Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Идентификация РНК, участвующих в прямом взаимодействии РНК-РНК с длинной некодирующей РНК

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62475

⸱

9 июля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculté des Sciences Médicales et Paramédicales, Aix Marseille Univ, CNRS, INP

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Простой в использовании протокол pull-down РНК предназначен для идентификации РНК, участвующих в прямом взаимодействии РНК/РНК с длинной некодирующей РНК. Протокол использует псорален в качестве фиксатора для сшивания только РНК-взаимодействий и обеспечивает полный прямой интерактом РНК длинной некодирующей РНК в сочетании с секвенированием РНК.

Аннотация

Растущая роль, приписываемая в настоящее время длинным некодирующим РНК (lncRNA) в физиологии и патофизиологии, делает крайне важным характеристику их интерактома путем идентификации их молекулярных партнеров, ДНК, белков и/или РНК. Последние могут взаимодействовать с lncRNA через сети, включающие белки, но они также могут участвовать в прямых взаимодействиях РНК/РНК. Поэтому мы разработали простую в использовании процедуру вытягивания РНК, которая позволила идентифицировать РНК, участвующие в прямом взаимодействии РНК/РНК с некодирующей РНК с помощью псоралена, молекулы, которая сшивает только взаимодействия РНК/РНК. Биоинформатическое моделирование вторичной структуры некодирующей РНК позволило выбрать несколько специфических антисмысловых ДНК-олигонуклеотидных зондов с сильным сродством к областям, демонстрирующим низкую вероятность спаривания внутренних оснований. Поскольку специфические зонды, которые были разработаны, нацелены на доступные области по всей длине некодирующей РНК, зоны взаимодействия РНК могут быть очерчены в последовательности некодирующей РНК. В сочетании с высокопроизводительным секвенированием РНК этот протокол может быть использован для всех исследований прямого интерактома РНК представляющей интерес некодирующей РНК.

Введение

Длинные некодирующие РНК (днРНК) — это некодирующие белки транскрипты длиной более 200 нуклеотидов. Их число постоянно растет, более 58 000 у людей. Кроме того, их ключевая роль в физиологии и патофизиологии обусловливает необходимость определения характеристик их молекулярных партнеров, которые позволяют им реализовывать свои регуляторные функции. На самом деле, одним из подходов к пониманию функций некодирующих РНК является обнаружение взаимодействующих молекулярных партнеров каждой некодирующей РНК.

Молекулярными мишенями некодирующих РНК могут быть ДНК, белки или РНК, и для их идентификации были разработаны различные методы. В связи с этим идентификация белков, взаимодействующих с некодирующими РНК, является целью различных протоколов, в том числе различных процедур иммунопреципитации РНК (RIP), в которых антитело против представляющего интерес белка используется для специфического снижения некодирующих РНК (для обзора1). Другие методы, такие как анализ захвата, гибридизации мишенейРНК 2 (CHART) или выделение хроматина методом очистки РНК3 (ChIRP), позволяют извлекать днРНК вместе с соответствующими белковыми комплексами. В этих последних методах некодирующая РНК используется в качестве приманки. CHART и ChIRP также являются эффективными методами для идентификации геномных карт, показывающих занятость lncRNA 2,3. Кроме того, эти методы вытягивания РНК позволяют идентифицировать РНК-партнеров некодирующей РНК. Описана процедура, которая позволяет захватывать РНК, на которые нацелена некодирующая РНК. Биотинилированные олигонуклеотидные зонды антисмысловой ДНК разработаны против областей с низкой вероятностью спаривания внутренних оснований, что определено биоинформатическим моделированием вторичной структуры некодирующей РНК4. Тем не менее, эта процедура не делает различий между РНК-партнерами опосредованно через белковую сеть или напрямую через прямое взаимодействие РНК/РНК с lncRNA. Показано, что перекрестное сшивание производными псоралена является методом выбора для отбора прямых взаимодействий РНК/РНК, опосредованных спариванием оснований5. Производные псоралена действительно способны интеркалировать в двухцепочечную ДНК или РНК и ковалентно связывать пиримидины после облучения ультрафиолетовым светом (365 нм)6. Сопряжение извлечения РНК с помощью биотинилированных олигонуклеотидных зондов с перекрестным сшиванием с псораленом является простой в использовании процедурой, предложенной здесь для идентификации РНК, участвующих в прямом взаимодействии РНК/РНК с некодирующей РНК. Кроме того, эта процедура может позволить разграничить зоны взаимодействия РНК в последовательности некодирующей РНК, если использовать различные олигонуклеотидные зонды, сконструированные по длине неРНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Конструкция преобразователя

  1. Сгенерируйте вторичную структуру некодирующей РНК с помощью специализированного бесплатного программного обеспечения для веб-сервера: RNAstructure software7 или Vienna RNA web suite8. Выберите области, которые демонстрируют низкую вероятность спаривания внутренних оснований, и спроектируйте антисмысловые олигонуклеотидные зонды длиной 25 оснований для различных областей этой некодирующей РНК.
  2. Проверьте все олигонуклеотиды, разработанные с помощью бесплатного академического программного обеспечения AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr), чтобы получить различную информацию об этих зондах и выбрать те, которые имеют наилучшие параметры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте оптимальные параметры программного обеспечения следующим образом. Процент GC: от 40 до 60%, 3' стабильность, сложность, самоокончание димер: "хорошо". Температура плавления (TM) не имеет значения, так как сродство осуществляется при комнатной температуре.
  3. Используя инструмент поиска выравнивания (например, Blast и т.д.), убедитесь, что выбранные антисмысловые олигонуклеотидные зонды не распознают нуклеотидные последовательности в любой другой РНК, экспрессируемой в выбранных клетках.
    1. Разработка неспецифического ДНК-олигонуклеотидного зонда длиной 25 оснований. Убедитесь, что этот зонд не проявляет сродства к интересующей его некодирующей РНК или любым другим последовательностям РНК в интересующем вас геноме.
  4. Заказывайте все зонды с добавленной к их 3'-концу модификацией биотина вместе с триэтиленглицериновым спейсером (ТЭГ). Этот спейсер увеличивает олиго-биотиновое расстояние для того, чтобы избежать стерической помехи.
    Примечание: Чтобы получить оптимальный результат и оценить специфичность результатов pull-down, спроектируйте как минимум два различных антисмысловых олигонуклеотидных зонда в одной и той же области, а затем сравните их эффективность экспериментально.

2. Перекрестное сшивание

  1. Выращивайте клетки (например, клетки GH4C1, используемые в этом эксперименте) до слияния в чашках для клеточных культур размером 78,5см2 . После удаления питательной среды клетки промывают клеточный слой 5 мл холодного фосфатно-солевого буфера, обогащенного Ca2+ и Mg2+ (PBS+), и добавляют 3 мл раствора молекулы, полученной из псоралена (4'-аминометилтриоксалена гидрохлорида), приготовленного в PBS+ в концентрации 0,1 мг/мл.
  2. Поместите планшет для культивирования на 30 минут в инкубатор для клеточных культур млекопитающих при температуре 37 °C с 5%CO2. Через 30 мин снять крышку, поместить чашки для посева на лед на расстоянии 2,5 см от УФ-трубок с длиной волны 365 нм в УФ-сшивателе на 10 мин. Осторожно перемешайте посуду и восстановите воздействие ультрафиолета еще на 10 минут.
  3. Выбросьте среду путем аспирации, добавьте 1 мл PBS+ для сбора клеток с помощью скребка для клеток и переложите в микропробирку. Центрифуга при 4 °C, 400 x g в течение 5 минут. Удалите как можно больше надосадочной жидкости и храните гранулы при температуре -80 °C.

3. Лизис клеток

  1. Приготовьте буфер для протеиназы К, добавив 100 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,0, 1 мМ ЭДТА, 0,5% SDS и 5 мкл/мл ингибитора РНКазы.
  2. Ресуспендируйте клеточные гранулы в этом буфере (примерно 200 мкл на 1 x 107 клеток). Добавить протеиназу К до конечной концентрации 0,1 мкг/л и инкубировать в течение 45 мин при 50 °С. Затем инкубировать в течение 10 минут при 95 °С, чтобы инактивировать протеиназу К.

4. Ультразвуковая обработка

  1. Распределите 100 мкл этого лизата (что соответствует 5,106 ячейкам) в двух микропробирках и добавьте 200 мкл гибридизационного буфера (700 мМ NaCl, 70 мМ Tris-HCl, pH 7,0, 1 мМ ЭДТА, 1,25% SDS, 5 мкл/мл раствора ингибитора РНКазы и 15% формамид) в каждую пробирку.
  2. Поместите трубки в водяную баню ультразвукового аппарата при температуре 4 °C и начните ультразвуковую обработку с 2 серий импульсов по 30 с (высокой интенсивности) с интервалом в 30 с.
  3. Соберите 20 мкл проб для использования в качестве входных контрольных образцов и храните при -80 °C.
    Примечание: Эта процедура ультразвуковой обработки была предварительно оптимизирована для клеточной линии GH4C1 с целью получения фрагментов РНК в диапазоне 2000 нуклеотидов9. Для других клеточных линий процедура ультразвуковой обработки должна быть оптимизирована. Когда этот метод выполняется для изучения РНК-партнеров очень длинной некодирующей РНК, этап ультразвуковой обработки оказывается необходимым для получения адекватного восстановления некодирующей РНК. В этом случае, следовательно, необходимо сконструировать несколько зондов с сайтом связывания, расположенным максимум через каждые 4000 нуклеотидов по длине некодида. Чтобы восстановить всю длину некодирующей РНК, используйте пул из нескольких специальных зондов. Однако, если целью является идентификация областей некодирующей РНК, участвующих в связывании РНК-РНК, конкретные зонды должны использоваться отдельно. Кроме того, при изучении РНК-партнеров меньшей некодирующей РНК следует провести эксперименты, чтобы определить, требуется ли этап ультразвуковой обработки.

5. Вытягивание РНК вниз

  1. День 1 - Этап гибридизации
    1. Добавьте 150 пмоль (1,5 мкл 100 мкМ исходного раствора) биотинилированного специфического или неспецифического зонда в каждую пробирку с образцом. Инкубировать в течение 4 ч при перемешивании на ротаторе трубок при комнатной температуре (ОТ) (примерно 30 об/мин).
    2. Возьмите необходимый объем магнитных шариков (т.е. 40 мкл гранул на 150 пмоль реакции гибридизации зондов). Используйте магнитную опору для отделения бусин от коммерческих носителей. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте шарики 900 мкл буфера для гибридизации. После этого суспендируйте магнитные шарики в том же объеме буфера для гибридизации.
    3. Добавьте магнитные шарики в каждую пробирку с образцом (40 мкл гранул на 150 пмоль реакции гибридизации зондов). Инкубировать в течение ночи при перемешивании на ротаторе с трубкой при RT (примерно 30 об/мин).
  2. День 2 - этап выделения РНК
    1. Отделите шарики от клеточного лизата с помощью магнитной опоры (2-3 мин). Выбросьте надосадочную жидкость и промойте шарики 900 μл буфера для промывки (0,5% SDS, 2x SSC) с 5-минутной инкубацией при перемешивании на ротаторе при RT. Повторите эту промывку 5 раз.
    2. После удаления последней промывки добавьте 95 мкл буфера Proteinase K на шарики. Разморозьте входные образцы и добавьте 75 мкл буфера Proteinase K. Добавьте 5 мкл протеиназы К до конечной концентрации 1 мкг/мкл во все пробирки (образцы и исходные образцы). Инкубировать при 45 °C в течение 45 минут, а затем при 95 °C в течение 10 минут.
    3. Держите образец на льду. Используйте магнитную опору для отделения шариков от РНК, присутствующих в надосадочной жидкости. Очистите РНК с помощью набора для очистки РНК, который включает этап расщепления ДНКазы. Храните очищенные РНК при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Элюцированная РНК может быть подвергнута ОТ-кПЦР или высокопроизводительному секвенированию РНК для обнаружения обогащенных транскриптов. Для анализа секвенирования РНК прочтения могут быть затем выровнены по интересующему геному с использованием свободного программного обеспечения, такого как STAR10 или HISAT211, а количественная оценка может быть выполнена с использованием FeatureCounts12 или HTSeq count13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выяснение интерактома некодирующей РНК, т.е. клеточных компонентов, которые взаимодействуют с некодирующими РНК, белками, РНК и ДНК, имеет ключевое значение для понимания функций некодирующих РНК. Для характеристики интерактома lncRNA были разработаны различные методы, включая RIP, CHART, ChIRP и вытягивание РНК. Несмотря на то, что было показано, что последние являются эффективными в идентификации РНК-мишеней некодирующих РНК, эти процедуры не указывают, взаимодействуют ли РНК-партнеры косвенно через белковую сеть или н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Многочисленные некодирующие РНК выполняют свою функцию посредством комплементарного спаривания оснований с мРНК. В связи с этим важно разработать методики, позволяющие охарактеризовать интерактомную прямую РНК некодирующих РНК. Поэтому была разработана методика, сочетающая использование псоралена в качестве сшивающего реагента с методом вытягивания РНК.

В описанном протоколе вытягивания РНК дизайн и отбор биотинилированных олигонуклеотидных зондов антисмыслово...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Университетом Экс-Марсель и Национальным научным центром и финансировалась за счет гранта от Sandoz Laboratories.

Финансирование программы «Плата за открытый доступ»: Университет Экс-Марсель и Национальный научный центр

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4′-Аминометилтриоксален гидрохлоридSigmaA4330Сшивающий реагент
Bioruptor PlusДиагенодB01020001Ультразвуковой аппарат
Биотинилированные зондыIDTОлигонуклеотидные зонды
CFX96 Система реального времениBioRad4351107кПЦР аппарат
ДНК ОлигнуклеотидыIDTПраймеры для количественной ПЦР
Dynabeads My OneThermo-Fisher65001Магнитные шарики стрептавидина
ФормамидThermo-Fisher15515-026Формамид
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad1725124qPCR реагент
Proteinase KSigmaP2308Proteinase K
РНК к ДНКThermo-Fisher4387405Набор для обратной транскрипции
Набор для очистки РНК XSMacherey-Nagel740902Набор для очистки РНК
RNAseOUTThermo-Fisher10777-019Ингибитор РНКазы
Ротатор трубкиStuartSB2Eppendorf Tube Rotator
UV Stratalinker 1800Stratagene#400072UV Crosslinker

Ссылки

  1. Chen, L. -L., Zhao, J. C. functional analysis of long non-coding RNAs in development and disease. Systems Biology of RNA Binding Proteins. 825, 129-158 (2014).
  2. Simon, M. D. capture hybridization analysis of rna targets (CHART). Current Protocols in Molecular Biology. 101 (1), 2125(2013).
  3. Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). Journal of Visualized Experiments. (61), e3912(2012).
  4. Torres, M., et al. RNA pull-down procedure to identify RNA targets of a long non-coding RNA. Journal of Visualized Experiments. (134), e57379(2018).
  5. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of non-coding RNAs to nascent pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  6. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  7. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11 (1), 129(2010).
  8. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 70-74 (2008).
  9. Jacq, A., et al. Direct RNA-RNA interaction between Neat1 and RNA targets, as a mechanism for RNAs paraspeckle retention. RNA Biology. , 1-12 (2021).
  10. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  11. Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  12. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. FeatureCounts: An efficient general-purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  13. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
  14. Fox, A. H., et al. Paraspeckles: a novel nuclear domain. Current Biology. 12 (1), 13-25 (2002).
  15. Torres, M., et al. Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements. eLife. 5, 14837(2016).
  16. Jacq, A., et al. Direct RNA-RNA interaction between Neat1 and RNA targets, as a mechanism for RNAs paraspeckle retention. BioRxiv. , 354712(2020).
  17. Lu, Z., et al. Psoralen Analysis of RNA Interactions and Structures with High Throughput and Resolution. Methods in Molecular Biology. 1649, 59-84 (2018).
  18. Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA interactions globally using biotinylated psoralen. Journal of Visualized Experiments. (123), e55255(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.