Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
* These authors contributed equally
Мы подробно описываем протоколы использования органоидов, полученных от пациентов, для скрининга чувствительности терапии со средней пропускной способностью. Тестируемые методы лечения включают химиотерапию, лучевую терапию и химиолучевую терапию. Уровни аденозинтрифосфата используются в качестве функционального считывания.
Модели органоидов, полученных от пациента (PDO), обеспечивают долгосрочную экспансию и поддержание первичных эпителиальных клеток, выращенных в трех измерениях и близком к нативному состоянии. При получении из резецированной или биопсированной опухолевой ткани органоиды тесно повторяют морфологию опухоли in vivo и могут быть использованы для изучения ответа на терапию in vitro. Биобанки опухолевых органоидов отражают огромное разнообразие клинических опухолей и пациентов и, следовательно, имеют большие перспективы для доклинического и клинического применения. В данной работе представлен метод скрининга лекарственных средств со средней пропускной способностью с использованием органоидов плоскоклеточного рака головы и шеи и колоректальной аденокарциномы. Этот подход может быть легко принят для использования с любой моделью органоида, полученного из ткани, как нормальной, так и больной. Описаны методы воздействия на органоиды in vitro в результате химио- и лучевой терапии (либо в виде монотерапии, либо в комбинации). Выживаемость клеток после 5 дней воздействия препарата оценивается путем измерения уровня аденозинтрифосфата (АТФ). Чувствительность к лекарственным препаратам измеряется показателями полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50), площади под кривой (AUC) и темпа роста (GR). Эти параметры могут дать представление о том, считается ли органоидная культура чувствительной или устойчивой к определенному лечению.
Модели органоидов, созданные из взрослых стволовых клеток и выращенные в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе (ECM) и специфическом коктейле факторов роста (также известном как органоиды HUB), набирают обороты в качестве платформ для доклинического онкологического скрининга. Культура органоидов, полученных от пациента (PDO), может быть получена из биопсии нормальной и больной ткани в течение 1-2 недель и может быть расширена как минимум на 1-2 месяца до неограниченных промежутков времени. Криоконсервация позволяет в течение длительного времени использовать хорошо охарактеризованные культуры. В отличие от традиционных двумерных моделе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием этого протокола, пожалуйста, убедитесь, что вы соблюдаете рекомендации комитета по этике исследований на людях учреждения. Сбор тканей пациента и данных, описанных в этом протоколе, был выполнен в соответствии с рекомендациями EUREC и в соответствии с европейским, национальным и местным законодательством. Все органоиды были получены от пациентов, давших согласие, и согласие может быть отозвано в любое время.
1. Перед скринингом
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Целью данного эксперимента было изучение чувствительности органоидов HNSCC к химиотерапии и лучевой терапии в качестве отдельных агентов. Мы также проверили воспроизводимость результатов, выполнив эксперимент несколько раз с интервалом в неделю, в результате чего было получено несколько биологических повторений (эксперименты 1-3) (рис. 2). В соответствии с протоколом, в день 0 HNSCC PDO были собраны из 6 лунок 6-луночного планшета и ферментативно и механически срезаны до отдельных клеток (ил.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В этой статье и видео описывается, как проводить скрининг лекарств со средней пропускной способностью с использованием PDO. Этот протокол, при оптимизации, может быть принят для скрининга органоидов, полученных из различных типов тканей, описанных здесь. Определение идеального времени пассажа перед скринингом важно, поскольку оно будет варьироваться для отдельных органоидных культур и зависеть от типа ткани. Плотность и размер органоидов, засеянных в лунку, являются важным фактором для о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
MP и QXL являются штатными сотрудниками Crown Bioscience. RO и SB являются штатными сотрудниками Hubrecht Organoid Technology (HUB). НС является изобретателем нескольких патентов, связанных с технологией органоидов; Его полное раскрытие приведено в https://www.uu.nl/staff/JCClevers/. ED является изобретателем патента, относящегося к технологии органоидов HN. HC является основателем компании OrganoidZ, которая использует органоиды для разработки лекарств.
Мы благодарим Аннемари Буйс, Сяоси Сюй и Федерику Паризи за дискуссии и ценный вклад, а также Ингрид Бутс и Марьолейн Гросс за техническую помощь.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильное>Требуется оборудование | |||
| 384-луночный биолюминесцентный считыватель; например, считыватель пластин Tecan Spark 10M | Tecan | ||
| Brightfield с большим полем зрения линзой (2,5x)Цифровой | |||
| дозатор; например, Tecan D300e | Tecan | Drug dispensing | |
| 6 МВ фотонный пучок | Elekta модель Synergy, Elekta Sweden | ||
| Liquid Handler с большой насадкой (" стандартная трубка») Кассеты; | |||
| Например, Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | ||
| Пластиковый контейнер с держателем пластины вставка для лучевой терапии | Самодельный | ||
| редактор метода контроля искры Стандартное | |||
| оборудование для культивирования тканей (шкаф LAF, инкубатор, центрифуга, водяная баня и т.д.) | |||
| <прочные>Требуемые материалы | |||
| 1,5 мл пластиковые пробирки | |||
| 15- и 50-мл пластиковые пробирки | |||
| 5, 10- и 25-мл стерильные пластиковые пипетки | |||
| 6-луночные клеточные культуральные планшеты | |||
| черные 384-луночные сверхнизкоадгезионные планшеты с прозрачным дном; например. Corning 384 плоский черный | Corning | 4588 | |
| Breathe-Easy уплотнительная мембрана | Merck | предварительно нарезанная полиуретановая медицинская мембрана с акриловым клеем | |
| Glasstic slide | 10-камерная горка с сеткой гемоцитометра | ||
| Multidrop Combi Дозатор реагентов стандартная трубка дозатор кассета | Thermo Scientific | ||
| Plugged Pasteur' с пипеткой, наконечник которой был затянут в пламени | |||
| Реверсивный 20/40/70/100 & микро; m фильтры: PluriStrainer | Pluriselect | например, 43-50020-03 | |
| Sterile P1000, P200, P20 и P2 наконечники для пипеток и фильтрующие наконечники с низким удержанием (например, сапфировые наконечники) | Greiner | 750266 | |
| T8 Plus и D4 Plus casettes | HP/Tecan | ||
| Required reagents | |||
| 100 x Glutamax | L-glutamine | ||
| заменитель 1 M HEPES | |||
| 30% (v/v) Tween-20 разбавленный в PBS | |||
| 70% EtOH | |||
| Advanced-DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634-010 | |
| CellTiter-Glo 3D анализ жизнеспособности клеток | Promega | G9681 | |
| Соединения для тестового скрининга, включая Staurosporin или другой положительный контроль | |||
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMSO | |||
| ECM для CRC: пониженный фактор роста Matrigel, не содержащий фенола | Corning | 356231 | |
| ECM для HNSCC PDOs: BME, экстракт базальной мембраны Cultrex RGF, тип R1 | R& D Systems | 3433-005-R1 | |
| Расширяющая среда роста (специфичная для каждого типа органоидов) | |||
| Факторы роста органоидов (специфичные для каждого типа органоидов) | |||
| PBS | |||
| Pen/Strepping (100 Ед/мл) | |||
| Ингибитор ROCK: Y-27632 | Abmole | M1817 | |
| TrypLE | |||
| Required Программные пакеты: | |||
| GraphPad Prism | |||
| Microsoft Excel |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно