭ = 4,3 мс, ТР = 16 мс, ФОВ = 90 х 60 мм, количество возбуждений (NEX) = 3, 28 срезов толщиной 0,9 мм, размер вокселя = 0,375 х 0,375 х 0,9 мм).
  4. Для получения T2-взвешенного MR (анатомического эталона) установите Fast-spin Echo 2D (TE = 71,8 мс, TR = 3000 мс, FOV = 90 x 60 мм, NEX = 5, 32 среза толщиной 0,9 мм, размер вокселя = 0,265 x 0,268 x 0,9 мм3).
  5. Для реконструкции ПЭТ используйте алгоритм Tera-Tomo 3D (TT3D) (8 итераций, 6 подмножеств) с режимом совпадения 1-3, а также с коррекцией распада, мертвого времени, случайности, затухания и рассеяния для создания изображений с общим размером вокселя 0,3 мм3 .
  6. Проведите тест активности ПЭТ на микро-ПЭТ/МР сканере за день до начала исследования визуализации, чтобы проверить точность количественного определения ПЭТ.
    1. Приготовьте шприц объемом 5 мл, наполненный [18F]FDG в соответствии с рекомендациями производителя (140-220 мкКи/5-8 МБк в воде или физиологическом растворе).
    2. Запишите активность шприца с помощью калибратора дозы (см. Таблицу материалов) и запишите время измерения.
    3. Выберите Interpolated Ellipse ROI, чтобы нарисовать интересующий объем (VOI) на реконструированном изображении, чтобы сравнить восстановленную активность со значением, измеренным, как описано выше. Восстановленная активность для хорошо откалиброванного сканера точна в пределах ±5%.

3. Инъекция [18F]FDG

  1. Закажите клиническую дозу [18F]FDG (10 мКи/370 МБк) у поставщика для ее поступления в лабораторию визуализации примерно за 30 минут до первой запланированной инъекции. Обязательно носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как лабораторный халат, перчатки, персональный радиационный дозиметр, например, пальцы, все тело при получении упаковки, содержащей радиоактивные материалы. Регулярно меняйте перчатки, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение радиоактивности и максимально увеличить расстояние от радиоактивного источника.
  2. Используйте щипцы, чтобы аккуратно перенести флакон с запасом [18F] FDG за щит столешницы L-block.
  3. Дозируют аликвоту [18F]FDG и разбавляют стерилизованным физиологическим раствором для получения общей концентрации активности при 200-250 мкКи/7-9 МБк) в 100-150 мкл.
  4. Втяните раствор [18F]FDG в шприц объемом 1 мл с помощью иглы (см. Таблицу материалов), измерьте радиоактивность с помощью калибратора дозы, установленного на F-18, и запишите время измерения.
  5. Запишите вес мыши перед инъекцией. Вводят приготовленный раствор [18F]FDG через хвостовую вену. Обратите внимание на время инъекции и остаток радиоактивности шприца, чтобы обеспечить коррекцию распада.
  6. Поместите мышь обратно в клетку и разрешите [18F]FDG в течение 60 минут перед ПЭТ-сканированием.
  7. Рассчитайте инжектируемую активность [18F]FDG, используя следующую формулу11:
    Инъекционная активность (мкКи/МБк)
    = Активность в шприце перед инъекцией
    - активность в шприце после инъекции

4. Приобретение микро-ПЭТ/МР

  1. Включите воздухонагреватель к кровати мыши, чтобы через него проходил теплый воздух.
  2. Обезболить мышь с помощью 5% изофлурана (1 л/мин медицинского O2). После индуцирования переведите мышь в теплую мышеловку и поддерживайте анестезию на уровне 2%-3% изофлурана через конус маски для носа. Поместите головку мыши на стойку укуса и убедитесь, что мышь не выступает за пределы диаметра кровати. Наносите смазку для глаз, чтобы избежать высыхания и образования язв роговицы.
  3. Контролируйте температуру тела и частоту дыхания с помощью теплового зонда и дыхательной прокладки соответственно. Поддерживайте температуру тела на уровне 36-37 °C, а частоту дыхания на уровне 70-80 вдохов в минуту (уд/мин) путем регулировки уровня изофлурана.
  4. Выполните представление разведки, чтобы определить положение мыши. Отрегулируйте положение кровати мыши, чтобы включить все тело мыши и убедиться, что центр FOV MR находится в центре тела мыши.
  5. В окне «Приобретение ПЭТ » в окне списка исследований выберите «Диапазон сканирования при предыдущем приобретении », чтобы использовать позицию представления скаута, как описано выше. Нажмите « Подготовиться, чтобы переместить кровать животного из MR в PET». Нажмите кнопку ОК , чтобы начать сканирование ПЭТ. Запишите дозу инъекции и время, измеренное до и после введения [18F]FDG в радиофармацевтическом редакторе. Введите вес мыши в меню «Информация о теме ».
  6. После завершения ПЭТ-сканирования выберите Подготовиться к переходу на МРТ и завершить все приобретения МРТ в окне списка исследований. Нажмите кнопку ОК , чтобы начать сканирование МРТ.
  7. После завершения всего рабочего процесса кратко оцените качество полученных изображений MR с помощью программного обеспечения для постобработки (см. Таблицу материалов). Нажмите кнопку «Домой », чтобы переместить область мыши из MR в исходное положение.
  8. Осторожно извлеките мышь из сканера и верните ее в чистую клетку с подогреваемой прокладкой под ней, чтобы обеспечить восстановление в теплой среде. Снабжайте мышь пищей и водой. Теперь система готова к следующей мыши в очереди.
  9. Чтобы восстановить данные, выберите «Сбор ПЭТ» в меню «Необработанное сканирование », чтобы загрузить завершенное ПЭТ-сканирование. Выберите T1-взвешенный MR Acquisition для создания карты материалов. Восстановите данные, как описано выше (см. шаг 2.5).
  10. Следуйте местным и институтским правилам, касающимся ухода и обращения с мышью после ПЭТ-визуализации. Рассматривать все использованные шприцы/иглы, перчатки, постельные принадлежности и фекалии как радиоактивные отходы, требующие специального обращения/захоронения в соответствии с местными правилами.

5. Поствизуальный анализ

  1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблица материалов) и нажмите Загрузить данные DICOM , чтобы получить соответствующие изображения MR и PET.
  2. Выполните совместную регистрацию изображений MR и PET, перетащив эти изображения в окно дисплея. Нажмите на функцию Автоматическая регистрация .
    1. Выберите Жесткое преобразование в раскрывающемся меню Настройка регистрации . Установите флажок «Сдвиг » и « Поворот » в меню «Жесткий/Аффинный ».
    2. Выберите получение MR, взвешенное по T1 , в качестве ссылки и приобретение PET в качестве reslice в меню Global Role Selection (Глобальный выбор роли ).
    3. Проверьте регистрацию во всех трех измерениях, чтобы убедиться в идеальном выравнивании между изображениями MR и PET. Чтобы настроить его вручную, нажмите «Ручная регистрация».
  3. Используйте интерполированную эллипсовую рентабельность инвестиций для рисования VOI на интересующей ткани, то есть iBAT и паховой белой жировой ткани (iWAT), используя МР-изображение для справки. Используйте инструмент «Кисть» и инструмент «Ластик» для определения границы VOI; следовательно, анатомия тканей. Убедитесь, что нет перекрытия поглощения, используя ИЗОБРАЖЕНИЕ ПЭТ, чтобы избежать перетекания из соседних органов. Повторяйте процесс пошагово до тех пор, пока не будет очерчен весь VOI. При необходимости отредактируйте VOI, чтобы поддерживать согласованность томов VOI между каждой мышью.
  4. Используйте эллипсоидНЫЙ VOI , чтобы нарисовать 3 мм3 VOI на легком в качестве эталонного органа. Избегайте любых побочных эффектов от соседних сердца и мышц.
  5. По завершении нажмите Показать таблицу ROI , чтобы переименовать каждый VOI. Запишите среднюю радиоактивность с VOI и объемом ткани в электронную таблицу. Архивируйте чертежи VOI и данные изображений на устройство хранения данных.
  6. Рассчитайте стандартизированное значение поглощения (SUV) для всех VOI, используя следующее уравнение11:
    SUVmean = радиоактивность VOI в кБк/(Распад - скорректированная инъекционная доза в кБк/масса тела мыши в кг), предполагающая плотность ткани 1 г/мл.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Три группы мышей (n = 3 на группу) прошли микро-ПЭТ/МР визуализацию в этом исследовании, где они были размещены либо при термонейтральности (30 ° C), либо при холоде (6 ° C) в течение 7 дней. У одной группы мышей (n = 3) был удален iBAT (iBATx) до лечения холодом (рисунок 1A). Этот метод привел к изменению активности белой жировой ткани у всех трех мышей. В частности, наблюдалось заметное увеличение поглощения [18F]FDG в iWAT с использованием микро-ПЭТ/МР визуализации (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании была описана визуализация на основе ПЭТ/МРТ и количественная оценка функциональной коричневой и бежевой жировой ткани у мелких животных. Этот метод использует неметаболизируемый аналог глюкозы [18F]FDG в качестве биомаркера визуализации, чтобы идентифицировать жировые ткани с высоким спросом на глюкозу неинвазивным способом. MR предлагает хороший контраст мягких тканей и может лучше дифференцировать жировые ткани от соседних мягких тканей и мышц. В сочетании с ПЭТ это позволяет точно визуал...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим за поддержку Национального фонда естественных наук Китая (NSFC) - Фонда отличных молодых ученых (Гонконг и Макао) (81922079), Общего исследовательского фонда Совета по исследовательским грантам Гонконга (GRF 17121520 и 17123419) и Фонда совместных исследований Совета по исследовательским грантам Гонконга (CRF C7018-14E) за эксперименты по визуализации мелких животных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,9% стерильный физиологический растворBBraun0,9% хлорид натрия внутривенная инфузия, 500 мл
5 мл шприцTerumoSS05L5 мл шприц Luer
Lock Dose CalibratorBiodexAtomlab 500
Глазная смазкаAlcon DuratearsСтерильная глазная смазка мазь, 3,5 г
Инсулиновый шприцTerumo10ME29131 мл инсулинового шприца с иглой
Программное обеспечение InterView FusionMedisoVersion 3.03Программное обеспечение для постобработки и анализа изображений
IsofluraneChanelle PharmaIso-Vet, ингаляционный анестетик, 250 мл
кетаминаAlfasan International B.V.HK-37715Кетамин 10% раствор для инъекций, 10 мл
Медицинский кислородLinde HKO101-HRсжатый газ, 99,5% чистота
MetacamBoehringer Ingelheim5 мг/мл Мелоксикам раствор для инъекций для собак и кошек, 10 мл
nanoScan ПЭТ/МРТ сканерMediso3 Тесла MR
Nucline nanoScan программное обеспечениеMedisoVersion 3.0Scanner операционное программное обеспечение
Зажимыдля ран Reflex 7203-1007мм Зажимы для ран из нержавеющей стали, 20 зажимов
XylazineAlfasan International B.V.HK-56179Ксилазин 2% раствор для инъекций, 30 мл

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Cannon, B., Brown Nedergaard, J. adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Review. 84 (1), 277-359 (2004).
  3. Jal Wu,, et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and. 150 (2), 366-376 (2012).
  4. Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a beta3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
  5. Ishibashi, J., Seale, P. Beige can be slimming. Science. 328 (5982), 1113-1114 (2010).
  6. Jal Schulz, T., et al. Brown-fat paucity due to impaired BMP signalling induces compensatory browning of white fat. Nature. 495 (7441), 379-383 (2013).
  7. Pal Cohen,, et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
  8. Mal Cypess, A., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  9. Aal vander Lans, A., et al. Cold acclimation recruits human brown fat and increases nonshivering thermogenesis. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3395-3403 (2013).
  10. Jal Hanssen, M., et al. Short-term cold acclimation improves insulin sensitivity in patients with type 2 diabetes mellitus. Nature Medicine. 21 (8), 863-865 (2015).
  11. Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional imaging of brown fat in mice with 18F-FDG micro-PET/CT. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 69, (2012).
  12. Greenwood, H. E., Nyitrai, Z., Mocsai, G., Hobor, S., Witney, T. H. High-throughput PET/CT imaging using a multiple-mouse imaging system. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Scoiety of Nuclear Medicine. 61 (2), 292-297 (2020).
  13. Carter, L. M., Henry, K. E., Platzman, A., Lewis, J. S. 3D-printable platform for high-throughput small-animal imaging. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Scoiety of Nuclear Medicine. 61 (11), 1691-1692 (2020).
  14. Jal Andersson,, et al. Estimating the cold-induced brown adipose tissue glucose uptake rate measured by (18)F-FDG PET using infrared thermography and water-fat separated MRI. Scientific Reports. 9 (18), 12358(2019).
  15. Eal Lundstrom,, et al. Brown adipose tissue estimated with the magnetic resonance imaging fat fraction is associated with glucose metabolism in adolescents. Pediatric Obesity. 14 (9), (2019).
  16. Eal Lundstrom,, et al. Magnetic resonance imaging cooling-reheating protocol indicates decreased fat fraction via lipid consumption in suspected brown adipose tissue. PLoS One. 10 (4), 0126705(2015).
  17. Nakamura, Y., Yanagawa, Y., Morrison, S. F., Nakamura, K. Medullary reticular neurons mediate neuropeptide Y-induced metabolic inhibition and mastication. Cell Metabolism. 25 (2), 322-334 (2017).
  18. Jal Fueger, B., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Scoiety of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
  19. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. Journal of Nuclear Medicine Technology. 39 (4), 264-270 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Brown Adipose TissueBeige Adipose TissuePET MR Imaging18F FDG UptakeThermogenic AdipocytesCold AcclimationInterscapular Brown FatInguinal White FatMouse ImagingAdipocyte Quantification

Related Articles