Методическая статья

Совместное культивирование микроглии и корковых нейронов, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

3.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62480

⸱

21 сентября 2021 г.

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Chemical Biology Program, Broad Institute of MIT & Harvard, 3Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 4Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital, 5Program in Neuroscience, Harvard University, 6Program in Chemical Biology, Harvard University, 7Harvard Stem Cell Institute

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описывается методология дифференциации микроглии от ИПСК человека и поддержания их в кокультуре с корковыми нейронами, полученными из ИПСК с целью изучения механистических основ нейроиммунных взаимодействий с использованием нейронов и микроглии человека.

Аннотация

Способность генерировать микроглию из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) открывает новые инструменты и возможности для изучения роли микроглии в здоровье и болезнях. Кроме того, микроглия, полученная из iPSC, может поддерживаться в кокультуре с корковыми нейронами, полученными из iPSC, что позволяет исследовать взаимодействия микроглии и нейронов, которые, как предполагается, нарушают регуляцию при ряде нервно-психических расстройств. Человеческие ИПСК были дифференцированы для генерации микроглии с использованием адаптированной версии протокола, разработанного группой Фоссати, а микроглия, полученная из ИПСК, была проверена с помощью анализа маркеров и ПЦР в реальном времени. Человеческая микроглия, полученная с использованием этого протокола, была положительной на маркеры CD11C, IBA1, P2RY12 и TMEM119 и экспрессировала гены, связанные с микроглией AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 и TMEM119. Корковые нейроны человека, полученные из iPSC, которые были дифференцированы в течение 30 дней, были покрыты микроглией и поддерживались в совместном культивировании до 60-го дня, когда были проведены эксперименты. Плотность дендритных шипиков в корковых нейронах в кокультуре с микроглией была количественно определена в исходных условиях и в присутствии провоспалительных цитокинов. Чтобы изучить, как микроглия модулирует функцию нейронов, были проведены эксперименты по визуализации кальция корковых нейронов с использованием индикатора кальция Fluo-4 AM. Активность живого кальция корковых нейронов была получена с помощью конфокального микроскопа, а интенсивность флуоресценции количественно определена с помощью ImageJ. В этом отчете описывается, как совместное культивирование микроглии и корковых нейронов человека, полученных из iPSC, обеспечивает новые подходы к исследованию влияния микроглии на корковые нейроны.

Введение

В мозге человека микроглия является основными клетками врожденного иммунитета1. Развитие мозга регулируется микроглией двумя путями: высвобождением диффузионных факторов и фагоцитозом1. Диффузионные факторы, полученные из микроглии, помогают поддерживать миелинизацию, нейрогенез, формирование синапсов, созревание, гибель клеток и выживание клеток1. Микроглия также фагоцитирует различные элементы в синапсах мозга, аксонах, а также в живых и мертвых клетках 2,3,4,5,6,7,8. Рецепторы на микроглии распознают такие метки, как кальретикулин, АТФ и сиаловая кислота, и регулируют клеточный фагоцитоз 9,10. В гиппокампе микроглия поддерживает гомеостаз нейрогенеза за счет своей фагоцитарной роли11.

Было показано, что синаптический фагоцитоз в дорсолатеральном коленчатом ядре (dLGN) мозга грызунов регулируется микроглией1. У грызунов показано, что в развитии наблюдаются два периода, когда наблюдается интенсивный микроглиальный синаптический фагоцитоз. Первый период происходит во время начального формирования синапсов, а второй период происходит, когда соединения тонко настраиваются и обрезаются. Другими факторами, участвующими в обрезке синапсов, являются воспалительные белки и главный комплекс гистосовместимости класса I (MHC1, H2-Kb и Db)13,14. Было высказано предположение, что C1q (компонент комплемента 1q) на микроглии колокализуется с MHC1, что запускает синаптическую обрезку15. Кроме того, исследования на мышах показывают, что интерлейкин-33 (IL-33), секретируемый астроцитами, регулирует гомеостаз синапсов в таламусе и спинном мозге через свое воздействие на микроглию, хотя это еще предстоит исследоватьна людях. Микроглия выделяет различные цитокины, которые помогают поддерживать здоровье нейронов, такие как фактор некроза опухоли α (TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 и интерферон-γ (IFN-γ), и эти цитокины могут модулировать образование дендритных шипиков и синапсов 16,17,18. Существуют значительные пробелы в наших знаниях о взаимодействии нейронов и микроглии во время развития мозга человека. Большая часть наших знаний получена в результате исследований на моделях грызунов, в то время как информации о временных и механистических аспектах синаптической обрезки в коре головного мозга человека недостаточно. Микроглия поддерживает выживание нейронов в неокортексе, и другие типы клеток также вносят свой вклад1. Неясно, как микроглия способствует этому сохранению и каково взаимодействие между микроглией и другими типами клеток. Микроглия выделяет несколько цитокинов, которые влияют на развитие нейронов и синапсов, но механистическая основа их эффектов этих цитокинов в нейронах в значительной степени неизвестна19,20. Чтобы получить более полное представление о функции микроглии в человеческом мозге, крайне важно изучить ее взаимодействие с различными типами клеток, обнаруженных в человеческом мозге. В этом отчете описывается метод совместного культивирования человеческих нейронов, полученных из iPSC, и микроглии, полученных от одного и того же человека. Создание этой методологии позволит проводить четко определенные исследования для изучения природы микроглии и нейрональных взаимодействий и разработки надежных клеточных моделей in vitro для изучения нейроиммунной дисфункции в контексте различных нейроразвивающихся и нейропсихиатрических расстройств.

Роль микроглии при шизофрении
Синаптическая обрезка является основным процессом развития нервной системы, который происходит в мозге подростка21,22. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что синаптическая обрезка в этот критический период является ненормальной при шизофрении (ЗКН)23,24,25,26. ЗКН – это хроническое, изнурительное психическое расстройство, характеризующееся галлюцинациями, бредом, расстройством мыслительных процессов и когнитивным дефицитом23,24. Микроглии, резидентные макрофаги в головном мозге, играют центральную роль в синаптической обрезке25,26. Посмертные исследования и исследования позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) свидетельствуют о дисфункциональной активности микроглии при ЗКН 25,26,27,28,29,30,31,32. Посмертные ЗКН мозга демонстрируют хорошо воспроизводимые, но тонкие различия в мозге - пирамидальные нейроны в корковом слое III демонстрируют снижение плотности дендритных шипиков и меньшее количество синапсов 33,34,35. Синаптическая обрезка – это процесс, при котором излишние возбуждающие синаптические связи устраняются микроглией в подростковом возрасте, когда у пациентов с ЗКС обычно происходит первый психотическийсрыв. Посмертные исследования показывают связь между ЗКН и активацией микроглии, с увеличением плотности микроглии в мозге с ЗКН, а также с увеличением экспрессии провоспалительных генов27. Кроме того, ПЭТ-исследования человеческого мозга с использованием радиолигандов для активации микроглии показывают повышенный уровень активированной микроглии в кореголовного мозга 25,26,27,28. Недавние исследования полногеномных ассоциаций (GWAS) показывают, что самая сильная генетическая ассоциация для SCZ находится в локусе главного комплекса гистосовместимости (MHC), и эта ассоциация является результатом аллелей генов компонента комплемента 4 (C4), которые участвуют в опосредовании постнатального синаптического обрезания у грызунов. Эта связь обеспечила дополнительную поддержку гипотезы о том, что аберрантная обрезка микроглией может привести к снижению плотности дендритных шипиков, наблюдаемой в посмертном мозге при ЗКН. Исследования вовлечения микроглии в синаптическую обрезку при ЗКН до сих пор ограничивались косвенными исследованиями с помощью ПЭТ-визуализации или выводами из исследований посмертного мозга.

Генерация микроглии человека в лаборатории
Культивируемая первичная мышиная микроглия часто использовалась для изучения микроглии, хотя есть несколько указаний на то, что микроглия грызунов может не быть репрезентативной для анатомии микроглии человека и экспрессии генов (Таблица 1). В нескольких исследованиях также дифференцировалась микроглия непосредственно от моноцитов крови посредством трансдифференцировки 39,40,41,42. Микроглии, подобные клеткам, происходящим из моноцитов крови, демонстрируют значительные отличия от микроглии человека в провоспалительных реакциях профиля экспрессии генов и белков, и они, по-видимому, более похожи на макрофаги в своей биологии. Последние методологические достижения в настоящее время позволяют создавать микроглии из человеческих ИПСК , что дает возможность изучать живую микроглию, которая более точно напоминает биологию микроглии, обнаруженной в человеческом мозге (Таблица 2). Было показано, что эти микроглиальные клетки, полученные из iPSC, повторяют фенотип, профили экспрессии генов и функциональные свойства первичной микроглии человека 44,45,46,47,48. В данной статье представлен метод совместного культивирования человеческих нейронов, полученных из iPSC, и микроглии, сгенерированной одним и тем же индивидуумом, с целью разработки персонализированных моделей взаимодействия нейронов и микроглии in vitro. Для этой модели ко-культуры in vitro был адаптирован протокол микроглиальной дифференцировки из группы Фоссати (Таблица 3) и объединен с адаптированной версией протокола генерации корковых нейронов из группы Ливси (Таблица 4)49,50.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Человеческие ИПСК человека, использованные в этом исследовании, были перепрограммированы из фибробластов, полученных по информированному согласию здоровых контрольных субъектов, с одобрения институционального наблюдательного совета (IRB). Перепрограммирование и характеристика ИПССК, использованных в этом исследовании (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292), были описаны в предыдущем исследовании51.

1. Обслуживание ИПСК

  1. Приготовьте разведение матрицы базальной мембраны с пониженным фактором роста без LDEV в DMEM/F12 без фенолового красного и предварительно покройте 6-луночный планшет 1 мл разбавленного раствора в течение не менее 2 ч при 37 °C до размораживания клеточных запасов.
  2. Разморозьте криоконсервированные запасы iPSC на водяной бане при температуре 37 °C в течение 2 минут. Добавьте клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл DMEM/F12. Вращайте ячейки при 300 x g в течение 5 минут.
  3. Удалите раствор покрытия с предварительно покрытой матричной пластины базальной мембраны без LDEV и добавьте 1 мл среды стволовых клеток (SCM) с 10 μМ ингибитором Rock (Y-27632).
  4. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в SCM с 10 мкМ Y-27632 и добавьте в предварительно покрытую пластину для получения конечного объема 2 мл SCM плюс Y-27632. Культуры клеток iPSC выдерживают в этой среде в течение 24 ч в инкубаторе при температуре 37 °C.
  5. Замените среду 2 мл свежего SCM без Y-27632 через 24 ч после оттаивания.
  6. После того как iPSCs достигнут 80-90% конфлюенции, пропустите их на колбы объемом 75 мл, покрытые матрицей базальной мембраны с пониженным фактором роста LDEV.
    1. Пройдите ячейки, предварительно промыв их с помощью HBSS, и удалите после того, как дайте им постоять 30 секунд. Добавьте 1 мл неферментативного реагента для диссоциации клеток и инкубируйте в течение 4 минут при 37 °C. Подготовьте пластину с SCM, содержащей 10 μM Y-27632.
    2. Аспиратируйте реагент для диссоциации неферментативных клеток и добавьте в каждую лунку по 1 мл SCM + 10 μM Y-27632. Аккуратно соскребите лунку с помощью клеточного подъемника и получите ячейки с помощью пипетки объемом 1000 μл.
    3. Депонируйте ячейки на базальную мембрану с пониженным фактором роста LDEV с матричным покрытием 75 мм колбу общим объемом 8 мл SCM + Y-27632.

2. Дифференцировка микроглии

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема, описывающая протокол дифференцировки микроглии, изображена на рисунке 1A. Перед использованием среды подогревают до комнатной температуры.

  1. День 0: Выполните полную замену среды с помощью среды SCM с добавлением BMP-4 80 нг/мл. Выполняйте ежедневную смену среды этим же средством в течение 1-3 дней, не промывая ее между сменами.
  2. День 4: Приготовьте среду для Дня 4-5: Гемопоэтическая среда (ТМ) с добавлением 25 нг/мл FGF, 100 нг/мл SCF и 80 нг/мл VEGF. Удалите среду и замените ее средой на 4-5-й день, содержащей 5 мкМ Y-27632.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент клетки начинают плавать - около половины клеток плавают, а половина прилипает.
  3. День 6: Приготовьте среду для дня 6-13: HM с добавлением 50 нг/мл SCF, 50 нг/мл IL-3, 5 нг/мл TPO, 50 нг/мл m-CSF и 50 нг/мл Flt3-L. Соберите надосадочную жидкость, добавьте в коническую пробирку объемом 15 мл и уменьшите в течение 8 минут при 300 x g. Повторно суспендируйте гранулу в колбе с 8 мл среды на 6-13 день с добавлением 5 мкМ Y-27632.
  4. День 10: Добавьте 8 мл среды на 6-13 день поверх имеющейся среды.
  5. День 14: Приготовьте среду для Дня 14+: HM с добавлением 50 нг/мл m-CSF, 50 нг/мл Flt3-L, 50 нг/мл GM-CSF. Соберите надосадочную жидкость, добавьте в коническую пробирку объемом 50 мл и вращайте в течение 8 минут при 300 x g. Ресуспендируйте гранулу в 8 мл среды Day 14+, содержащей 5 мкМ Y-27632, и продолжайте культивировать в этой среде.
  6. День 18: Добавьте 8 мл Day14+ medium.
  7. День 22: Добавьте 8 мл свежей среды Day14+, не удаляя существующую среду.
  8. День 25: Переместите клетки на шаг 2.9 или продолжайте поддерживать в среднем уровне День 14+ до 50-го дня дифференцировки.
  9. После 25-го дня соберите надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 50 мл и вращайте в течение 8 минут при 300 x g.
    1. Приготовьте адгезивную среду: РПМИ с добавлением 1% 200 мМ дипептида L-аланил-L-глутамина в 0,85% растворе NaCl, 25 нг/мл GM-SCF и 100 нг/мл IL-34.
    2. Ресуспендировать гранулу в адгезивной среде, содержащей 5 мкМ Y-27632.
    3. Пластинчатые клетки с плотностью 50 000 клеток/см2 на 24-луночных планшетах для различных экспериментов: пластины с покрытием базальной мембраны с матричным покрытием без LDEV для монокультуры микроглии, поли-L-орнитин 10 мкг/мл и стеклянные пластины с ламининовым покрытием 10 мкг/мл для экспериментов с визуализацией.
    4. Разведите поли-L-орнитин и ламинин в DPBS и добавьте 250 мкл/лунку для 24-луночного визуализирующего планшета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки в культуре в настоящее время являются адгезивными по своей природе (Рисунок 1C).
  10. Сохраняйте клетки в культуре не менее 14 дней, с двухнедельными изменениями среды. На 14-й день после адгезии клетки достигли зрелости и могут быть использованы для экспериментов.

3. Дифференцировка корковых нейронов

Примечание: Схема, описывающая протокол дифференцировки корковых нейронов, изображена на рисунке 1G.

  1. День 0:
    1. После того как иПСК сливаются на планшетах с базальной мембраной, покрытой матрицей с пониженным фактором роста LDEV, переключитесь с SCM на смесь среды N2/B27 в соотношении 50/50 с добавлением 10 мкМ SB431542, 1 мкМ дорсоморфина, 100 нМ LDN193189.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда N2 состоит из базальной среды с добавлением 1% добавки N-2, 1% 200 мМ L-аланил-L-глутамина дипептида в 0,85% растворе NaCl, 1% пера/стрептококка. Среда B27 состоит из DMEM/F12 с добавлением 2% добавки B-27, 1% 200 мМ L-аланил-L-глутамина дипептида в 0,85% растворе NaCl, 1% пен/стрептококка.
    2. Меняйте среду с добавлением вышеуказанных добавок ежедневно в течение 7 дней.
  2. День 7:
    1. Предварительно покрыть пластины матрицей базальной мембраны с пониженным фактором роста без LDEV не менее чем на 2 ч.
    2. Проведите ячейки 1:1 на предварительно покрытые пластины. Промойте ячейки 1 мл / лунка HBSS и удалите после того, как оставьте на 30 секунд. Добавьте 1 мл в лунку среды для отслоения клеток (например, Аккутазы) и инкубируйте в течение 4-5 минут при 37 °C. Во время инкубации приготовьте конические пробирки объемом 15 мл с 5 мл DMEM.
    3. Осторожно пипеткой с помощью ферментативного диссоциатора удалите клетки из планшета с помощью пипеттора P1000. Соберите агент ферментативной диссоциации и клеточную смесь в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл DMEM.
    4. Центрифугируйте пробирки в течение 5 минут при 300 x g. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл среды N2/B27, содержащей 10 мкМ Y-27632. Продолжайте ежедневные кормления средой N2/B27 без каких-либо добавок.
  3. День 12: Прохождение клеток 1:1 с использованием методов, описанных в. 3.2.2. Продолжайте ежедневные подкормки средой N2/B27.
  4. День 15/16: Проход клеток 1:2 с использованием методов, описанных в. 3.2.2. Продолжайте ежедневные подкормки средой N2/B27.
  5. День 18/19: Проход клеток 1:3 с использованием методов, описанных в. 3.2.2. Продолжайте ежедневные кормления средой N2/B27 до 25 дня.
  6. День 25: Скармливайте клетки средой N2/B27 с добавлением 10 мкМ DAPT.
  7. День 28: Скармливайте клетки свежей, необработанной средой N2/B27.
  8. День 30: Пассаж клеток с использованием методов, описанных в 3.2, на планшеты для культивирования микроглии и поддержание в среде BrainPhys с добавлением 1% добавки B-27.

4. Кокультуры микроглии/нейронов

  1. Планшет Day 30 корковых нейронов поверх культур микроглии с плотностью 50 000 клеток насм2. Добавьте среду с ламинином 1 мкг/мл для улучшения адгезии клеток.
  2. Поддерживайте культуры в смеси 50% адгезивной среды и 50% среды Brainohys с добавлением 1% добавки B-27. Выполняйте половинную или среднюю смену раз в две недели до начала эксперимента.
  3. Проводите эксперименты после того, как нейроны достигнут 60-го дня.

5. Лечение интерфероном-γ

  1. Приготовьте свежую среду с добавлением 100 нг/мл ИФН-γ. Добавьте среду и дайте ей поинкубироваться в течение 24 часов. Удалите среду и приступайте к экспериментам.

6. Иммуноцитохимия

  1. Зафиксировать клетки в чашке для культивирования 100 мкл 4% параформальдегида при комнатной температуре в течение 20 мин.
  2. Промойте ячейки по 1 мл PBS трижды в течение 5 мин каждая.
  3. Добавьте 1 мл PBST (PBS + 0,1% Triton X) на 10 минут.
  4. Добавьте блокирующий буфер: 1 мл PBS плюс 5% козья сыворотка на 1 час.
  5. Добавить первичное антитело, разведенное в 100 мкл PBS + 1% козью сыворотку - на ночь при 4 °С. Соответствующим образом оптимизируйте все первичные антитела.
  6. Промойте ячейки по 1 мл PBS трижды в течение 5 мин каждая.
  7. Добавить вторичное антитело, разведенное в 100 мкл PBS плюс 1% козью сыворотку - в течение 1 ч при комнатной температуре.

7. Анализ позвоночника

  1. Получение изображений на конфокальном микроскопе с 60-кратным увеличением.
  2. Используйте функцию ImageJ NeuronJ52 для анализа изображений.
  3. Измеряйте длину нейритов, длину позвоночника и количество шипов с помощью NeuronJ.

8. Визуализация кальция

  1. Приготовьте свежую среду с 3 мкМ красителем Fluo-4AM. Сокультуры инкубировать в этой среде в течение 30 мин при 37 °C. Затем промойте клетки PBS, добавьте к клеткам раствор для визуализации живых клеток и приступайте к визуализации.
  2. С помощью конфокального микроскопа, предназначенного для визуализации живых клеток, можно получить покадровые изображения с 40-кратным увеличением в течение 2 минут. Активность может быть зарегистрирована на исходном уровне, при воздействии 15 мМ глутамата, или в условиях деполяризации при 5 мМ хлорида калия.
  3. С помощью ImageJ можно измерить интенсивность флуоресценции отдельных клеточных тел с течением времени. С помощью инструмента выделения выберите отдельную область интереса (ROI), окружающую каждое тело клетки. Откройте Менеджер ROI и нажмите Добавить , чтобы выбрать. Продолжайте добавлять новые варианты в менеджер ROI.
  4. Используйте инструмент Задать измерения для измерения среднего серого пространства. Когда количество нужных тел ячеек будет добавлено в менеджер ROI, выберите их все, а затем используйте инструмент « Мультимера ». Это обеспечит считывание среднего значения серой зоны для каждого из них на протяжении всего видеофайла. Экспортированные данные дадут среднюю интенсивность флуоресценции для интересующей области для каждого кадра.
  5. Определите отношение интенсивности флуоресценции, F/F0, где F — интенсивность флуоресценции в данный момент времени, а F0 — начальная интенсивность флуоресценции. F/F0 может быть построен на графике во времени для изучения спонтанной активности в нейронах или исследован при максимальной интенсивности флуоресценции в условиях стимуляции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Валидация протокола
Микроглия, полученная из iPSC, была получена из семи линий iPSC в течение трех различных раундов дифференцировки. Использовались контрольные линии iPSC ML27, ML56, ML292 и ML364 и линии iPSC при шизофрении ML40, ML141 и ML250. Характеристика этих линий iPSC была описана ранее51. Эти микроглии, полученные из iPSC, были валидированы с помощью ICC и qPCR. Микроглия, полученная по адаптированному протоколу, демонстрировала типичную разветвленную морфологию микро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Разработка методов дифференцировки по различным траекториям для плюрипотентных стволовых клеток открыла множество возможностей для исследования функций мозга и патологических процессов 53,54,55. Первоначальные исследования были сосредоточены на развитии конкретных типов нейронных клеток, которые, как предполагается, играют важную роль при специфических расстройствах мозга...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана премией Национального института психического здоровья за биоповеденческие исследования для инновационных новых ученых (BRAINS) R01MH113858 года (для Р.К.), премией Национального института психического здоровья за развитие клинических ученых K08MH086846 года (для Р.К.), премией Благотворительного фонда Дорис Дьюк за развитие клинических ученых (для Р.К.), Фондом Райана Лихта Санга по биполярному расстройству (для Р.К.), Семейный фонд Жанны Мари Ли-Остерхаус и премия NARSAD Young Investigator Award от Фонда исследований мозга и поведения (для А.К.), Фонда Филлис и Джерома Лайлов Раппапорт (для Р.К.), Гарвардского института стволовых клеток (для Р.К.) и Стива Уиллиса и Элиссы Фрейд (для Р.К.). Мы хотели бы поблагодарить доктора Брюса М. Коэна и доктора Донну Макфай из Гарвардской медицинской школы и больницы Маклин за предоставленные нам фибробласты, использованные в исследовании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АккутазаСигма-ОлдричA6964
В-27 добавкаGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Cell Technologies5790
CD11C антителаBiolegend337207разведение 1:200
Costar Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning07-200-83
Ctip2 антителоAbcamab18465
CUTL1 моноклональное антителоAbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, без фенола красныйGibco21041025
дорсоморфинSigma-AldrichP5499
DPBS, без кальция, без магнияGibco14190144
модифицированная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask Cell Culture Flask,Nunc156499
Fisherbrand Cell LiftersFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigandPeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 млThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
Goat Anti Chicken- IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution 1:1000
Goat Anti mouse- IgG H& L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004Dilution 1:1000
Goat Anti Rat- IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670Dilution 1:1000
Козья анти-морская свинка IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678Dilution 1:1000
GoatSerum Sigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
IBA1 антителоAbcamab5076Dilution 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart SYBR Зеленые праймерыSigma-AldrichKSPQ12012
LamininSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
Раствор для визуализации живых клетокInvitrogenA14291DJ
MAP2 антителаSynaptic Systems188 004
M-CSFPeprotech300-25
Добавка N-2Gibco17502001
Нейробазальная средаLife Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MediumBiological Industries01-0005
Антитело P2RY12Biolegend848002
Параформальдегид 16%Fisher Scientific50-980-488
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122
поли-L-ортининSigma-AldrichP3655
SATB2 антителоAbcamab51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24-луночная стеклянная нижняя пластинаGreiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
TMEM119 антителоAbcamab185333Разведение 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Y-27632 дигидрохлорид (ингибитор ROCK)Tocris1254

Ссылки

  1. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and beyond: Innate immune cells as regulators of brain development and behavioral function. Frontiers in Immunology. 9, 698(2018).
  2. Hoshiko, M., Arnoux, I., Avignone, E., Yamamoto, N., Audinat, E. Deficiency of the microglial receptor CX3CR1 impairs postnatal functional development of thalamocortical synapses in the barrel cortex. Journal of Neuroscience. 32 (43), 15106-15111 (2012).
  3. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  4. Hagemeyer, N., et al. Microglia contribute to normal myelinogenesis and to oligodendrocyte progenitor maintenance during adulthood. Acta Neuropathologica. 134 (3), 441-458 (2017).
  5. Lenz, K. M., Nugent, B. M., Haliyur, R., McCarthy, M. M. Microglia are essential to masculinization of brain and behavior. Journal of Neuroscience. 33 (7), 2761-2772 (2013).
  6. Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7 (1), 1-12 (2016).
  7. Pont-Lezica, L., et al. Microglia shape corpus callosum axon tract fasciculation: Functional impact of prenatal inflammation. European Journal of Neuroscience. 39 (10), 1551-1557 (2014).
  8. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  9. Hornik, T. C., Vilalta, A., Brown, G. C. Activated microglia cause reversible apoptosis of pheochromocytoma cells, inducing their cell death by phagocytosis. Journal of Cell Science. 129 (1), 65-79 (2016).
  10. Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
  11. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7 (4), 483-495 (2010).
  12. Schafer, D. P., et al. Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression. Elife. 5, 15224(2016).
  13. Vainchtein, I. D., et al. Astrocyte-derived interleukin-33 promotes microglial synapse engulfment and neural circuit development. Science. 359 (6381), 1269-1273 (2018).
  14. Datwani, A., et al. Classical MHCI molecules regulate retinogeniculate refinement and limit ocular dominance plasticity. Neuron. 64 (4), 463-470 (2009).
  15. Färber, K., et al. C1q, the recognition subcomponent of the classical pathway of complement, drives microglial activation. Journal of Neuroscience Research. 87 (3), 644-652 (2009).
  16. Wlodarczyk, A., et al. A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain. The EMBO Journal. 36 (22), 3292-3308 (2017).
  17. Lim, S. -H., et al. Neuronal synapse formation induced by microglia and interleukin 10. PloS One. 8 (11), 81218(2013).
  18. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  19. Shin, W. H., et al. Microglia expressing interleukin-13 undergo cell death and contribute to neuronal survival in vivo. Glia. 46 (2), 142-152 (2004).
  20. Giulian, D., Li, J., Leara, B., Keenen, C. Phagocytic microglia release cytokines and cytotoxins that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture. Neurochemistry International. 25 (3), 227-233 (1994).
  21. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  22. Giedd, J. N., et al. Brain development during childhood and adolescence: A longitudinal MRI study. Nature Neuroscience. 2 (10), 861-863 (1999).
  23. Lewis, D. A., Lieberman, J. A. Catching up on schizophrenia: Natural history and neurobiology. Neuron. 28 (2), 325-334 (2000).
  24. Jablensky, A. Epidemiology of schizophrenia: The global burden of disease and disability. European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience. 250 (6), 274-285 (2000).
  25. Van Berckel, B. N., et al. Microglia activation in recent-onset schizophrenia: A quantitative (R)-[11C] PK11195 positron emission tomography study. Biological Psychiatry. 64 (9), 820-822 (2008).
  26. Doorduin, J., et al. Neuroinflammation in schizophrenia-related psychosis: a PET study. Journal of Nuclear Medicine. 50 (11), 1801-1807 (2009).
  27. Van Kesteren, C., et al. Immune involvement in the pathogenesis of schizophrenia: a meta-analysis on postmortem brain studies. Translational Psychiatry. 7 (3), 1075(2017).
  28. Bloomfield, P. S., et al. Microglial activity in people at ultra high risk of psychosis and in schizophrenia: An [11C] PBR28 PET brain imaging study. American Journal of Psychiatry. 173 (1), 44-52 (2016).
  29. Fillman, S., et al. Increased inflammatory markers identified in the dorsolateral prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Molecular Psychiatry. 18 (2), 206-214 (2013).
  30. Radewicz, K., Garey, L. J., Gentleman, S. M., Reynolds, R. Increase in HLA-DR immunoreactive microglia in frontal and temporal cortex of chronic schizophrenics. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 59 (2), 137-150 (2000).
  31. Steiner, J., et al. Distribution of HLA-DR-positive microglia in schizophrenia reflects impaired cerebral lateralization. Acta Neuropathologica. 112 (3), 305-316 (2006).
  32. De Picker, L. J., Morrens, M., Chance, S. A., Boche, D. Microglia and brain plasticity in acute psychosis and schizophrenia illness course: a meta-review. Frontiers in Psychiatry. 8, 238(2017).
  33. Garey, L., et al. Reduced dendritic spine density on cerebral cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 65 (4), 446-453 (1998).
  34. Glantz, L. A., Lewis, D. A. Decreased dendritic spine density on prefrontal cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 57 (1), 65-73 (2000).
  35. Konopaske, G. T., Lange, N., Coyle, J. T., Benes, F. M. Prefrontal cortical dendritic spine pathology in schizophrenia and bipolar disorder. JAMA Psychiatry. 71 (12), 1323-1331 (2014).
  36. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  37. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  38. Landry, R. P., Jacobs, V. L., Romero-Sandoval, E. A., DeLeo, J. A. Propentofylline, a CNS glial modulator does not decrease pain in post-herpetic neuralgia patients: In vitro evidence for differential responses in human and rodent microglia and macrophages. Experimental Neurology. 234 (2), 340-350 (2012).
  39. Sievers, J., Parwaresch, R., Wottge, H. U. Blood monocytes and spleen macrophages differentiate into microglia-like cells on monolayers of astrocytes: morphology. Glia. 12 (4), 245-258 (1994).
  40. Simard, A. R., Rivest, S. Bone marrow stem cells have the ability to populate the entire central nervous system into fully differentiated parenchymal microglia. The FASEB Journal. 18 (9), 998-1000 (2004).
  41. Asheuer, M., et al. Human CD34+ cells differentiate into microglia and express recombinant therapeutic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (10), 3557-3562 (2004).
  42. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: Dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Scientific Reports. 4 (1), 1-7 (2014).
  43. Melief, J., et al. Characterizing primary human microglia: A comparative study with myeloid subsets and culture models: Characterizing primary human microglia. Glia. 64 (11), 1857-1868 (2016).
  44. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  45. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  46. Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  47. Pocock, J. M., Piers, T. M. Modelling microglial function with induced pluripotent stem cells: an update. Nature Reviews Neuroscience. 19 (8), 445-452 (2018).
  48. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  49. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  50. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  51. Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  52. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry Part A: The journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  53. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  54. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neurosciences. 73, 1(2016).
  55. Karmacharya, R., Kieling, C., Mondelli, V. Integrating stem cell-based experiments in clinical research. European Psychiatry. 63 (1), (2020).
  56. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9 (1), 1-13 (2019).
  57. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18 (5), 471-479 (2017).
  58. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 1-16 (2020).
  59. Kathuria, A., Lopez-Lengowski, K., Watmuff, B., Karmacharya, R. Comparative transcriptomic analysis of cerebral organoids and cortical neuron cultures derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 29 (21), 1370-1381 (2020).
  60. Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem Cells. Journal of Visualized Experiments: Jove. (165), e61629(2020).
  61. Pong, S., Karmacharya, R., Sofman, M., Bishop, J. R., Lizano, P. The Role of Brain Microvascular Endothelial Cell and Blood-Brain Barrier Dysfunction in Schizophrenia. Complex Psychiatry. 6 (1-2), 30-46 (2020).
  62. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  63. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-Culture of Neurons and Microglia. Current Protocols in Toxicology. 74 (1), 11-17 (2017).
  64. Warre-Cornish, K., et al. Interferon-γ signaling in human iPSC-derived neurons recapitulates neurodevelopmental disorder phenotypes. Science Advances. 6 (34), (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи